CN104927392A - 一种近红外方酸染料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种近红外方酸染料及其制备方法和应用，其制备方法包括以下步骤：（1）将苯胺衍生物和方酸混合，溶于适当的溶剂，N₂保护下减压回流分水数小时；（2）冷却至室温，减压除去溶剂，得粗产品；（3）经硅胶柱层析纯化，得近红外方酸染料产物。该方酸染料稳定性好，光学性能优异，侧链基团可以有效地捕获溶液中的铜离子，引发染料吸收光谱和荧光光谱的改变，故可作为检测铜离子的比色荧光双响应探针。焦磷酸根或α-氨基酸可以夺取染料与铜离子形成的配合物的中心金属，恢复染料的光谱性质，因此该配合物可以作为检测焦磷酸根及α-氨基酸的比色荧光双响应探针。

Description

一种近红外方酸染料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机化学领域，具体涉及一种近红外方酸染料及其制备方法和应用。

背景技术

铜是生物体中重要的微量元素，铜离子具有氧化还原活性，容易得到和失去电子，因此铜离子参与机体的氧化还原过程以及清除自由基（Uauy, R.; Olivares, M.; Gonzalez, M. Essentiality of Copper in Humans. Am. J. Clin. Nutr. 1998, 67, 952S-959S.）。铜离子还是生物中一些重要酶的组分，比如细胞色素C在维持细胞的能量上有重要作用，而另一种赖氨酰氧化酶参与胶原蛋白和弹性蛋白的交联过程，形成结缔组织，赖氨酰氧化酶不仅有助于保持心脏和血管中结缔组织的完整性和弹性，而且在骨形成中也有重要作用（Angelova, M.; Asenova, S.; Nedkova, V.; Koleva-Kolarova, R. Copper in the Human Organism. Trakia J. Sci. 2011, 9, 88-98.）。人体中铜离子过量时，由于其氧化还原活性很高，它会替代别的金属离子参与酶的催化反应，对有机体产生严重的危害，会引发老年痴呆症，帕金森综合症，肌萎缩性脊髓侧索硬化等疾病（Gaggelli, E.; Kozlowski, H.; Valensin, D.; Valebsin, G. Copper Homeostasis and Neurodegenerative Disorders (Alzheimer’s, Prion, and Parkinson’s Diseases and Amyotrophic Lateral Sclerosis). Chem. Rev. 2006, 106, 1995-2044.）。此外，铜导电性能好，化学性质稳定，易于与其他金属制成合金从而被广泛应用于工业，农业，制药等领域，但是铜的广泛应用也带来了环境中铜离子的污染（Belli, S. L.; Zirino, A. Behavior and Calibration of the Copper(II) Ion-Selective Electrode in High Chloride Media and Marine Waters. Anal. Chem. 1993, 65, 2583-2589.），据世界卫生组织建议，成年人每日摄入铜离子不应高于10-12 mg，在正常生理状况下血液中铜离子的浓度不应高于15.7-23.6 μM，因此发展能用于检测生物体和环境中的铜离子具有很重要意义。

目前铜离子检测的方法，据文献报道的主要有原子吸收光谱法（Kabil, M. A.; ElKourashy, A. G.; ElHagrasy, M. A. Flame Atomic Absorption Spectrometric Investigation and Determination of Cobalt and Copper Using Ethanolamine and Triethanolamine as Chemical Modifiers. J. Anal. Atom. Spectrom. 1996, 11, 379-387. Ζemberyová, M.; Barteková, J.; Závadská, M.; Šišoláková, M. Determination of Bioavailable Fractions of Zn, Cu, Ni, Pb and Cd in Soils and Sludges by Atomic Absorption Spectrometry. Talanta 2007, 71, 1661-1668.），电感耦合等离子体原子发射光谱法（Batista, B. L.; Rodrigues, J. L.; Nunes, J. A.; Tormen, L.; Curtius, A. J.; Barbosa, F. Simultaneous Determination of Cd, Cu, Mn, Ni, Pb and Zn in Nail Samples by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS) after Tetramethylammonium Hydroxide Solubilization at Room Temperature: Comparison with ETAAS. Talanta 2008, 76, 575-579.），电化学法（Jena, B. K.; Raj, C. R. Gold Nanoelectrode Ensembles for the Simultaneous Electrochemical Detection of Ultratrace Arsenic, Mercury, and Copper. Anal. Chem. 2008, 80, 4836-4844.）等，但这些方法灵敏度较低，所需仪器昂贵，不适于户外实时检测，因此发展快速，简便的检测方法具有重要意义。荧光法以其灵敏度高，快速，选择性好，操作简单被广泛用于检测铜离子。方酸染料是由方酸与富电子芳基化合物或胺类化合物缩合生成的1,3-二取代衍生物，是一类具有共振稳定的两性离子型结构的染料（Ajayaghosh, A.Chemistry of Squaraine-Derived Materials: Near-IR Dyes, Low Band Gap Systems, and Cation Sensors. Acc. Chem. Res. 2005, 38, 449-459.）。该类化合物的显著特征是在可见光区至近红外光区（620-670 nm）有窄而强的吸收带和较高的量子产率，摩尔吸光系数大于10⁵ L•mol^-1•cm^-1。这种光电特性主要来源于分子内强烈的供体-受体-供体（donor-acceptor-donor）间的电荷迁移作用。由于其兼有优异的荧光发射性能和电化学性能，良好的光学稳定性，易修饰等特点，在新一代化学小分子探针的设计上具有广阔的应用前景。

由于铜离子是顺磁性离子，是常见的荧光猝灭剂，大多数铜离子荧光探针都是基于铜离子与探针配位后得到荧光猝灭的信号从而实现对铜离子的识别（Weng, Y.-Q.; Yue, F.; Zhong, Y.-R., Ye, B.-H. A Copper(II) Ion-selective On-Off-Type Fluoroionophore Based on Zinc Porphyrin-Dipyridylamino. Inorg . Chem. 2007, 46, 7749-7755. Suresh, M.; Ghosh, A.; Das, A. A Simple Chemosensor for Hg²⁺ and Cu²⁺ that Works as a Molecular Keypad Lock. Chem. Commun. 2008, 3906-3908.）。通常，氮原子、氧原子与铜离子有比较好的结合力，我们将含氮原子和氧原子的基团修饰到方酸中，合成了能识别铜离子的方酸染料比色/荧光探针，在体系中加入各种金属离子，只有铜离子能导致染料的荧光猝灭且溶液颜色由蓝色变成无色，实现对铜离子的特异性检测。

阴离子广泛存在于生物体内和周围环境中，在生命科学、环境科学、药物领域和化学过程等方面起着非常重要的作用。焦磷酸根（pyrophosphate，PPi）是一种具有重要生物功能的阴离子, 参与生物体中诸多能量转化和新陈代谢过程，其检测具有重要的生物医学意义（徐勤超, 金灿, 朱雪慧, 邢国文. 基于有机小分子的焦磷酸根荧光探针研究进展. 有机化学 2014, 34, 647-661.）。由于PPi可以和铜离子形成稳定的复合物，可以将染料与铜离子形成的配合物中的中心金属交换出来，释放出荧光染料，恢复染料的吸收光谱与荧光发射，从而获得荧光和比色双响应的焦磷酸根探针。

α-氨基酸广泛地存在于生物体内，是构成生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，也是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，是维持生命活动的重要物质基础，其检测也具有重要的生物医学意义（暴海霞, 戴新华. 氨基酸检测方法的进展和现状. 化学试剂 2013, 35, 577-584.）。由于α-氨基酸可以和铜离子形成稳定的螯合物，可以将染料与铜离子形成的配合物中的中心金属交换出来，释放出荧光染料，恢复染料的吸收光谱与荧光发射，从而获得荧光和比色双响应的α-氨基酸探针。

发明内容

本发明的目的在于提供一种近红外方酸染料及其制备方法和应用，该方酸染料稳定性好，光学性能优异，通过引入含有氮原子和氧原子的离子穴，实现对铜离子的特异性响应，获得一个性能优异的铜离子比色荧光双响应探针。利用焦磷酸根或α-氨基酸可以夺取染料与铜离子形成的配合物的中心金属，恢复染料的光谱性质，将该配合物用作检测焦磷酸根及α-氨基酸的比色荧光双响应探针。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种近红外方酸染料的结构式如下：

。

制备方法包括以下步骤：

（1）将苯胺衍生物和方酸混合，溶于溶剂， N₂保护下减压回流分水；

（2）冷却至室温，减压除去溶剂，得粗产品；

（3）经硅胶柱层析纯化，得到所述的近红外方酸染料。

步骤（1）中溶剂为正庚醇，减压至76 mmHg，反应温度为135℃，回流时间为10小时；步骤（3）中硅胶柱层析所用的洗脱剂为体积比为5:1的二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液。

所述的苯胺衍生物的合成方法包括如下步骤：

（1）将与碳酸钾、2-氯乙醇、催化剂碘化钾混合，溶于溶剂，加热回流反应；

（2）冷却至室温，倒入盛有冰水的烧杯中，用二氯甲烷萃取，有机相用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩除去溶剂得粗产物；

（3）经硅胶柱层析纯化，得到所述的苯胺衍生物。

步骤（1）中溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺，回流温度100℃，反应时间24小时；步骤（3）中硅胶柱层析所用的洗脱剂为体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液。

所述的的合成方法包括如下步骤：

（1）将间氨基苯酚、碳酸钠和正溴丁烷溶于溶剂，加热回流反应；

（2）冷却至室温，静置分层，有机相经干燥后，除去溶剂得粗产物；

（3）经硅胶柱层析纯化，得到。

步骤（1）中溶剂为体积比为1:1的异丙醇和水的混合溶剂，回流反应时间24小时；步骤（3）中硅胶柱层析所用的洗脱剂为体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液。

所述的近红外方酸染料作为荧光和比色双响应的铜离子探针。

与铜离子形成的配合物用作荧光和比色双响应的焦磷酸根探针。

与铜离子形成的配合物用作荧光和比色双响应的α-氨基酸探针。

本发明通过向苯胺侧链的氮接入正丁基，可以调节染料的溶解性能和聚集行为，从而影响染料的光物理性质。通过氧醚链的引入，可以改善它们在水中的溶解性，同时氧醚结构与苯胺上的氮原子结合可用于铜离子的捕获，成为与铜离子有特异响应的比色荧光双响应探针。进而利用焦磷酸根（PPi）和α-氨基酸与铜离子形成稳定的复合物，夺取染料与铜离子形成的配合物的中心金属，恢复染料的光谱性质，将该配合物用作检测焦磷酸根及α-氨基酸的比色荧光双响应探针。

本发明涉及的近红外方酸染料具有如下特征：染料的最大吸收位于645-656 nm，具有很高的摩尔吸光系数和荧光量子产率。在非质子溶剂中，随着极性的增强，染料最大吸收波长发生红移，在极性较大的DMSO溶剂中，其最大吸收波长比在极性较小的氯仿溶剂中红移了11 nm。随着溶剂极性的变化，染料吸收强度变化很小，证明溶剂极性对染料的摩尔吸光系数的影响较小。

不同比例的乙腈/水溶液中，染料的吸收强度会随含水量增加而逐渐降低。当体系中含水量增加至60%时，染料吸收光谱仅有微小变化。当含水量增加至70％时，646 nm处的单体吸收峰明显降低，575 nm左右处出现了聚集态的吸收峰，在725 nm左右处也出现小的肩峰。随着乙腈/水混合溶剂中含水量的继续增加，单体的吸收峰强度降低，聚集态吸收峰强度增强。这表明了，相比其它方酸染料，所述的方酸染料的水溶性和抗聚集能力得到了显著提高。

本发明的显著优点在于：该类方酸染料荧光探针稳定性好，光学性能优异，通过氧醚链的引入，可以改善它们在水中的溶解性，而且氧醚链与苯胺上氮原子构成的离子穴可用于铜离子的捕获，可用于离子响应的荧光探针，并进一步应用于焦磷酸根（PPi）和α-氨基酸的检测。

附图说明

图1是浓度为2.5 μM的方酸染料在不同有机溶剂中的吸收光谱图；

图2是浓度为2.5 μM的方酸染料在不同比例的乙腈/水的吸收光谱变化图；

图3是浓度为2.5 μM的方酸染料在乙腈中对金属离子的吸收光谱响应；

图4是浓度为2.5 μM的方酸染料在乙腈中对金属离子的荧光光谱响应；

图5 是浓度为2.5 μM的方酸染料在乙腈/水（90:10, v/v）溶液中对铜离子的吸收光谱滴定图；

图6是浓度为2.5 μM的方酸染料在乙腈/水（90:10, v/v）溶液中对铜离子的荧光光谱滴定图，插图：检测体系在670 nm处的荧光强度随铜离子浓度变化的趋势图（λex = 620 nm, PMT = 600 V, slit = 5 nm/5 nm）；

图7是浓度为2.5 μM的方酸染料与铜离子（25 μM）的络合物在乙腈/水（90:10, v/v）溶液中对焦磷酸根（PPi）的吸收光谱滴定图，插图: A为方酸染料的照片, B为方酸染料与铜离子配合物的照片, C为加入焦磷酸根（PPi）后的照片；

图8是浓度为2.5 μM的方酸染料与铜离子（25 μM）的络合物在乙腈/水（90:10, v/v）溶液中对焦磷酸根（PPi）的荧光光谱滴定图（λex = 620 nm, PMT = 600 V, slit = 5 nm/5 nm）；

图9是浓度为2.5 μM的方酸染料与铜离子（25 μM）的络合物在乙腈/水（90:10, v/v）溶液在670 nm处的荧光强度随焦磷酸根（PPi）浓度变化的趋势图，插图：焦磷酸根（PPi）浓度为 6.25-13.75 μM的荧光强度变化趋势图 （λex = 620 nm, PMT = 600 V, slit = 5 nm/5 nm）；

图10是浓度为2.5 μM的方酸染料与铜离子（25 μM）的络合物在乙腈溶液中对不同氨基酸（25 μM）的荧光光谱图（λex = 620 nm, PMT = 600 V, slit = 5 nm/5 nm）；

图11是浓度为2.5 μM的方酸染料与铜离子（25 μM）的络合物在乙腈溶液中对组氨酸（His）的荧光光谱滴定图，插图：检测体系在670 nm处的荧光强度随组氨酸（His）浓度变化的趋势图（λex = 620 nm, PMT = 600 V, slit = 5 nm/5 nm）。

具体实施方式

实施例 1

苯胺衍生物的制备：

于50 mL的单口烧瓶中，加入间氨基苯酚（3.3 g，30 mmol），碳酸钠（4.4 g，42 mmol），正溴丁烷（12 g，88 mmol）和30 mL 异丙醇/水（v/v, 1:1）。加料完成后，升温回流反应过夜。TLC监控，反应完全后，冷却至室温，溶液分为两层，取有机相。有机相经干燥后，除去溶剂得棕色油状物。粗产物经硅胶柱层析纯化，用石油醚:乙酸乙酯（10:1, v/v）洗脱，除去溶剂后得到淡紫色液体4.7 g。产率71％。FTIR (KBr): ν_max 3401, 2957, 2932, 2872, 1620, 1579, 1505, 1464, 1368, 1241, 1193, 1144, 1025, 941, 819, 751, 687 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.90 (t, J=7.3 Hz, 6H), 1.24-1.33 (m, 4H), 1.47-1.55 (m, 4H), 3.17 (t, J=7.6 Hz, 4H), 5.34 (s, 1H), 6.09 (d, J=7.9 Hz, 1H), 6.14 (s, 1H), 6.21 (d, J=7.5 Hz, 1H), 6.99 (t, J=8.1 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 13.8, 19.2, 31.0, 68.4, 108.7, 115.5, 121.7, 129.8, 149.2, 159.7.

实施例 2

苯胺衍生物的制备

于50 mL的单口烧瓶中，加入苯胺衍生物（0.44 g，2.0 mmol），碳酸钾（0.43 g，3.1 mmol），2-氯乙醇（1.6 g，20 mmol），催化量碘化钾和10 mL N,N’-二甲基甲酰胺。加料完成后，升温至100℃回流反应过夜。停止反应，冷却至室温，倒入盛有冰水的烧杯中。用二氯甲烷萃取，有机相用水洗涤三次，用饱和食盐水洗涤一次，经无水硫酸镁干燥，除去溶剂得棕色油状物。粗产物经硅胶柱层析纯化，用石油醚:乙酸乙酯（10:1, v/v）洗脱，除去溶剂后得到黄色油状液体86 mg，产率16％。FTIR (KBr): ν_max 3391, 2956, 2931, 2872, 1612, 1572, 1500, 1456, 1368, 1292, 1243, 1198, 1175, 1144, 1080, 1051, 947, 898, 827, 746, 687 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 0.95 (t, J=7.6 Hz, 6H), 1.30-1.39 (m, 4H), 1.52-1.60 (m, 4H), 2.14 (s, 1H), 3.23 (t, J=7.6 Hz, 4H), 3.93 (s, 2H), 4.06 (t, J=4.4 Hz, 2H), 6.18-6.20 (m, 2H), 6.28 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.09 (t, J=8.0 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 14.0, 20.4, 29.5, 50.8, 61.6, 69.0, 98.9, 100.5, 105.5, 129.9, 149.7, 160.0.

实施例 3

所述的近红外方酸染料的制备：

于50 mL的圆底烧瓶中，加入苯胺衍生物（27 mg，0.10 mmol），方酸（5.7 mg，0.050 mmol）和20 mL正庚醇。加料完毕，接上分水器，减压至76 mmHg左右，加热至回流（135℃左右）反应10小时，溶液变为墨绿色；停止加热，冷却至室温，减压除去溶剂正庚醇，得到绿色固体。残留物先经石油醚洗涤多次，后经硅胶柱层析分离，用二氯甲烷:乙酸乙酯（5:1, v/v）洗脱，得到绿色固体 7.3 mg，产率24％。熔点：236-238℃；FTIR (KBr): ν_max 3435, 2929, 1593, 1405, 1384, 1356, 1228, 1172, 1111, 919, 857, 810, 767 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 0.98 (t, J=7.4 Hz, 12H), 1.35-1.44 (m, 8H), 1.60-1.68 (m, 8H), 3.40 (t, J=7.6 Hz, 8H), 4.04 (d, J=4.0 Hz, 4H), 4.10 (d, J=3.6 Hz, 4H), 5.99 (s, 2H), 6.35 (d, J=8.8 Hz, 2H), 8.75(s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 13.9, 20.3, 29.7, 51.3, 60.3, 69.5, 93.6, 106.6, 111.5, 134.0, 155.5, 162.3, 182.5, 187.9; ESI-MS: m/z 609.4 ([M+H]⁺).

所述的染料的最大吸收位于645-656 nm，具有很高的摩尔吸光系数和荧光量子产率。图1为2.5 μM的方酸染料在不同有机溶剂中的吸收光谱图。由谱图可以看出，在非质子溶剂中，随着极性的增强，染料最大吸收波长发生了红移，在极性较大的DMSO溶剂中，其最大吸收波长比在极性较小的氯仿溶剂中红移了11 nm。随着溶剂极性的变化，染料吸收强度变化很小，证明溶剂极性对染料的摩尔吸光系数的影响较小。

方酸染料在水溶液中易发生自聚集，溶剂的极性和溶剂的成分对染料的光谱性质具有很大的影响。水具有较大的介电常数，能有效地减少分子聚集堆积时同种电荷的排斥，有利于染料分子的聚集。聚集会引起染料紫外吸收光谱的变化及荧光的猝灭。在苯胺侧链的氮接入正丁基的基础上，再引入氧醚链，不仅能实现对金属离子的响应，还能提高方酸染料的稳定性，提高其在水溶液中的溶解性。图2为2.5 μM的方酸染料在不同含水量的乙腈溶液中的吸收光谱。由谱图可以看出，当乙腈中的水含量增加至60%，染料吸收光谱仅有微小变化。当含水量增加至70％时，646 nm处的单体吸收峰明显降低，575 nm左右处出现了聚集态的吸收峰，在725 nm左右处也出现小的肩峰。随着乙腈/水混合溶剂中含水量的继续增加，单体的吸收峰强度降低，聚集态吸收峰强度增强。这表明了，相比其它方酸染料，所述的方酸染料的水溶性和抗聚集能力得到了显著提高。

选择性是评价化学传感器性能优异与否的一项指标。在含2.5 μM染料的乙腈溶液中，分别加入10 当量的各种金属离子，体系的吸收光谱和发射光谱发生了不同的变化。当加入10 当量的铜离子后，溶液由浅蓝色变为深蓝色，吸收光谱的最大吸收波长发生了蓝移，吸收峰展宽而且强度降低（图3），体系的荧光完全猝灭（图4）。除了Al³⁺、Fe³⁺和Pb²⁺会引起荧光强度的轻微降低外，其它金属离子均没有引起光谱发生明显的变化。因此，所述方酸染料具有良好的铜离子识别功能。

为了进一步研究所述的方酸染料对铜离子的定量检测，这里研究了对铜离子的吸收光谱和荧光光谱滴定实验。图5 是浓度为2.5 μM的方酸染料在乙腈/水（90:10, v/v）溶液中对铜离子的吸收光谱滴定图。如图5所示，在乙腈/水（90:10, v/v）溶剂体系中，染料在648 nm处具有强而窄的吸收峰，随着铜离子浓度的提高，最大吸收波长648 nm左右的吸收强度逐渐降低，同时吸收峰往短波方向展宽。当铜离子浓度为6当量时，吸收光谱呈最大吸收波长在630 nm的宽峰并达到饱和，铜离子的浓度继续提高，吸收光谱不再发生变化。图6是浓度为2.5 μM的方酸染料在乙腈/水（90:10, v/v）溶液中对铜离子的荧光光谱滴定图。如图6所示，随着溶液中铜离子浓度的提高，染料的荧光强度不断降低，在0-1.6当量浓度区间呈线性降低，在加入0-4当量铜离子时对荧光的猝灭的效果显著，当加入5当量铜离子时候，体系的荧光猝灭程度达到87%，当铜离子的浓度为12当量时荧光降低达到饱和，荧光猝灭至染料单体荧光的9%左右，继续提高铜离子的浓度，荧光强度变化微小。从荧光滴定光谱中选择铜离子浓度在0.2-1.6当量之间的15个点做荧光强度对铜离子浓度的工作曲线，发现体系的荧光强度值与铜离子浓度呈良好的线性关系 (R² = 0.996, k = -2.47×10⁷)。在同样条件下，连续7次扫描样品，得到7个荧光强度值，通过公式计算得标准偏差 (σ) 为0.45。因此，染料对铜离子的检测限可通过公式3σ/k求算得5.5×10^-8 M。

所述的方酸染料在乙腈/水（90:10, v/v）溶剂体系中有强的紫外吸收和荧光发射，信号处于“开”的状态，而当加入10当量的铜离子后，648 nm处的吸收峰减弱，同时其荧光发射也被猝灭，这时染料的信号处于关的状态。此时，利用铜离子易与焦磷酸根（PPi）形成络合物的性质（络合物的稳定常数：8.24×10⁸），可以通过焦磷酸根（PPi）将络合物中的铜离子置换出来，使染料的光谱恢复“开”的状态。

图7是浓度为2.5 μM的方酸染料与铜离子（25 μM）的络合物在乙腈/水（90:10, v/v）溶液中对焦磷酸根（PPi）的吸收光谱滴定图，从该图可以看出，在加入0-4 当量的焦磷酸根离子，对吸收光谱的变化影响不大，在加入5当量的焦磷酸根离子后，最大吸收波长红移至648 nm，继续加入焦磷酸根离子，峰形变得窄而高，与染料自身的紫外吸收光谱越来越接近，同时溶液颜色也由深蓝色恢复蓝绿色，从一定程度上说明焦磷酸根（PPi）与铜离子结合，释放出染料。图8是浓度为2.5 μM的方酸染料与铜离子（25 μM）的络合物在乙腈/水（90:10, v/v）溶液中对焦磷酸根（PPi）的荧光光谱滴定图，该图显示了随着焦磷酸根（PPi）的加入，络合物的荧光不断释放，从而达到检测焦磷酸根（PPi）浓度的目的。图9是浓度为2.5 μM的方酸染料与铜离子（25 μM）的络合物在乙腈/水（90:10, v/v）溶液在670 nm处的荧光强度随焦磷酸根（PPi）浓度变化的趋势图，该图显示了焦磷酸根（PPi）在浓度范围0-40 μM时体系位于670 nm波段的荧光强度值。其插图选取焦磷酸根（PPi）离子滴定浓度区间2.5-5.5 μM，得到的一系列荧光强度值对焦磷酸根（PPi）浓度做工作曲线（R²=0.992, k=1.04×10⁷ au/M）。于相同条件下，连续7次扫描空白样品，得到7个荧光强度值，通过公式计算出标准偏差σ为0.25，根据计算公式3σ/k得出检测限为7.2×10^-8 M。

由于铜离子和多种氨基酸亦可以生成稳定的络合物，根据类似的设计原则，该体系也可以用于氨基酸及一些蛋白的定量分析。图10是浓度为2.5 μM的方酸染料与铜离子（25 μM）的络合物在乙腈溶液中对不同氨基酸（25 μM）的荧光光谱图，该图显示了包括组氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸、半胱氨酸及丝氨酸在内的多种氨基酸和谷胱甘肽及牛血清蛋白均可将染料与铜离子的络合物中的中心铜离子交换出来，释放出染料的荧光，从而实现对上述被检测物的定量检测。图11是浓度为2.5 μM的方酸染料与铜离子（25 μM）的络合物在乙腈溶液中对组氨酸（His）的荧光光谱滴定图。选取组氨酸（His）滴定浓度区间0.25-3.5 μM，得到的一系列荧光强度值对组氨酸浓度做工作曲线（R²=0.997, k=6.16×10⁷ au/M）。于相同条件下，连续7次扫描空白样品，得到7个荧光强度值，通过公式计算出标准偏差σ为0.50，根据计算公式3σ/k得出检测限为2.4×10^-8 M。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种近红外方酸染料，其特征在于：结构式如下：

。

2.一种制备如权利要求1所述的近红外方酸染料的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将苯胺衍生物和方酸混合，溶于溶剂，N₂保护下减压回流分水；

（2）冷却至室温，减压除去溶剂，得粗产品；

（3）经硅胶柱层析纯化，得到所述的近红外方酸染料。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中溶剂为正庚醇，减压至76 mmHg，反应温度为135℃，回流时间为10小时；步骤（3）中硅胶柱层析所用的洗脱剂为体积比为5:1的二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的苯胺衍生物的合成方法包括如下步骤：

（1）将与碳酸钾、2-氯乙醇、催化剂碘化钾混合，溶于溶剂，加热回流反应；

（2）冷却至室温，倒入盛有冰水的烧杯中，用二氯甲烷萃取，有机相用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩除去溶剂得粗产物；

（3）经硅胶柱层析纯化，得到所述的苯胺衍生物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1）中溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺，回流温度100℃，反应时间24小时；步骤（3）中硅胶柱层析所用的洗脱剂为体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的的合成方法包括如下步骤：

（1）将间氨基苯酚、碳酸钠和正溴丁烷溶于溶剂，加热回流反应；

（2）冷却至室温，静置分层，有机相经干燥后，除去溶剂得粗产物；

（3）经硅胶柱层析纯化，得到。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（1）中溶剂为体积比为1:1的异丙醇和水的混合溶剂，回流反应时间24小时；步骤（3）中硅胶柱层析所用的洗脱剂为体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液。

8.一种如权利要求1所述的近红外方酸染料的应用，其特征在于：作为荧光和比色双响应的铜离子探针。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：与铜离子形成的配合物用作荧光和比色双响应的焦磷酸根探针。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：与铜离子形成的配合物用作荧光和比色双响应的α-氨基酸探针。