CN104913983A - 一种安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，包括如下步骤：(1)对照动物模型的选择；(2)样品采集：猪屠宰后，取背最长肌、心脏及肝脏组织；(3)常规肉质指标测定：检测背最长肌肉色、pH值和嫩度；(4)色谱法测定背最长肌IMP含量；(5)索氏抽提法测定背最长肌IMF含量；(6)RT-PCR方法检测IMP和IMF形成过程中关键基因在猪肝脏、心脏和背最长肌的表达水平，并进行数据的统计分析。本发明所述方法操作简便、成本低、检测效果理想。

Description

一种安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法。

背景技术

随生活水平提高、营养观念的转变，人们对猪肉品质的要求越来越高，目前提高猪肉品质成为生猪生产中的首要任务。过去的几十年间，生猪产业迎合市场需求，致力于瘦肉型商品猪的高效生产，使商品猪生长周期越来越短，瘦肉产量也不断增加；但随之而来的是猪肉肉质变劣，猪肉口感下降，比如：粗糙、缺乏肉的风味和香味。这是长期以来片面追求生长速度快和瘦肉率高所致，而在猪肉品质改善、提高以及肉质性状遗传基础等方面缺少关注，这一问题已受到各国学者的广泛关注。

我国地方猪种具有优良的肉质特性，利用地方猪种培育和生产优质风味猪肉是我国近年来生猪生产发展的一个主要方向。在国内的一些大中城市，优质风味猪肉越来越多地受到广大消费者的欢迎。在大中城市超市的货架上，土猪肉即便价格上调20％以上，仍供不应求。因此对我国地方猪种肉质特性进行更深入的研究，可对我国地方猪种肉质特性有更深刻、更全面的认识。

现有相关研究已明确，猪肉质性状数属于数量性状，主要由多种基因控制，随着分子生物学技术的发展，可以筛选出控制肉质性状的候选基因，对肉质性状相关候选基因的研究已成为目前研究热点。相关研究成果可为地方猪种质资源特性和肉质性状研究提供分子生物学参考。也可为我国地方猪种合理开发利用及优质肉猪配套系和新品种培育提供理论依据和技术支撑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种效果理想、成本低、操作简便的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法。

一种安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，包括如下步骤：

(1)对照动物模型的选择：选择安徽地方猪种圩猪、安庆六白猪与外来猪种大白猪为研究肉质品种差异的对照动物模型；

(2)样品采集：猪屠宰后，取背最长肌、心脏及肝脏组织；

(3)常规肉质指标测定：白度色度计测定眼肌肉色、pH计检测背最长肌屠宰存储1小时及24小时后pH值、宰后即用嫩度仪检测背最长肌剪切力；

(4)采用色谱法测定背最长肌样品中IMP含量；

(5)采用索氏抽提法测定背最长肌样品中IMF含量；

(6)采用RT-PCR的方法比较IMP和IMF形成过程中关键基因ADSL、GARS-AIRS-GART和DGAT1、DECR1 mRNA在猪肝脏、心脏和背最长肌组织中的表达水平，并进行数据的统计分析，研究此四种基因在不同猪种和组织中的表达规律及其与各肉质指标的相关性。

本发明所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其中，步骤(1)中所述圩猪为21头10月龄圩猪、所述安庆六白猪为13头10月龄安庆六白猪，所述长白猪为6头6月龄长白猪。

本发明所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其中，步骤(2)中所述样品采集为：21头10月龄圩猪、13头10月龄安庆六白猪及6头6月龄长白猪屠宰后，①取背最长肌组织若干，于4℃保存，用于肉质常规指标及IMF、IMP含量测定；②取背最长肌、肝脏和心脏组织各100g，液氮冷冻，后转移至-80℃冰箱保存，用于基因表达检测。

本发明所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其中，步骤(3)具体包括如下步骤：

肉色的测定：屠宰后立即测量，采用白度色度计测定眼肌肉色，读取L*值、a*值和b*值，其中L*值表示亮度，取值0-100，值越大，亮度越大，L*大于53为灰白肉即异质肉；a*值是度量肌肉从红色到绿色的变化，a值越大肉质越好；b*值是度量肌肉从黄色到蓝色的变化，b值越小肉质越好；根据所测的L*、a*和b*值判断肉色的差别；所述测定眼肌肉色为测定背最长肌在胸腰椎结合处横截切面的肉色；

pH值的测定：屠宰后1小时测量，将pH电极直接插入所取背最长肌样品的中部，深度不小于1cm，将电极头部完全包埋在肉样中，待数值稳定后，读取pH值，精确到0.01；将肉样置于0-4℃冰箱中保存24h后，按照相同方法测pH值，所读取的数值即为pH_24h；

嫩度的测定：屠宰后立即测量，用剪切力表示，在肌肉中心插入温度计，放在保鲜袋中，然后放入温度为72℃的水中蒸煮，当肉中心温度达到70℃时取出，冷却至室温后，将肉样按与肌纤维呈垂直的方向切取宽度为1.5cm的肉块，再用直径为1.27cm圆形的取样器，顺肌纤维方向钻切肉样块，置于嫩度仪中测其剪切力，每个样品做10个重复，记录剪切力值，计算算术平均数，单位用牛顿(N)表示。

本发明所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其中，步骤(4)具体包括如下步骤：

样品前处理：

于屠宰后1.5h内迅速采集背最长肌组织作为猪肉样品，当冷藏时间达到24h时，取出猪肉样品制备肌苷酸测定样，使用绞肉机绞碎所述猪肉样品，准确称取5g，精确到0.0001，置于50ml塑料离心管中，加入20ml 6％高氯酸，用高速组织匀浆机匀浆；匀浆液以8000r/min离心15min，过滤到100ml的三角瓶中，将沉淀物用15ml 6％高氯酸再次匀浆，离心，合并两次上清液，用5.0mol/L和0.5mol/L NaOH调pH至6.5，转移至100ml容量瓶中，定容摇匀，测定前用0.45μm滤膜过滤后用于HPLC分析；

色谱条件：

色谱柱：Agilent 1100dC18柱，5μm，Φ4.6mm×150mm；流动相：50mmol/L pH6.5甲酸铵缓冲溶液，其中含有5％甲醇；流速：1ml/min；柱温：25℃；进样量：5μL；紫外检测波长：254nm；运行时间：标准工作液运行4min，样品提取液运行11min。

本发明所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其中，步骤(6)中ADSL的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，GARS-AIRS-GART的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，DGAT1的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，DECR1的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；荧光定量PCR扩增反应体系为25μL：SYBRPremix Ex TaqTMⅡ 12.5μL，上下游引物各1μL，引物浓度为10μM/mL，cDNA 2μL，ddH₂O高压8.5μL；反应条件为：95℃预变性2min；95℃ 10s，60℃ 45s，72℃延伸15s，收集荧光值，40个循环。

本发明所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其中，数据统计分析包括如下步骤：

基因的表达量分析：用2-ΔΔCt法对有效性数据进行统计学分析，目的基因的相对表达量为2^-ΔΔCT，ΔΔCt表示选择β-actin为内参基因，以对照组目标基因与内标基因的Ct差值平均值做为参照值，x表示任意一样本，公式如下：

ΔΔCt＝(C_{t.Target gene}－C_t.β-actin)_x－(C_{t.Target gene}－C_t.β-actin)_control

上述公式计算了每一个样本目标基因的表达量，通过内参β-actin基因校正后，数据用平均值±标准误，即M±SE表示；采用SPSS19.0软件对实验数据结果进行统计学分析，均值差异显著性用One-way ANOVA程序进行分析比较，数据相关性分析采用Bivariate correlation程序进行分析。

本发明安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法与现有技术不同之处在于：

现有的报道对于安徽地方猪种与外来猪种肉质差异性的比较研究较少，剪切力，肉色，pH值，IMP和IMF均是肉质的重要指标，本发明所述安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法通过对安徽省著名地方猪种安庆六白猪、圩猪与外来猪种长白猪的肉质性状进行对比分析，可有助于深入了解不同品猪种肉质性状差异的原因；ADSL和GARS-AIRS-GART为与肌苷酸含量相关候选基因，DGAT1和DECR1基因是与脂肪沉积相关候选基因，通过对这些基因在不同品种猪和组织中的表达研究，可为进一步研究猪品种间肉质性状差异的分子遗传机制提供基础数据。

本发明方法以安徽地方猪种圩猪、安庆六白猪以及国外瘦肉型猪种长白猪为研究对象，采用相关方法测定三猪种的各项肉质指标，研究分析该3猪种品种间背最长肌肌苷酸和肌内脂肪含量以及相关肉质指标的差异，采用定量PCR法比较ADSL、GARS-AIRS-GART、DGAT1和DECR1基因mRNA在肝脏、心脏和背最长肌组织中的表达水平，探讨此四种基因在不同猪种和组织中的表达规律及其与各肉质指标的相关性，研究结果可为地方猪种合理开发利用及优质肉猪配套系(新品种)培育提供理论依据和技术支撑。

下面结合附图对本发明的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中不同猪种背最长肌肉色差异，注：图中不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；

图2为本发明中不同猪种背最长肌pH值的差异，注：图中不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；

图3为本发明中不同猪种背最长肌剪切力差异，注：图中不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；

图4为本发明中不同猪种背最长肌肌苷酸含量差异，注：图中不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；

图5为本发明中不同猪种背最长肌肌内脂肪含量差异，注：图中不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；

图6为本发明中RNA电泳图；

图7为本发明中cDNA电泳图(β-Actin条带97bp)。

具体实施方式

一、材料与方法

1、试验动物饲养与处理

从安徽省安泰农业开发有限公司圩猪保种场选取待宰商品猪圩猪21头，望江县现代良种养殖有限公司选取安庆六白猪13头，安徽长风农牧科技有限公司选取长白猪6头，按场内各猪种常规饲养标准饲养管理(出栏日期地方猪为10个月，长白猪为6个月)。屠宰前禁喂24h称重，按“瘦肉型猪胴体性状测定技术规范(NY/T825-2004)”方法屠宰。

2、样品采集

屠宰后，取背最长肌若干，测定肉色，剪切力，pH值、肌苷酸含量以及肌内脂肪含量；取心脏、肝脏、背最长肌新鲜组织100mg，液氮冷冻，后转移至-80℃冰箱保存，用于基因定量表达检测。

3、主要试验试剂及仪器

主要的试验仪器

仪器：高速冷冻离心机(Sigma，德国)，PCR仪(伯乐，美国)，紫外分光光度计(岛津，日本)，Rotor-gene 6000荧光定量PCR仪(Corbett，澳大利亚)，SMA1000超微量紫外分光光度计(Merinton，中国)，高效液相色谱仪1100(Aiglent，美国)、ZORBAX色谱柱SB-C18(5μm，4.6*250mm)、自动进样器G1313A(100μl)、四元泵G1311A(Agilent，美国)，圆周振荡器MS3基本型(IKA，德国)，离心机Eppendor FAG22331(Hamburg，德国)，超纯水器原子Ⅱ型(成都康林科技有限公司)，组织匀浆机AM-6(经济制作所，日本)，超声波清洗机KQ-300DE(昆山市超声仪器有限公司)，pH测定仪HI-9025(Hanna，意大利)，白度色度计ADCI-WS1(北京辰泰克仪器有限公司)数显式肌肉嫩度仪C-LM3(北京辰泰克仪器有限公司)，凝胶成像系统(江苏捷达)。

主要的试验试剂

试剂：Trizol Reagent、cDNA反转录试剂盒、Premix TaqTM Version 2.0、Premix ExTaqTMⅡ(大连宝生物)，肌苷酸标准品(HPLC级，Sigma，美国)，高氯酸(GR，含量70％-72％)上海金鹿化工技术有限公司，甲醇、乙腈(Fisher，美国)。焦碳酸二乙酯(DEPC)，琼脂糖，0.5×TBE(上海生工)，DNA maker2000。

主要溶液的配制

1mg/mL肌苷酸标准储备液：称取肌苷酸标准品(Sigma 98.5％)10.150g，加5％的甲醇溶液定容至10mL；

6％高氯酸(PCA)溶液：8.57mL高氯酸(70％-72％)加水定容至1000mL；

50mmoL/L(pH＝6.5)甲酸铵缓冲溶液：称取3.150g甲酸铵于一大烧杯，加500ml超纯水，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调至pH为6.5，定容至1000ml，临用前用0.45μm滤膜真空过滤，置超声水浴脱气20min；现配现用。

4、常规肉质指标测定

肉色的测定：屠宰后立即测量，采用白度色度计测定眼肌肉色，读取L*值、a*值和b*值，其中L*值表示亮度，取值0-100，值越大，亮度越大，L*大于53为灰白肉即异质肉；a*值是度量肌肉从红色到绿色的变化，a值越大肉质越好；b*值是度量肌肉从黄色到蓝色的变化，b值越小肉质越好；根据所测的L*、a*和b*值判断不同肉色的差别；所述测定眼肌肉色为测定胸腰椎结合处背最长肌横截面处的肉色。

pH值的测定：屠宰后1小时测量，将pH电极直接插入所取背最长肌样品的中部，深度不小于1cm，将电极头部完全包埋在肉样中，待数值稳定后，读取pH值，精确到0.01；将肉样置于0-4℃冰箱中保存24h后，按照相同方法测pH值，所读取的数值即为pH_24h；

嫩度的测定：屠宰后立即测量，用剪切力表示，在肌肉中心插入温度计，放在保鲜袋中，然后放入温度为72℃的水中蒸煮，当肉中心温度达到70℃时取出，冷却至室温后，将肉样按与肌纤维呈垂直的方向切取宽度为1.5cm的肉块，再用直径为1.27cm圆形的取样器，顺肌纤维方向钻切肉样块，置于嫩度仪中测其剪切力，每个样品做10个重复，记录剪切力值，计算算术平均数，单位用牛顿(N)表示。

5、IMP含量测定

样品前处理

于屠宰后1.5h内迅速采集背最长肌，当冷藏时间达到24h时，取出肉样制备肌苷酸测定样，使用绞肉机绞碎肌肉样品，准确称取5g(精确到0.0001)，置于50ml塑料离心管中，分别加入20ml 6％高氯酸，用高速组织匀浆机匀浆。匀浆液以8000r/min离心15min，过滤到100ml的三角瓶中，将沉淀物用15ml 6％高氯酸再次匀浆，离心。合并两次上清液，用5.0mol/L和0.5mol/L NaOH调pH至6.5，转移至100ml容量瓶中，定容摇匀。测定前用0.45μm滤膜过滤后用于HPLC分析。

色谱条件

色谱柱：Agilent 1100dC18柱(5μm，Φ4.6mm×150mm)；流动相：50mmol/L pH6.5甲酸铵缓冲溶液(含5％甲醇)；流速：1ml/min；柱温：25℃；进样量：5μL；紫外检测波长：254nm；运行时间：标准工作液运行4min，样品提取液运行11min。

6、IMF含量测定

肌内脂肪含量按照国家标准，采用索氏抽提法测定(GB/T5009.6-2003)。

7、实时荧光定量RT-PCR测定各个基因的表达水平

(1)心脏、肝脏和背最长肌中总RNA提取

1.5ml EP管中加入1mL Trizol

研钵中加入液氮，取大约100mg的心脏组织(-80℃冰箱保存)于研钵中，边加液氮边研磨，将其研磨成粉末状，迅速将其转入内有Trizol的EP管中，充分震荡摇匀后于室温静置5min。

静置后加入0.2ml氯仿，摇匀，剧烈振荡20-30s，室温下静置10min，使水相、有机相分层。

使用高速冷冻离心机4℃，12000rmp离心15min后，小心吸取上层水相0.45ml左右，切勿吸到蛋白层，转入新EP管中，加入等体积冰异丙醇，室温静置10min。

静置后将样品于4℃、12000rmp离心10min后弃上清；再加入DEPC水配置的75％乙醇洗涤沉淀，并将其4℃、12000rmp离心5min，弃上清。

用20μL枪头吸干EP管内残余的液体，超净台内干燥沉淀5min，加入20μL DEPC水溶解RNA沉淀，于-80℃保存备用。

肝脏和背最长肌组织的RNA提取同上所述方法。

(2)RNA提取质量的检测

紫外分光光度计测定所提取RNA的OD₂₆₀值及OD₂₈₀值，根据OD₂₆₀的值计算RNA的量；根据OD₂₆₀/OD₂₈₀的值评估RNA质量。OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.8-2.0之间的RNA为合格，可进行反转录。并把总的RNA用DEPC水稀释到1μg/μL后分装于EP管内，于-80℃冰箱内冻存备用。

甲醛变性胶检测RNA质量。取RNA样品5μL，加入1μL的5×Loading buffer，在70℃水浴锅内加热10min后，置于冰上骤冷，消除RNA的二级结构，准备上样。用3-5V/cm电泳，1.2％甲醛变性凝胶，进行电泳检测RNA质量。

(3)反转录合成cDNA

用反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit)，按下列组份进行配制反转录反应液，见表1。

表1 反转录反应操作步骤

反转录的反应条件如下：37℃水浴15min，85℃水浴5s(反转录酶失活反应)。反转录后获得的样品cDNA用于PCR检测后，加入RNase Free水至40μL。将反转录产物保存于-20℃冰箱内。

(4)cDNA纯度的鉴定

按照下列配方加入试剂，经PCR反应后得出产物，并用1％琼脂糖凝胶进行产物检测(表2)。

表2 常规PCR操作方法

(5)PCR引物设计

根据Genbank中猪ADSL、GARS-AIRS-GART、DGAT1、DECR1和内参基因β-Actin的cDNA序列，用Primer 5.0引物设计软件设计引物序列，由上海生工生物公司进行引物合成。引物序列及PCR参数见表3。

表3 用于Real-time quantitative PCR引物序列和PCR参数

(6)实时荧光定量PCR

先将每个待测样品的反转录产物进行等量混合，用样品的混合cDNA mix对整个反应条件进行优化。包括目的基因及内参基因的引物设计与合成、目的基因的确认、内标基因的有效性验证和最佳的退火温度、引物的浓度和最佳的实验条件评估等。RT-PCR的反应条件详情见上表。反应循环结束后，用溶解曲线图来检验RT-PCR的产物纯度。每个样品重复3次。在上样前用水验证灭菌三蒸水和引物有无DNA的污染。

(7)相关候选基因的实时荧光定量PCR反应

用实时荧光定量PCR方法来检测猪ADSL、GARS-AIRS-GART、DGAT1、DECR1和内参基因β-Actin基因的表达量，在Rotor-gene 6000荧光定量PCR的系统上进行反应。反应体系为25μL，具体步骤如下(表4)：

表4 RT-PCR反应操作步骤

(8)数据分析

基因的表达量分析：用2-ΔΔCt法对有效性数据进行统计学分析。目的基因的相对表达量为2^-ΔΔCT，ΔΔCt表示选择β-actin为内参基因，以对照组目标基因与内标基因的Ct差值平均值做为参照值，x表示任意一样本，其公式如下：

ΔΔCt＝(C_{t.Target gene}－C_t.β-actin)_x－(C_{t.Target gene}－C_t.β-actin)_control

上述公式计算了每一个样本目标基因的表达量，通过内参β-actin基因校正后，数据用平均值±标准误，即M±SE表示；采用SPSS19.0软件对实验数据结果进行统计学分析，均值差异显著性用One-way ANOVA程序进行分析比较，数据相关性分析采用Bivariate correlation程序进行分析。P<0.01表明差异水平极显著，P<0.05表明为差异水平显著。

二、结果

1、圩猪、六白猪和长白猪背最长肌肉色比较

如图1所示，在三个猪种中，六白猪和长白猪背最长肌肉色指标L*值极显著高于圩猪(P<0.01)，六白猪和长白猪L*值无显著差异；圩猪和六白猪背最长肌肉色指标a*值极显著高于长白猪(P<0.01)，圩猪和六白猪a*值无显著差异；长白猪背最长肌肉色指标b*值极显著高于六白猪和圩猪(P<0.01)，六白猪b*值极显著高于圩猪(P<0.01)。其中L*值表示亮度，取值0-100，值越大，亮度越大，L*值大于53即为灰白肉(异常肉)；a*值是度量肌肉从红色到绿色的变化，a值越大肉质越好；b*值是度量肌肉从黄色到蓝色的变化，b值越小肉质越好；根据所测的L*、a*和b*值判断不同肉色的差别，结果表明，肉色性状在圩猪、安庆六白猪及长白猪间存在品种差异，且圩猪在该三个品种中肉色品质较好。

2、圩猪、六白猪和长白猪背最长肌pH_1h、pH_24h值比较

长白猪和六白猪pH_1h(宰后1小时pH值)和pH_24h(宰后24小时pH值)均极显著高于圩猪(P<0.01)，而六白猪和长白猪pH_1h和pH_24h无显著差异(图2)。pH值较高的猪肉耐贮藏，不易变质，从结果来看，长白猪和六白猪的猪肉较耐贮藏。

3、圩猪，六白猪和长白猪背最长肌剪切力比较

长白猪剪切力极显著高于六白猪和圩猪(P<0.01)，而六白猪和圩猪剪切力无显著差异(图3)。表明圩猪和六白猪的嫩度较高。

4、圩猪、六白猪和长白猪背最长肌IMP含量比较

圩猪、六白猪和长白猪的IMP含量分别为2.34±0.63、2.22±0.85、2.76±0.41(单位:mg/g)。长白猪背最长肌中肌苷酸极显著高于六白猪与圩猪(P<0.01)，而圩猪肌肉中肌苷酸和六白猪肌肉中肌苷酸含量无显著差异(图4)。

5、圩猪、六白猪和长白猪背最长肌IMF含量比较

圩猪、六白猪和长白猪背最长肌IMF含量分别为3.46±0.20、3.28±0.36、1.54±0.11(单位:％)，圩猪与六白猪背最长肌IMF含量极显著高于长白猪(P<0.01)，圩猪与六白猪IMF含量无显著差异。结果显示，中国地方猪种背最长肌IMF含量显著高于外来猪种(图5)。地方猪种相对于外国猪种肌内脂肪含量高分布面积大，是其肌肉细嫩多汁和肉味鲜美的主要原因。

6、荧光实时定量RT-PCR相关测定结果

(1)试验的样品RNA质量检测结果

将提取的圩猪、六白猪及长白猪心脏、肝脏和背最长肌组织RNA用甲醛变性胶进行电泳检测，电泳图中可见明显的18S、5S及28S条带，三条带清晰，透明，且无拖尾现象及其它杂带现象。表明，总RNA的质量符合实验要求，可进行逆转录合成cDNA(图6)。

(2)cDNA纯度的鉴定

将提取的总RNA按照相关逆转录反应成cDNA，取适量的样本混合，以β-Actin基因引物对为引物用普通PCR反应扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，从电泳图上可看到混合样品均能得到很好的β-Actin电泳条带(β-Actin条带97bp)(图7)。图7中，1，2泳道加ddH2O；M为Marker：LD2000；3，4，5，6分别为心脏，肝脏，背最长肌和三种组织cDNA混合样。从电泳图片结果看，各PCR扩增产物条带清晰、无杂带，说明该引物对可特异性地扩增出目的产物。

(3)荧光实时定量RT-PCR标准曲线的建立和扩增曲线

用RT-PCR方法得到各个目的基因标准曲线，对结果进行相关数据分析后，得到目的基因ADSL,GARS-AIRS-GART,DGAT1和DECR1及β-actin的标准曲线的相关系数和扩增效率均等于或接近于1.000，表明实验数据误差较小，有较高可信度，实验所得的Ct值可准确地测定起始cDNA的拷贝数。目的基因和管家基因标准曲线的斜率小于0.1，表明两个基因的标准曲线的斜率基本上一致，说明可以在后续试验中使用分析Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。各目的基因扩增产物的熔解曲线均只有一个峰值，无非特异性峰存在，说明扩增产物的特异性良好。

7、圩猪、六白猪和长白猪心脏，肝脏和背最长肌组织中ADSL，GARS-AIRS-GART，DGAT1和DECR1基因mRNA表达情况

(1)圩猪、六白猪和长白猪心脏、肝脏和背最长肌组织ADSL mRNA表达情况

圩猪肝脏组织ADSL mRNA表达量极显著高于六白猪和长白猪(P<0.01)，六白猪肝脏组织ADSL mRNA表达量显著高于长白猪(P<0.05)；圩猪和长白猪心脏ADSLmRNA表达量显著高于六白猪(P<0.05)；圩猪背最长肌组织ADSL mRNA表达量显著高于六白猪(P<0.05)，而六白猪与长白猪无显著差异。不同组织ADSL基因表达模式在三个猪种基本相同，均表现为背最长肌中最高，心脏次之，肝脏最低的趋势。其中在圩猪背最长肌的表达量显著高于肝脏(P<0.05)(表5)。

表5 圩猪、六白猪和长白猪心脏、肝脏和背最长肌组织中ADSL mRNA的表达情况

注：表中不同大小写字母表示同一行差异极显著或显著(P<0.01，P<0.05)；*表示同一列中与最大值比差异显著(P<0.05)。

(2)圩猪、六白猪和长白猪心脏、肝脏和背最长肌组织中GARS-AIRS-GART mRNA表达情况

长白猪背最长肌组织GARS-AIRS-GART mRNA表达量显著高于六白猪(P<0.05)，其他各组间均无明显差异。GARS-AIRS-GART基因在三种猪肝脏，心脏，背最长肌的表达模式基本相同，即均表现为背最长肌最高，肝脏次之，心脏最低的趋势(表6)。

表6 圩猪、六白猪和长白猪心脏、背最长肌和肝脏组织中GARS-AIRS-GART mRNA的表达

注：表中不同大小写字母表示同一行差异极显著或显著(P<0.01，P<0.05)。

(3)圩猪、六白猪和长白猪心脏、肝脏和背最长肌组织中DGAT1 mRNA表达情况

长白猪背最长肌DGAT1 mRNA表达量极显著高于心脏和肝脏(P<0.01)，DGAT1在圩猪和六白猪中的表达表现为背最长肌高于心脏和肝脏的趋势。三种猪DGAT1基因在各组织表达模式基本相同，即均表现为圩猪最高，六白猪次之，长白猪最低的趋势(表7)。

表7 圩猪、六白猪和长白猪心脏、肝脏和背最长肌组织中DGAT1 mRNA的表达情况

注：**表示同一列中与最大值比差异极显著(P<0.01)。

(4)圩猪、六白猪和长白猪心脏、肝脏和背最长肌组织中DECR1 mRNA表达情况

DECR1在长白猪背最长肌的表达量显著高于心脏和肝脏(P<0.05)，在圩猪和六白猪中的表达表现为肝脏最高，心脏次之，背最长肌最低的趋势；长白猪背最长肌DECR1 mRNA表达显著高于六白猪和圩猪(P<0.05)(表8)。

表8 圩猪、六白猪和长白猪心脏、肝脏和背最长肌组织中DECR1 mRNA的表达

注：表中不同小写字母表示同一行差异显著(P<0.05)；*表示同一列中与最大值比差异显著(P<0.05)。

8、ADSL、GARS-AIRS-GART基因表达量与背最长肌IMP含量的相关性分析

ADSL基因在长白猪肝脏的表达量与长白猪背最长肌IMP含量显著负相关(P<0.05)。GARS-AIRS-GART基因在圩猪肝脏和六白猪心脏的表达量分别与圩猪和六白猪背最长肌IMP含量呈极显著负相关(P<0.01)(表9)

表9 ADSL和GARS-AIRS-GART基因表达量与IMP含量的相关性分析

注：R＝相关系数；**表示极显著相关，*表示显著相关。

9、ADSL、GARS-AIRS-GART基因表达量与背最长肌pH值的相关性分析

六白猪ADSL基因在心脏的表达量与背最长肌pH_1h值呈显著中度正相关(P<0.05)，长白猪ADSL基因在心脏的表达量与背最长肌pH_1h值呈显著高度正相关(P<0.05)。ADSL基因在三种猪三种组织中的表达量与背最长肌pH_24h值无明显相关性(表10)。

表10 ADSL表达量与背最长肌pH值的相关性分析

六白猪GARS-AIRS-GART基因在心脏的表达量与pH_24h值呈显著中度正相关(P<0.05)，在背最长肌的表达量与其pH_24h值呈显著中度正相关(P<0.05)，GARS-AIRS-GART基因在三种猪三种组织中的表达量与pH_1h值无明显相关性(表11)。

表11 GARS-AIRS-GART表达量与pH值的相关性分析

10、肉质指标的相关性分析

相关性分析发现，pH_1h值与pH_24h值存在极显著正相关，pH_1h值与L*和b*值极显著正相关，pH_1h与pH_24h值与a*值极显著负相关(表12)。

表12 肉色与pH值的相关性分析

11、IMF与背膘厚、肥肉率、胴体重、大理石花纹和水分的相关性分析

以圩猪为例，将IMF含量与各胴体性状及肉质指标进行比较分析发现，IMF含量与背膘厚，肥肉率、胴体重和大理石纹呈高度正相关，与水分呈高度负相关，与背膘厚、大理石纹和水分的相关性达到极显著水平(P<0.01)，与肥肉率、胴体重相关性达到显著水平(P<0.05)(表13)。

表13 IMF与背膘厚、肥肉率、胴体重、大理石花纹和水分的相关性分析

12、DGAT1和DECR1基因表达量与肉质指标的相关性分析

以六白猪为例，将四个基因的表达量与各胴体性状及肉质指标进行比较分析发现，DGAT1在六白猪心脏组织中的表达与剪切力极显著高度负相关，相关值达到1(P<0.01)，DECR1基因在六白猪心脏的表达量与其滴水损失极显著高度正相关(P<0.01)，DECR1基因在六白猪肝脏的表达量与背膘厚呈显著高度正相关(P<0.05)，和肥肉率呈极显著高度正相关(表14)。

表14 DGAT1和DECR1基因表达量与肉质指标的相关性分析

13、不同品种猪肉色、pH值、剪切力比较及相关性分析

通过对圩猪、六白猪和长白猪肉色、pH值、剪切力的比较分析，发现猪的肉质性状有明显的品种差异。pH值较高的猪肉耐贮藏，不易变质，从结果来看，长白猪的猪肉较耐贮藏。圩猪和六白猪的肉色较红，感官品质好于长白猪。

本研究结果显示pH_1h显著高于pH_24h，pH_1h与pH_24h值存在极显著正相关。相关性分析发现，pH_1h与L*和b*值极显著正相关，pH_1h与pH_24h与a*极显著负相关。这是由于pH值下降的速度和强度，会对肉质性状产生决定性的影响，肌肉呈酸性，肌肉蛋白质变性，使系水力降低，汁液流失，猪肉颜色变灰变白，而自由水的增多会改变猪肉表面反射特性(主要与L*有关)，肌原纤维的空隙结构变化以及影响肌红蛋白的氧合(主要与b*有关)。

14、不同品种猪IMP含量的比较

肌苷酸是影响肌肉鲜味的主要成分之一，屠宰后动物机体正常的生理代谢功能遭到破坏，细胞内糖原有氧代谢转化为无氧酵解，生成乳酸使pH值下降，同时肌肉中ATP减少使肌质网功能失常，ATP酶活化，剩余ATP在ATP酶的作用下分解生成ADP，ADP在多种酶的作用下生成肌苷酸，并进一步水解生成次黄嘌呤和核糖。肌肉中次黄嘌呤核苷酸及其他分解产物的积累可增加肉的鲜味。本发明实验结果中，长白猪肌肉中肌苷酸分别极显著高于六白猪与圩猪。

15、不同品种猪IMF含量的比较

不同猪种肌肉IMF含量差异很明显，而影响IMF含量的因素很多，其中营养调控和遗传机制起着很大的作用，中国本地猪种相对于外国猪种肌内脂肪含量高，分布面积大，是其肌肉细嫩多汁和肉味鲜美的主要原因。相关研究显示，国外品种猪IMF含量较低，为2％左右，只有杜洛克猪的IMF含量相对较高。中国地方猪种的IMF含量一般处于中等至丰富的水平(3％-7％)。圩猪肉质肥嫩鲜香，六白猪为肉脂兼用型猪种，而长白猪为世界著名的瘦肉型猪种，胴体瘦肉率高。本发明实验结果中圩猪IMF含量平均高达3.5％左右，且圩猪和六白猪均明显高于国外猪种长白猪，且圩猪高于六白猪，这与三种猪的种质特性相一致。

16、IMF与肉质指标相关性比较

猪肉肌内脂肪含量与肉的品质密切相关，其与肉质的大理石纹分布、系水力、嫩度和风味等方面都有相关性，且能够改善纯瘦肉口感干硬、易成渣和欠滑嫩的弊端，所以在优良猪种的选育方面肌内脂肪含量也是一个重要的指标。本发明研究结果表明随着IMF含量的增高，背膘厚、胴体重和肥肉率数值也在升高，其大理石纹评分也在升高，但水分随之降低。

IMP和IMF含量属于较低遗传力的性状，对它们进行直接选择可能存在一定的困难，但其含量与部分屠宰性状、肉质性状间大多存在一定的相关，且有些达到显著水平。我们可以借助这些相关性对IMP和IMF含量进行间接选择。

17、不同品种猪不同部位ADSL和GARS-AIRS-GART mRNA表达的比较

(1)ADSL和GARS-AIRS-GART在不同组织中的表达比较

IMP在体内的合成代谢过程十分复杂，涉及十种关键酶，由ADSL基因所编码的腺苷酸琥珀酸裂解酶是嘌呤核苷酸合成过程中的关键酶之一。ADSL主要催化AMP生化合成的两个反应：(1)由SACIAR生成AICAR的反应；(2)由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸单磷酸的反应。而GARS、GART和AIRS分别催化次黄嘌呤核苷酸合成的第二、三和五步反应，从而加速次黄嘌呤和黄嘌呤的分解，而肌肉中次黄嘌呤核苷酸及其他分解产物的积累可增加肉的鲜味。

现有的研究多集中于对禽类ADSL和GARS-AIRS-GART基因多态性与IMP含量相关性的研究，对于猪ADSL和GARS-AIRS-GART基因组织表达量的研究很少。在本发明实验中，ADSL基因在三种猪表达模式基本相同，背最长肌中最高，心脏次之，肝脏相对表达量最低。国内外尚未见关于畜禽GARS-AIRS-GART基因组织表达谱的研究报道，本研究发现GARS-AIRS-GART基因在猪背最长肌中的表达量最高，肝脏次之，心脏较低，三种猪的组织表达模式基本相同。

(2)ADSL和GARS-AIRS-GART表达与肉质指标相关性分析

本发明实验结果显示，长白猪ADSL基因在肝脏的表达量与IMP含量呈显著负相关；ADSL基因在其他猪种或组织中无相关性可能是由于基因在该猪种或组织中的表达量对于ADSL基因合成嘌呤的两步反应无显著影响。圩猪肝脏、六白猪心脏中GARS-AIRS-GART基因表达量分别与IMP含量显著负相关；GARS-AIRS-GART基因在其他猪种或组织中无相关性可能是由于基因在该猪种或组织中的表达量对GART，AIRS，GART三种酶催化次黄嘌呤核苷酸合成的第二、三和五步反应无显著影响。

pH值是肉质性状的一个指标，过高过低均会引起肉质的异常。六白猪和长白猪ADSL基因在心脏的表达量pH_1h值呈显著中度正相关和高度正相关，六白猪GARS-AIRS-GART基因在心脏和背最长肌的表达量与其pH_24h值均呈显著中度正相关(P<0.05)。

18、不同品种猪不同部位DGAT1和DECR1mRNA表达的比较

(1)DGAT1和DECR1mRNA表达的比较

DGAT是一种甘油酰基转移酶，该酶与脂肪代谢、脂类在组织中的沉积有很大关系，DGAT1催化催化二酰基甘油加上脂肪酸酰基辅酶，是甘油三酯合成过程中唯一的关键酶和限速酶。现有的研究多集中于对DGAT1多态性与牛产奶性状相关性的研究，对于猪DGAT1基因组织表达量的研究较少。本发明研究结果表明DGAT1基因在三种猪的心脏，肝脏，背最长肌的表达模式不尽相同，但三种猪均表现为在背最长肌的表达量最高，心脏次之，肝脏较低的趋势。

线粒体脂肪酸β-氧化系统是哺乳动物重要能量代谢途径之一。而DECR1又是线粒体内多不饱和脂肪酸PUFA β-氧化分解的关键酶，调节脂肪酸和能量代谢平衡，对脂肪与蛋白质的沉积具有调控作用。本研究发现，DECR1基因在圩猪、六白猪和长白猪3个品种猪的心脏、肝脏和背最长肌肉组织中均有表达；其中，在圩猪和六白猪中表现为肝脏最高，心脏次之，背最长肌最低的趋势，但在长白猪中，背最长肌显著高于心脏和肝脏；且DECR1基因在背最长肌中的表达量存在品种差异，长白猪在背最长肌组织中的表达显著高于六白猪和圩猪。相关研究发现，瘦肉率高的猪种，其猪肉组织中的多不饱和脂肪酸含量也相应较高，需要更多的DECR1酶完成其催化反应，这与品种的脂肪沉积能力趋势一致，长白猪为世界著名的瘦肉型猪种，胴体脂肪率低，圩猪肉质肥嫩鲜香，六白猪为肉脂兼用型猪种，这也与本文测得的三种猪背最长肌IMF含量结果相一致。说明猪DECR1基因在参与调控脂肪代谢与脂肪沉积方面发挥着重要的作用。

(2)DGAT1和DECR1mRNA表达与相关胴体性状和肉质指标相关性分析

猪IMF的沉积过程取决于遗传、环境和营养等多个因素的相互作用，它们共同调控了猪IMF的含量。本发明研究结果表明DGAT1与DECR1在三个组织的表达与肌内脂肪含量均无显著相关。仅只能说明单独的脂肪合成过程或脂肪降解过程均不能决定肌内脂肪的生成。

而DGAT1在六白猪心脏组织中的表达与剪切力极显著高度负相关，相关值达到1。在动物屠宰后，肌肉内的能源物质ATP，磷酸肌酸和糖原逐步耗尽，当ATP低于维持肌肉松弛状态所需的最低浓度时，肌球蛋白和肌动蛋白发生不可逆结合，形成肌动球蛋白，肌肉的伸展性消失。随着ATP的耗竭，肌肉就会变得僵硬粗糙，嫩度下降。由上可以推测DGAT1可能在ATP的降解中发挥重要作用。

相关研究发现，猪DECR1基因位于第四号染色体的(46.76-46.77)CM处，该区域是健康状态QTL的一部分，其基因功能与猪血清胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、甘油三酯相关，此外，该位置与影响背膘中亚油酸含量的QTL可靠区域非常一致，由于DECR1基因在多不饱和脂肪酸代谢中具有一定的作用，猪DECR1基因表达量及活性的变化可能会影响亚油酸的含量，最终导致背膘厚与肥肉率发生变化。本发明研究发现DECR1基因在六白猪心脏的表达量与其滴水损失极显著高度正相关，DECR1基因在六白猪肝脏的表达量与背膘厚和肥肉率呈极显著高度正相关，说明DECR1基因mRNA的表达与猪的脂肪沉积有关。

总结结论：

1、IMP，IMF，pH值，肉色，剪切力等肉质指标均存在显著的品种差异性，各肉质指标之间存在一定相关性。

2、ADSL，GARS-AIRS-GART，DGAT1和DECR1基因在圩猪、六白猪和长白猪心脏、肝脏及背最长肌中均有表达，但表达模式不尽相同。

3、ADSL和GARS-AIRS-GART基因的表达丰度与IMP含量相关，DGAT1和DECR1基因的表达丰度与脂肪沉积有关。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)对照动物模型的选择：选择安徽地方猪种圩猪、安庆六白猪与外来猪种大白猪为研究肉质品种差异的对照动物模型；

(2)样品采集：猪屠宰后，取背最长肌、心脏及肝脏组织；

(3)常规肉质指标测定：白度色度计测定眼肌肉色、pH计检测背最长肌屠宰存储1小时及24小时后pH值、宰后即用嫩度仪检测背最长肌剪切力；

(4)采用色谱法测定背最长肌样品中IMP含量；

(5)采用索氏抽提法测定背最长肌样品中IMF含量；

(6)采用RT-PCR的方法比较IMP和IMF形成过程中关键基因ADSL、GARS-AIRS-GART、和DGAT1、DECR1mRNA在猪肝脏、心脏和背最长肌组织中的表达水平，并进行数据的统计分析，研究此四种基因在不同猪种和组织中的表达规律及其与各肉质指标的相关性。

2.根据权利要求1所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其特征在于：步骤(1)中所述圩猪为21头10月龄圩猪、所述安庆六白猪为13头10月龄安庆六白猪，所述长白猪为6头6月龄长白猪。

3.根据权利要求2所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其特征在于：步骤(2)中所述样品采集为：21头10月龄圩猪、13头10月龄安庆六白猪及6头6月龄长白猪屠宰后，①取背最长肌组织若干，于4℃保存，用于肉质常规指标及IMF、IMP含量测定；②取背最长肌、肝脏和心脏组织各100g，液氮冷冻，后转移至-80℃冰箱保存，用于基因表达检测。

4.根据权利要求3所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其特征在于：步骤(3)具体包括如下步骤：

肉色的测定：屠宰后立即测量，采用白度色度计测定眼肌肉色，读取L*值、a*值和b*值，其中L*值表示亮度，取值0-100，值越大，亮度越大，L*大于53为灰白肉即异质肉；a*值是度量肌肉从红色到绿色的变化，a值越大肉质越好；b*值是度量肌肉从黄色到蓝色的变化，b值越小肉质越好；根据所测的L*、a*和b*值判断肉色的差别；所述测定眼肌肉色为测定背最长肌在胸腰椎结合处横截切面的肉色；

pH值的测定：屠宰后1小时测量，将pH电极直接插入所取背最长肌样品的中部，深度不小于1cm，将电极头部完全包埋在肉样中，待数值稳定后，读取pH值，精确到0.01；将肉样置于0-4℃冰箱中保存24h后，按照相同方法测pH值，所读取的数值即为pH_24h；

嫩度的测定：屠宰后立即测量，用剪切力表示，在肌肉中心插入温度计，放在保鲜袋中，然后放入温度为72℃的水中蒸煮，当肉中心温度达到70℃时取出，冷却至室温后，将肉样按与肌纤维呈垂直的方向切取宽度为1.5cm的肉块，再用直径为1.27cm圆形的取样器，顺肌纤维方向钻切肉样块，置于嫩度仪中测其剪切力，每个样品做10个重复，记录剪切力值，计算算术平均数，单位用牛顿(N)表示。

5.根据权利要求4所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其特征在于：步骤(4)具体包括如下步骤：

样品前处理：

于屠宰后1.5h内迅速采集背最长肌组织作为猪肉样品，当冷藏时间达到24h时，取出猪肉样品制备肌苷酸测定样，使用绞肉机绞碎所述猪肉样品，准确称取5g，精确到0.0001，置于50mL塑料离心管中，加入20mL 6％高氯酸，用高速组织匀浆机匀浆；匀浆液以8000r/min离心15min，过滤到100mL的三角瓶中，将沉淀物用15mL 6％高氯酸再次匀浆，离心，合并两次上清液，用5.0mol/L和0.5mol/L NaOH调pH值至6.5，转移至100mL容量瓶中，定容摇匀，测定前用0.45μm滤膜过滤后用于HPLC分析；

色谱条件：

色谱柱：Agilent 1100dC18柱，5μm，Φ4.6mm×150mm；流动相：50mmol/L pH6.5甲酸铵缓冲溶液，其中含有5％甲醇；流速：1mL/min；柱温：25℃；进样量：5μL；紫外检测波长：254nm；运行时间：标准工作液运行4min，样品提取液运行11min。

6.根据权利要求5所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其特征在于：步骤(6)中ADSL的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，GARS-AIRS-GART的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，DGAT1的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，DECR1的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；荧光定量PCR扩增反应体系为25μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5μL，上下游引物各1μL，引物浓度为10μM/mL，cDNA 2μL，ddH₂O高压8.5μL；反应条件为：95℃预变性2min；95℃10s，60℃45s，72℃延伸15s，收集荧光值，40个循环。

7.根据权利要求6所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其特征在于：数据统计分析包括如下步骤：

基因的表达量分析：用2-ΔΔCt法对有效性数据进行统计学分析，目的基因的相对表达量为2^-ΔΔCT，ΔΔCt表示选择β-actin为内参基因，以对照组目标基因与内标基因的Ct差值平均值做为参照值，x表示任意一样本，公式如下：

ΔΔCt＝(C_{t.Target gene}－C_t.β-actin)_x－(C_{t.Target gene}－C_t.β-actin)_control

上述公式计算了每一个样本目标基因的表达量，通过内参β-actin基因校正后，数据用平均值±标准误，即M±SE表示；采用SPSS19.0软件对实验数据结果进行统计学分析，均值差异显著性用One-way ANOVA程序进行分析比较，数据相关性分析采用Bivariate correlation程序进行分析。