CN104911257A - As-str基因座荧光标记复合扩增体系及应用 - Google Patents

As-str基因座荧光标记复合扩增体系及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系及应用，该复合扩增体系共包含15个连锁的常染色体STR（AS-STR）基因座：D3S2402,D3S2452,D3S1766,D3S4554,D3S2388,D3S4551、D3S2422、D3S3051,D3S3053,D4S2364,D4S2404, AC001348A,AC001348B,D17S975和D17S1294。本发明的15个连锁AS-STR基因座是在一个复合扩增体系中同时扩增，快速、方便，PCR 产物经遗传分析仪电泳，结果自动分析，能标准化、国际化，保证不同实验室数据比较的正确性。本项目开发的紧密连锁STR复合扩增试剂盒不仅仅适用于亲缘鉴定，还可以用于染色体异常的产前诊断，市场应用前景广阔。

Description

AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系及应用
技术领域
本发明涉及检测人体基因组中具有多态性的遗传标记，尤其涉及连锁的AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系及应用。
背景技术
亲缘鉴定是法医学鉴定上的难点。无名人员身份识别、失散人员认亲、意外或交通事故死亡人员认领，甚至是大灾难性事件受害人的身源鉴定都会涉及亲缘鉴定。对于一些没有父母参与的亲缘鉴定来说，除了Y染色体和线粒体DNA遗传标记可以排除父系或母系亲缘关系之外，应用常染色体上非连锁的遗传标记时，由于被鉴定的个体之间无法直接观察等位基因的遗传情况，也就无法直接排除亲缘关系，只能通过比较亲属与无关个体共有等位基因的概率来评估亲缘关系。由于STR的遗传背景，表现为很多STR的等位基因频率大于0.125或更高的0.25，此值大于三级亲属具有12.5％或二级亲属有25％相同等位基因的值，因而无法区分三级亲缘关系或无关个体关系，亲缘关系在二级或三级亲属的鉴定上遇上了瓶颈。显然，用常染色体非连锁的STR只是对一级亲属(全同胞)鉴定有较好的效果，而无法将二级亲属、三级亲属或是无关个体区分开，故无法进行亲缘关系鉴别。
人类基因组中，存在着一类紧密连锁的STR基因座，连锁的STR构成单体型(haplotye)从亲代遗传给后代，紧密连锁STR单体型具有高度多态性。在无关个体之间具有相同单体型的概率非常小，可克服常规非连锁STR多态性不高和遗传背景的干扰，突破目前不能鉴定二级以上亲缘关系和区别不同亲缘关系的难题。如果某紧密连锁STR组单体型的多态性是无限地高，那么无关个体之间具有相同单体型的概率就会非常非常小，只有具有亲缘关系的个体才会有相同的单体型，这样就能将有亲缘关系和没有亲缘关系的个体区分开来。
然而，除X染色体STR基因座外，现有的应用于法医学鉴定的STR都不是紧密连锁的STR，能够应用于实际亲缘鉴定的紧密连锁STR复合扩增体系迄今国内外仍未有报道。因此，本发明从3号、4号、17号常染色体上筛选出有高度 多态性的紧密连锁STR基因座，建立复合扩增体系。本发明开发的紧密连锁STR复合扩增试剂盒不仅仅适用于亲缘鉴定，还可以用于染色体异常的产前诊断，市场应用前景广阔。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适合于中国人群的，可以快速、方便针对非紧密连锁的常染色体STR、Y-STR、X-STR无法将二级亲属、三级亲属或是无关个体区分开，故无法进行亲缘关系鉴别进行鉴定的AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系及应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系，该复合扩增体系共包含15个基因座：D3S2402,D3S2452,D3S1766,D3S4554,D3S2388,D3S4551、D3S2422、D3S3051,D3S3053,D4S2364,D4S2404,AC001348A,AC001348B,D17S975和D17S1294；所述15个基因座引物分别用FAM、HEX、TAM或ROX四种荧光素标记；FAM荧光素标记D17S1294、D3S4551、D4S2404和D3S3053，HEX荧光素标记AC001348B、AC001348A、D3S2422和D3S4554，TAMRA荧光素标记D3S2388、D3S2452、D3S1766和D17S975，ROX荧光素标记D4S2364、D3S3051和D3S2402；其中扩增引物对分别为：
D3S2402引物对：
F:CCTGGGCAACATAATGAGAT，
R:TGGACAAAGCATTTTATAATCTG；
D3S2452引物对：
F:GCTTGCAGATAGCAGATCGT，
R:TATAAGATTAGTCAGGGCTCGC；
D3S1766引物对：
F:ACCACATGAGCCAATTCTGT，
R:ACCCAATTATGGTGTTGTTACC；
D3S4554引物对：
F:CAATACGGGCTGATGATAGG，
R:TGGAAATGCTCCCATAGATT；
D3S2388引物对：
F:TCCACTCAGTACAAGTCTGGG，
R:GATCCTGTGGTTTGTCGATC；
D3S4551引物对：
F:AGTCATTGTCAGGCATTGGT，
R:ATATGACCTTGGGCAACAAA；
D3S2422引物对：
F:ACTGAGAAAGTCTTTCTGTGCC，
R:GTTCACCATCTACAGTGGGC；
D3S3051引物对：
F:GGCAATTAGTTATGTAGCAATCG，
R:TGAGTCAATTGTGCTGGCTA；
D3S3053引物对：
F:TCTTTGCTCTCATGAATAGATCAGT，
R:GTTTGTGATAATGAACCCACTCAG；D4S2364引物对：
F:AACAAAACTAGGAGATCATGTGG，
R:ACCTTGACTTTGATGTGGGA；
D4S2404引物对：
F:ATATATATGATGCATGTCAAAATGG，
R:CTGGGCAAACTCATTTCAAC；
AC001348A引物对：
F:CAACCATCAGTGATTTGATGGTTTA，
R:CTGTTCTTCTTAATCCTTAACCAGT；
AC001348B引物对：
F:TCTCAGTCCTGATTTCTTGATTTTG，
R:CCAGAGCTAACACCACATTCA；
D17S975引物对：
F:AGTAATGGGACTTCTCGGCT，
R:TAGGATCCCAAGTGTGCAGT；
D17S1294引物对：
F:TGGCATGCAATTGTAGTCTC，
R:TTCTTTCCTTACTAAGTTGAGAACG；
在上述AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系中，所述15个AS-STR基因座组建7个连锁群，分别是：Ⅰ：D3S2402-D3S2452-D3S1766；Ⅱ：D3S4554-D3S2388；Ⅲ：D3S4551-D3S2422；Ⅳ：D3S3051-D3S3053；Ⅴ：D4S2364-D4S2404；Ⅵ：AC001348A-AC001348B；Ⅶ：D17S975-D17S1294。
上述AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系在制备认定亲缘关系检案试剂中的应用。
上述AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系在制备对常染色体相关性遗传病进行产前诊断的检测试剂中的应用。
一种试剂盒，包括上述的AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系中的扩增引物对的混合物。
一、本发明复合扩增体系中15个基因座的选择
(1)紧密连锁： 
从基因组中筛选位于同一染色体上紧密连锁STR基因座，紧密连锁STR组成的连锁对或连锁组(linkage group)按单体型稳定遗传，每个连锁组内的STR基因座遗传距离≤3cM。根据文献(Inturri S,et al.Forensic Sci IntGenet.2011；5:152-4)的标准，遗传距离≤3cM可以认为呈紧密连锁。不同STR连锁组位于不同的染色体上，或者多个连锁组虽在同一染色体上但相距很远，可以自由重组，应用多个连锁组的STR基因座构建复合扩增体系。应用这些体系检测样本进行亲缘推断时，既考虑联合应用连锁基因座(一个连锁组可看作是一个基因座)来提高遗传标记的多态性；又考虑连锁STR组与组之间的自由重组，使组与组之间能够应乘积规则(product rule)进行法医遗传学的统计。
本发明的15个基因座分布于3号、4号和17号染色体上紧密连锁的，15个AS-STR基因座可以组建7个连锁群(Ⅰ：D3S2402-D3S2452-D3S1766；Ⅱ：D3S4554-D3S2388；Ⅲ：D3S4551-D3S2422；Ⅳ：D3S3051-D3S3053；Ⅴ： D4S2364-D4S2404；Ⅵ：AC001348A-AC001348B；Ⅶ：D17S975-D17S1294)。紧密连锁的基因座构成单倍型，在亲缘鉴定中有利于分析亲代与子代之间的遗传关系。
(2)易于扩增： 
除上述15个基因座外，实验初期发明人还选择了另外一些位于3号染色体上的基因座，如D3S1764、D3S2435等连锁的基因座；4号染色体上的基因座D4S3334、D4S1644、D4S2426、D4S2368、D4S2414等连锁的基因座。但单基因座扩增结果发现，这些基因座的扩增存在着一些问题，有的扩增的产物量少，显带过浅，甚至有时很难得到扩增产物，如D4S2368；有的很容易出现非特异带(如影子带)，如D4S2414；而上述15个基因座易于扩增稳定性好，结果清晰，非特异性带很少。
因此最后选择了D3S2402,D3S2452,D3S1766,D3S4554,D3S2388,D3S4551、D3S2422、D3S3051,D3S3053,D4S2364,D4S2404,AC001348A,AC001348B,D17S975和D17S1294这15个易于扩增，分型较好的基因座进行复合扩增。
(3)扩增产物片段长度不重叠：
复合扩增各基因座片段大小的差距应大于20bp，各基因座的等位基因之间才不会发生重叠，干扰分型。
本发明的15个AS-STR基因座复合扩增体系根据各基因座扩增产物片段长度大小，用同一荧光标记不同扩增产物片段长度(相差大于20bp)的基因座，保证复合扩增各基因座的等位基因之间不会发生重叠,不会干扰分型。用四种不同颜色的荧光标记多个基因座的引物，保证同一反应体系能同时扩增多个基因座，而不影响各基因座的分型。本发明的15个基因座引物分别用FAM、HEX、TAM、ROX四种不同颜色的荧光标记。体系中15个AS-STR基因座其荧光组合方式为FAM荧光素标记D3S3053、D4S2404、D3S4551和D17S1294，HEX荧光素标记AC001348B、AC001348A、D3S2422和D3S4554，TAMRA荧光素标记D3S2388、D3S2452、D3S1766和D17S975，ROX荧光素标记D4S2364、D3S3051和D3S2402。15个AS-STR基因座可以组建7个连锁群。(Ⅰ：D3S2402-D3S2452-D3S1766；Ⅱ：D3S4554-D3S2388；Ⅲ：D3S4551-D3S2422；Ⅳ：D3S3051-D3S3053；Ⅴ： D4S2364-D4S2404；Ⅵ：AC001348A-AC001348B；Ⅶ：D17S975-D17S1294)。
本发明提供一种同时分析多条染色体上连锁STR基因座的荧光标记复合扩增体系，包括用于复合扩增分析的15个AS-STR基因座的引物，全部15个基因座的引物混合在一个试管内。复合扩增体系中的基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中的引物正链的5’端用相应的荧光素标记。
二、本发明复合扩增基因座的扩增
本发明的15个AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系是采用复合PCR技术在同一反应管中同时扩增15个连锁的AS-STR基因座。
(1)PCR反应体系
反应总体积为25μl：PCR反应缓冲液5μl，引物混合物5μl，DNA聚合酶1μl，模板DNA 5μl，加消毒水至25μl。
上述DNA聚合酶可选用本领域技术人员常用的DNA聚合酶，如金牌DNA聚合酶(Ampli Taq)。
(2)PCR扩增参数： 
(3)ABI PRISM 3500遗传分析仪电泳分型扩增产物
a.样品准备： 
混匀后瞬时离心，每管加10.0μl混合物，再加PCR产物1.0μl，瞬时离心。95℃变性4min，放置冰盒中冷却3min，取10.0μl变性后的样品转移至96孔样品板，装载入ABI PRISM 3500遗传分析仪进行电泳。
b.结果分析：ID-X软件。
本发明的15个基因座已在发明人实验室应用于群体学调查并获得中国群体的分型结果，结果证明这些基因座多态性较高，适合于中国人群的检测，并应用 于实际检案取得理想的结果。本发明的15连锁AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系可以制成试剂盒，通过检测多代家系，建立紧密连锁STR基因座单体型数据库，基于连锁STR单体型推断二级以上的复杂亲缘关系。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.紧密连锁：本发明的15连锁AS-STR基因座紧密连锁，15个AS-STR基因座可以组建7个连锁群，能同时分析7个连锁群单倍型数据。
2.个体识别率高：本发明的AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系中的15个连锁AS-STR基因座7个连锁群的单倍型个体识别率达到0.999999以上；
3.本发明的AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系已在发明人实验室用于检测多代家系和多个小孩家系的样本。结果显示连锁的STR基因座构成单体型稳定地从亲代遗传给后代，这结果表明通过本发明能突破目前不能鉴定三级及三级以上亲缘关系和区别不同亲缘关系的难题，为准确评估不同的亲缘关系提供科学依据。
本研究所选的基因座稳定性好，突变率低，分型结果准确，能满足实际检案的需要；
4.本发明在国内首先研制出一组15个连锁AS-STR基因座同时在单一反应管中的复合扩增的五色荧光标记的复合扩增检测体系，达到目前国际上荧光标记连锁AS-STR基因座复合扩增试剂盒的最高水平。
5.本发明的荧光标记引物复合扩增技术快速、方便，PCR产物可用ABI3500、3130、3100、310、377等遗传分析仪电泳，结果自动分析，能标准化、国际化，保证不同实验室数据比较的正确性。
6.本发明可制备一套试剂盒，可进行商品化，可以填补国内没有连锁AS-STR基因座荧光复合扩增试剂盒的空白，也可补充国际复合扩增试剂盒的不足，作为具有中国特色的连锁AS-STR基因座复合扩增试剂盒，可用于亲子鉴定、个体识别、特别适用于推断二级以上的复杂亲缘关系，提高三级或更高级别亲属关系的鉴定能力，为这些特殊案件的鉴定提供重要的科学证据。
7.本发明的连锁AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系可以为伴染色体连锁遗传病提供产前诊断方法，也为解决仅靠不连锁的常染色体STR、Y-STR、X-STR难以将二级亲属、三级亲属等与无关个体区分开的亲缘鉴定提供新的鉴定方法，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为15个AS-STR基因座复合扩增Ladder电泳图谱；
图2为15个AS-STR基因座复合扩增阳性样本9947A电泳图谱；
图3至图4为实施例1的电泳图及其分型结果统计分析图；
图3(A)为祖父样本15个AS-STR基因座复合扩增电泳图谱；
图3(B)为祖母样本15个AS-STR基因座复合扩增电泳图谱；
图3(C)为姑妈样本15个AS-STR基因座复合扩增电泳图谱；
图3(D)为大叔叔样本15个AS-STR基因座复合扩增电泳图谱；
图3(E)为小叔叔样本15个AS-STR基因座复合扩增电泳图谱；
图3(F)为可疑孙女样本15个AS-STR基因座复合扩增电泳图谱；
图4为祖父、祖母、姑妈、叔叔样本的15个AS-STR基因座分型结果的家系分析图。
图5至图7为实施例2分型结果的家系分析图。
图5为4号染色体上的连锁STR(D4S2364-D4S2404)按单体型在四代家系中稳定地遗传(如19个体的单体型7/12是由曾外祖父通过一代代传下来的，单体型6/15由祖母通过父亲传下来的)
图6为17号染色体上的连锁STR AC001348A-AC001348B-D17S975-D17S1294单体型在三代家系中稳定地遗传(如个体17的单体型17/14/20/19是由外祖父遗传给母亲传下来的；个体18的单体型14/13/20/19是由外祖母遗传给母亲传下来的；个体19的单体型13/13/21/19是由外祖父遗传给母传下来的，单体型15/13/21/22祖母遗传给父亲传下来的)
图7为3号染色体上的4组连锁群按单体型在四代家系中稳定地遗传。
图中D3S2422基因等位基因尚未全部测序完毕，Ladder和样本分型暂以bp值表示。
具体实施方式
实施例1应用含有15个连锁AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系进行隔代亲缘鉴定。
原理：人类基因组中，存在着一类紧密连锁的STR基因座，连锁的STR构成单体型(haplotye)从亲代遗传给后代，紧密连锁STR单体型具有高度多态性。在无关个体之间具有相同单体型的概率非常小，可克服常规非连锁STR多态性不高和遗传背景的干扰，突破目前不能鉴定二级以上亲缘关系和区别不同亲缘关系的难题。如果某紧密连锁STR组单体型的多态性是无限地高，那么无关个体之间具有相同单体型的概率就会非常非常小，只有具有亲缘关系的个体才会有相 同的单体型，这样就能将有亲缘关系和没有亲缘关系的个体区分开来。
操作步骤： 
1.DNA提取
Chelex-100法：剪取4Х4mm的血痕或唾液斑，加200μl 10％Chelex-100，56℃烤箱过夜，置于PCR仪中100℃10min，振荡30sec，10000r/min离心2min，4℃保存备用。
2.PCR扩增
PCR扩增反应总体系为25μl：PCR反应缓冲液(Buffer)5μl，引物混合物(Primer Pair Mix)5μl，金牌DNA聚合酶(Ampli Taq)1.0U，模板DNA 5μl，加消毒纯净水至25μl。
上述PCR缓冲液的配方为：dNTP 200μmol/L，MgCl21.5mmol/L，1×Buffer。
上述引物混合物中，各个基因座的引物如序列SEQ NO.1-30所示，FAM荧光素标记D3S3053、D4S2404、D3S4551和D17S1294，HEX荧光素标记AC001348B、AC001348A、D3S2422和D3S4554，TAMRA荧光素标记D3S2388、D3S2452、D3S1766和D17S975，ROX荧光素标记D4S2364、D3S3051和D3S2402。
3.PCR扩增参数：95℃预变性11min，94℃变性1min，60℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环，再60℃延伸60min。
4.ABI PRISM 3500遗传分析仪电泳
1)开机：开启稳压电源→开启3500主机电源(仪器进入自检状态)→打开电脑→启动3500DATA Collection数据采集软件。
2)装置准备：定期清洗和安装
把毛细管、Buffer糟等拆下，用纯水清洗，晾干，灌胶；Buffer糟里盛1×Buffer溶液。双击Run 3500Data CollectionVersion2.0软件→点击菜单栏中的Wizards→点击Fill Capillary wizards，对毛细管注胶→毛细管定位和样品编辑。
3)样品准备： 
混匀后瞬时离心，每管加10.0μl混合物，再加PCR产物1.0μl，瞬时离心。95℃变性4min，放置冰盒中冷却3min，取10.0μl变性后的样品转移至96孔样 品板，装载入3500遗传分析仪进行电泳。
4)结果分析：用GeneMapper ID-X软件进行基因分型。
结果：祖父、祖母、姑妈、叔叔及可疑孙女的15个AS-STR基因座复合扩增电泳图谱见图3A至图3F。其分型结果的统计分析图见图4。由图3和图4可发现孙女样本在3号、4号、17号染色体的结果分型均来自其祖父。而且这些单体型能从其姑妈(样本3)和叔叔(样本4)中找到来源：来自祖父3号染色体上7个基因座(D3S2402/D3S2452/D3S1766/D3S4551/D3S2422/D3S3051/D3S3053)的单体型：12/15/13/17/13/13/210/14/9与其姑妈和叔叔的相同(见图4)；来自祖父4号染色体上D4S2364/D4S2404的单体型：15/10也可从其姑妈和叔叔中找到；来自祖父17号染色体上(AC001348A/AC001348B/D17S975/D17S1294)的单体型：16/15/21/21可从叔叔中找到。单体型12/15/13/17/13/13/210/14/9和16/15/21/21上在本实验室中检测1000个无关个体仍未发现，故其频率小于0.001，15/10频率为0.1516，15个基因座分型为12/15/13/17/13/13/210/14/9/15/10/16/15/21/21的频率小于1.516*10-7，所以支持祖父与孙女的亲缘关系。
对于这一案例，由于可疑孙女的父亲与其姑妈、叔叔是同父异母的，其亲奶奶和父亲均不在人世，故爷爷与孙女的认定无法应用Y-STR或X-STR进行，只能依靠常染色体STR，但对于不连锁的STR，由于STR的遗传背景，表现为很多STR的等位基因频率大于0.125或更高的0.25，此值大于三级亲属具有12.5％或二级亲属有25％相同等位基因的值，因而无法将二级亲属、三级亲属或是无关个体区分开，故无法进行亲缘关系鉴别。本发明研制的15个紧密连锁STR复合扩增体系正可以弥补不连锁的STR的不足，紧密连锁STR组单体型的多态性极高，可克服常规非连锁STR多态性不高和遗传背景的干扰，突破目前不能鉴定二级以上亲缘关系和区别不同亲缘关系的难题。
实施例2：
用本发明的15个连锁STR复合扩增体系检测四代家系共有19人，证实连锁STR的连锁组按单体型遗传情况。
具体鉴定过程采用前述的操作步骤：DNA提取——PCR扩增——PCR扩增产物电泳——结果分析。
结果解析如图5、图6和图7所示，从图可知15个AS-STR基因座的组成的7个连锁群(Ⅰ：D3S2402-D3S2452-D3S1766；Ⅱ：D3S4554-D3S2388；Ⅲ：D3S4551-D3S2422；Ⅳ：D3S3051-D3S3053；Ⅴ：D4S2364-D4S2404；Ⅵ：AC001348A-AC001348B；Ⅶ：D17S975-D17S1294)在三代或四代中稳定遗传。
图5中，4号染色体上的连锁STR(D4S2364-D4S2404)按单体型在四代家系中稳定地遗传(如19个体的单体型7/12是由曾外祖父通过一代代传下来的，单体型6/15由祖母通过父亲传下来的)
图6中，17号染色体上的连锁STR AC001348A-AC001348B-D17S975-D17 S1294单体型在三代家系中稳定地遗传(如个体17的单体型17/14/20/19是由外祖父遗传给母亲传下来的；个体18的单体型14/13/20/19是由外祖母遗传给母亲传下来的；个体19的单体型13/13/21/19是由外祖父遗传给母传下来的，单体型15/13/21/22祖母遗传给父亲传下来的)
图7中，3号染色体上的4组连锁群(Ⅰ：D3S2402-D3S2452-D3S1766；Ⅱ：D3S4554-D3S2388；Ⅲ：D3S4551-D3S2422；Ⅳ：D3S3051-D3S3053)按单体型在四代家系中稳定地遗传。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  中山大学
 
<120>  AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系及应用
 
<130> 
 
<160>  30   
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D3S2402引物1
 
<400>  1
cctgggcaac ataatgagat                                                   20
 
 
<210>  2
<211>  23
<212>  DNA
<213>  D3S2402引物2
 
<400>  2
tggacaaagc attttataat ctg                                               23
 
 
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D3S2452引物3
 
<400>  3
gcttgcagat agcagatcgt                                                   20
 
 
<210>  4
<211>  22
<212>  DNA
<213>  D3S2452引物4
 
<400>  4
tataagatta gtcagggctc gc                                                22
 
 
<210>  5
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D3S1766引物1
 
<400>  5
accacatgag ccaattctgt                                                   20
 
 
<210>  6
<211>  22
<212>  DNA
<213>  D3S1766引物2
 
<400>  6
acccaattat ggtgttgtta cc                                                22
 
 
<210>  7
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D3S4554引物1
 
<400>  7
caatacgggc tgatgatagg                                                   20
 
 
<210>  8
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D3S4554引物2
 
<400>  8
tggaaatgct cccatagatt                                                   20
 
 
<210>  9
<211>  21
<212>  DNA
<213>  D3S2388引物1
 
<400>  9
tccactcagt acaagtctgg g                                                 21
 
 
<210>  10
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D3S2388引物2
 
<400>  10
gatcctgtgg tttgtcgatc                                                   20
 
 
<210>  11
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D3S4551引物1
 
<400>  11
agtcattgtc aggcattggt                                                   20
 
 
<210>  12
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D3S4551引物2
 
<400>  12
atatgacctt gggcaacaaa                                                   20
 
 
<210>  13
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D3S2422引物1
 
<400>  13
gttcaccatc tacagtgggc                                                   20
 
 
<210>  14
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D3S2422引物2
 
<400>  14
gttcaccatc tacagtgggc                                                   20
 
 
<210>  15
<211>  23
<212>  DNA
<213>  D3S3051引物1
 
<400>  15
ggcaattagt tatgtagcaa tcg                                               23
 
 
<210>  16
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D3S3051引物2
 
<400>  16
tgagtcaatt gtgctggcta                                                   20
 
 
<210>  17
<211>  25
<212>  DNA
<213>  D3S3053引物1
 
<400>  17
tctttgctct catgaataga tcagt                                             25
 
 
<210>  18
<211>  24
<212>  DNA
<213>  D3S3053引物2
 
<400>  18
gtttgtgata atgaacccac tcag                                              24
 
 
<210>  19
<211>  23
<212>  DNA
<213>  D4S2364引物1
 
<400>  19
aacaaaacta ggagatcatg tgg                                               23
 
 
<210>  20
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D4S2364引物2
 
<400>  20
accttgactt tgatgtggga                                                   20
 
 
<210>  21
<211>  25
<212>  DNA
<213>  D4S2404引物1
 
<400>  21
atatatatga tgcatgtcaa aatgg                                             25
 
 
<210>  22
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D4S2404引物2
 
<400>  22
ctgggcaaac tcatttcaac                                                   20
 
 
<210>  23
<211>  25
<212>  DNA
<213>  AC001348A引物1
 
<400>  23
caaccatcag tgatttgatg gttta                                             25
 
 
<210>  24
<211>  25
<212>  DNA
<213>  AC001348A引物2
 
<400>  24
ctgttcttct taatccttaa ccagt                                             25
 
 
<210>  25
<211>  25
<212>  DNA
<213>  AC001348B引物1
 
<400>  25
tctcagtcct gatttcttga ttttg                                             25
 
 
<210>  26
<211>  21
<212>  DNA
<213>  AC001348B引物2
 
<400>  26
ccagagctaa caccacattc a                                                 21
 
 
<210>  27
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D17S975引物1
 
<400>  27
agtaatggga cttctcggct                                                   20
 
 
<210>  28
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D17S975引物2
 
<400>  28
taggatccca agtgtgcagt                                                   20
 
 
<210>  29
<211>  20
<212>  DNA
<213>  D17S1294引物1
 
<400>  29
tggcatgcaa ttgtagtctc                                                   20
 
 
<210>  30
<211>  25
<212>  DNA
<213>  D17S1294引物2
 
<400>  30
ttctttcctt actaagttga gaacg                                             25
 
 

Claims (5)

1.AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系，该复合扩增体系共包含15个基因座：D3S2402, D3S2452, D3S1766, D3S4554, D3S2388, D3S4551、D3S2422、D3S3051, D3S3053, D4S2364, D4S2404, AC001348A, AC001348B, D17S975 和 D17S1294；所述15个基因座引物分别用FAM、HEX、TAM或ROX四种荧光素标记；FAM荧光素标记D17S1294、D3S4551、D4S2404和D3S3053，HEX荧光素标记AC001348B、 AC001348A、D3S2422和D3S4554，TAMRA荧光素标记D3S2388、 D3S2452、 D3S1766和D17S975，ROX荧光素标记D4S2364、D3S3051和D3S2402；其中扩增引物对分别为：
D3S2402引物对：
F: CCTGGGCAACATAATGAGAT，
R: TGGACAAAGCATTTTATAATCTG；
D3S2452引物对：
F: GCTTGCAGATAGCAGATCGT，
R: TATAAGATTAGTCAGGGCTCGC；
D3S1766引物对：
F: ACCACATGAGCCAATTCTGT，
R: ACCCAATTATGGTGTTGTTACC；
D3S4554引物对：
F: CAATACGGGCTGATGATAGG，
R: TGGAAATGCTCCCATAGATT；
D3S2388引物对：
F: TCCACTCAGTACAAGTCTGGG，
R: GATCCTGTGGTTTGTCGATC；
D3S4551引物对：
F:AGTCATTGTCAGGCATTGGT，
R:ATATGACCTTGGGCAACAAA；
D3S2422引物对：
F:ACTGAGAAAGTCTTTCTGTGCC，
R:GTTCACCATCTACAGTGGGC；
D3S3051引物对：
F: GGCAATTAGTTATGTAGCAATCG，
R: TGAGTCAATTGTGCTGGCTA；
D3S3053引物对：
F: TCTTTGCTCTCATGAATAGATCAGT，
R: GTTTGTGATAATGAACCCACTCAG；
D4S2364引物对：
F: AACAAAACTAGGAGATCATGTGG，
R: ACCTTGACTTTGATGTGGGA；
D4S2404引物对：
F: ATATATATGATGCATGTCAAAATGG，
R: CTGGGCAAACTCATTTCAAC；
AC001348A引物对：
F: CAACCATCAGTGATTTGATGGTTTA，
R: CTGTTCTTCTTAATCCTTAACCAGT；
AC001348B引物对：
F: TCTCAGTCCTGATTTCTTGATTTTG，
R: CCAGAGCTAACACCACATTCA；
D17S975引物对：
F: AGTAATGGGACTTCTCGGCT，
R: TAGGATCCCAAGTGTGCAGT；
D17S1294引物对：
F: TGGCATGCAATTGTAGTCTC，
R: TTCTTTCCTTACTAAGTTGAGAACG。
2.如权利要求1所述的AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系，其特征在于，所述15个AS-STR基因座组建7个连锁群，分别是：Ⅰ：D3S2402-D3S2452-D3S1766; Ⅱ： D3S4554-D3S2388; Ⅲ：D3S4551-D3S2422；Ⅳ：D3S3051-D3S3053; Ⅴ： D4S2364-D4S2404;  Ⅵ：AC001348A-AC001348B; Ⅶ：D17S975-D17S1294。
3.权利要求1或2所述的AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系在认定亲缘关系鉴定中的应用。
4.权利要求1或2所述的AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系在对常染色体相关性遗传病进行产前诊断的检测中的应用。
5.一种试剂盒，包括权利要求1或2所述的AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系中的扩增引物对的混合物。
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