CN104894295A - 基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法 - Google Patents

基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，属于化学及生物医学领域。具体步骤如下：合成甲硫氨酸类似物-叠氮甲硫氨酸及脱氧胸苷类似物-乙烯脱氧尿苷；将病毒加入宿主细胞进行侵染，之后分别加入叠氮甲硫氨酸和乙烯脱氧尿苷，利用核酸和蛋白质的生物合成过程实现了病毒核酸的乙烯基衍生和蛋白的叠氮基衍生；进而通过两个生物正交反应：四嗪—烯烃之间的Diels–Alder反应以及叠氮-环辛炔之间的无铜催化点击化学反应，自然地实现了病毒的核酸和蛋白的双重荧光标记。此标记方法简便、可靠，且可以应用于所有DNA病毒：包括单链DNA病毒和双链DNA病毒，以及包膜病毒和非包膜病毒，是一种绝对意义上的普适性病毒荧光标记方法。

Description

基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法
技术领域
本发明涉及一种基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，属于化学及生物医学领域。
背景技术
病毒荧光标记对于病毒侵染过程和机制研究至关重要。理想的病毒标记要在确保病毒活性的前提下实现病毒单颗粒可视化，目前采用的方法主要集中于利用荧光蛋白进行标记或直接使用染料分子进行标记。然而这两类方法都有明显不足，比如，有的有机染料标记方法需要对病毒进行修饰和分离纯化，会降低病毒活性，并且对病毒内部结构的标记效果差，而那些直接将有机染料嵌入病毒结构中的方法由于染料分子容易脱落而信号不稳定；荧光蛋白的构建步骤比较繁琐，且荧光蛋白的大量表达会影响病毒的结构和功能，病毒的目标蛋白与荧光蛋白融合后其表达水平可能下降并影响其他组分的结构，而且不是每种病毒都可以通过荧光蛋白进行标记。
利用温和高效的生物正交反应和病毒自然的生命活动过程进行活病毒高效稳定的标记是当前的新思路和新策略。Bi-Hai Huang等(ACS Chem.Biol.2012)报道了一种利用磷脂的代谢交换嵌入过程进行病毒包膜的生物素化，之后利用链霉亲和素修饰的量子点，通过生物素-亲和素共价体系实现了病毒包膜的荧光标记，该方法简单快速，然而只适用于病毒包膜的单荧光标记。我们课题组在分别建立基于无铜催化点击化学反应的病毒包膜标记方法(Anal.Chem.2012)和基于核酸分子光开关钌多吡啶配合物的病毒核酸标记方法(Chem.Commun.2012)的基础上，结合细胞内胆碱磷脂的合成和代谢交换嵌入过程实现了病毒包膜的叠氮基衍生，并在宿主细胞内，在病毒自然的复制组装过程中实现了病毒核酸和包膜的双重标记(Anal.Chem.2013)，避免了繁琐和破坏性很强的病毒额外修饰和精细的分离纯化操作，可在最大程度上保持病毒的活性。然而上述方法也都存在一定局限性：钌多吡啶配合物只适用于双链DNA病毒的核酸标记，胆碱磷脂类似物只适用于包膜病毒的标记。所以拓展这种顺应自然的病毒标记新思路和新策略，探索更可靠、简便、普适性的病毒标记方法仍是一个待解决的重要生物医学课题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有病毒标记方法不但操作繁琐，还无法保证病毒的感染力和病毒活性，普适性不够强等问题，提供一种基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，该方法更加简便、可靠，普适性更强。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的。
基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，具体步骤如下：
步骤一、合成甲硫氨酸类似物---叠氮甲硫氨酸(azidohomoalanine，AHA)及脱氧胸苷类似物---乙烯脱氧尿苷(5-Vinyl-2'-deoxyuridine，VdU)；
步骤二、将病毒加入含有宿主细胞的培养液中进行侵染，待病毒完全侵染宿主细胞，即宿主细胞发生病变的时候，加入叠氮甲硫氨酸与乙烯脱氧尿苷，得到细胞A；利用核酸和蛋白质的生物合成过程实现了病毒核酸的乙烯基衍生和蛋白的叠氮基衍生。
步骤三、向步骤二所得的细胞A中加入荧光探针---四嗪化的Cy5(Tetrazine-Cy5)，通过四嗪-烯烃之间的Diels-Alder反应得到核酸被荧光标记的子代病毒B；向所得的子代病毒B中加入荧光探针---环辛炔化的Flour 525(DBCO-Flour 525)；通过叠氮-环辛炔之间的无铜催化点击化学反应得到包膜蛋白被荧光标记的子代病毒，即实现了病毒的核酸和蛋白的双重荧光标记。
有益效果
1、本发明的基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，针对现有技术不但操作繁琐，还无法保证病毒的感染力和病毒活性的问题，合成叠氮甲硫氨酸及乙烯脱氧尿苷，这两种物质与甲硫氨酸及脱氧胸苷结构极其相似，可直接通过生物自身的合成嵌入病毒的蛋白质及核酸中。操作简便，快速，特异性好，且对病毒的活性影响小。
2、本发明的基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，可以应用于所有DNA病毒，包括单链DNA病毒和双链DNA病毒，以及包膜病毒和非包膜病毒，是一种绝对意义上的普适性病毒荧光标记方法。
3、本发明的基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，可推广应用于其他的生物荧光标记，包括细胞类、菌类、病毒类等所有含DNA和蛋白质的生物荧光标记。
附图说明
图1为本发明的基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法的流程示意图；
图2为本发明合成的叠氮甲硫氨酸的氢谱图；
图3为本发明合成的叠氮甲硫氨酸的碳谱图；
图4为本发明合成的乙烯脱氧尿苷的氢谱图；
图5为本发明合成的乙烯脱氧尿苷的质谱图；
图6为本发明通过荧光探针Tetrazine-Cy5以及DBCO-Flour 525分别检测子代病毒核酸衍生的乙烯基和蛋白衍生的叠氮基的荧光成像；
图7为本发明通过四嗪-烯烃之间的Diels-Alder反应以及叠氮-环辛炔之间的无铜催化点击化学反应，自然地实现了病毒的一步核膜双重荧光标记的荧光成像；
图8为本发明核膜双重荧光标记的病毒侵染宿主细胞的免疫荧光成像；
图9为本发明核膜双重荧光标记的病毒与未修饰的病毒侵染宿主细胞不同时间点，检测病毒感染力的荧光成像。
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明进行进一步说明。
实施例1
基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，具体步骤如下，如图1所示：
步骤一、合成甲硫氨酸类似物---叠氮甲硫氨酸(azidohomoalanine，AHA)及脱氧胸苷类似物---乙烯脱氧尿苷(5-Vinyl-2'-deoxyuridine，VdU)；
合成叠氮甲硫氨酸的方法为：逐滴向含NaN3的水溶液中加入蒸馏后的三氟甲磺酸酐，室温搅拌反应2h；产物用二氯甲烷萃取两次；同时，将水与甲醇加入装有转子的圆底烧瓶，之后加入Boc-Dab(叔丁氧羰基-L-2,4-二氨基丁酸)，KCO3和催化剂CuSO4·5H2O；将萃取得到的叠氮化的三氟甲磺酸酐，逐滴加入上述反应液中，室温搅拌过夜；将反应物40℃旋蒸，去除甲醇和二氯甲烷；加入盐酸，调PH为3，并用乙酸乙酯萃取2次；产物用饱和NaCl溶液洗涤，并加入干燥剂除水，之后用滤纸过滤。将产物40℃旋蒸，去除乙酸乙酯；加入浓HCl，以脱去Boc保护基；用水稀释溶液，并用阳离子交换树脂纯化产物；产物4℃冰箱放置过夜，抽滤收集叠氮甲硫氨酸结晶。如图2，3所示。通过上述反应步骤成功合成叠氮甲硫氨酸。
表征：图2，氢谱：1H NMR(400MHz,D2O)δ2.167-2,239(m,2H),3.669(m,2H),3.920(t,J＝6.3Hz,1H)p.p.m；
图3，碳谱：13C NMR(100MHz,D2O)δ29.075(CH2),46.959(CH2),52.331(CH),173.662。
合成乙烯脱氧尿苷的方法为：碘代脱氧尿苷，二(三苯基膦)-钯(II)-二氯),用氩气脱气30min；加入三正丁基锡及四氢呋喃超干溶剂，氩气脱气30min；磁力搅拌，30℃反应48h。之后用硅藻土过滤，甲醇洗涤；产物通过真空旋蒸去除甲醇；通过硅胶柱层析(二氯甲烷：乙腈：甲醇＝70：25：5)分离获得黄色油状物。产物再溶于甲醇，加入Sn/Pd金属清除剂室温处理4h；滤掉沉淀，重复上述清除步骤。之后进行第二次硅胶柱层次分离(乙酸乙酯：甲醇：氨水＝97：2.7：0.3)得到的产物为白色固体。如图4，5所示。通过上述反应步骤成功合成乙烯脱氧尿苷。
表征：图4，氢谱：NMR[(CD3/2SO]δ11.423(1H,bs,N-H),8.124(1H,s,H-6),6.352(1H,dd,vinylic H-l"),6.158(1H,t,H-l'),5.940(1H,dd,vinylicH-2"),5.259-5.13(3H,m,vinylic H-2",OH-3'and OH-5'),4.255(1H,m,H-3'),3.787(1H,m,H-4'),3.619-3.587(2H,m,H-5'),2.138-2.129(2H,t,H-2')；
图5，质谱：乙烯脱氧尿苷的分子量为：254；[M+H]+：255；[M+Na]+：277
本次试验的结果：本发明的基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，通过化学方法成功合成了甲硫氨酸类似物---叠氮甲硫氨酸及脱氧胸苷类似物---乙烯脱氧尿苷，具体表征结果如图2-5所示。
步骤二、将病毒加入含有宿主细胞的培养液中进行侵染，待病毒完全侵染宿主细胞，即宿主细胞发生病变的时候，加入叠氮甲硫氨酸与乙烯脱氧尿苷，得到细胞A；利用核酸和蛋白质的生物合成过程实现了病毒核酸的乙烯基衍生和蛋白的叠氮基衍生。
衍生后的病毒纯化的具体操作步骤：将病毒侵染的宿主细胞置于-80℃冰箱内在室温/-80℃冰箱反复冻融3-4次；将病毒液收集于无菌离心管中，4℃，4500rpm离心30min去细胞碎片，离心结束后弃沉淀留上清；将上清加入到含36％蔗糖溶液的type70离心管中，4℃，80000g，离心2h，离心结束后弃上清，用0.01M磷酸缓冲液重悬沉淀；将上述重悬的病毒液缓慢加到含40％-60％蔗糖溶液的密度梯度柱中，4℃，58000g，离心1.5h，取出病毒条带加到含PBS的离心管中，4℃，80000g，离心1.5h；加入200μL，PBS重悬沉淀，重复3次，重悬液放入-80℃冰箱保存。
衍生后的病毒的荧光标记，以检测病毒核酸的乙烯基衍生和蛋白的叠氮基衍生情况。具体操作步骤：将纯化得到的野生型和乙烯脱氧尿苷或叠氮甲硫氨酸衍生后的病毒分别滴于抗体包被的玻片上，37℃反应1h,用PBS洗两次；将玻片置于酒精灯烤干，浸于含PBS的皿中；吸去皿中液体，加入Tetrazine-Cy5(或DBCO-Flour 525)，37℃孵育1h；用PBS洗去多余的染料；将上述处理好的玻片取出，用滤纸吸干多余的液体；滴一滴抗荧光淬灭液于载玻片上；用指甲油将盖玻片的边缘与载玻片粘合；将玻片置于共聚焦显微镜下观察病毒核酸的乙烯基衍生和蛋白的叠氮基衍生情况。
本次试验的结果：本发明的基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，合成的叠氮甲硫氨酸及乙烯脱氧尿苷，可以利用核酸和蛋白质的生物合成过程，实现病毒核酸的乙烯基衍生和蛋白的叠氮基衍生；具体表征结果如图6A，B所示。病毒核酸衍生的乙烯基与病毒核酸的共定位效率可达到83％-96％(图6A)；病毒蛋白衍生的叠氮基与病毒核酸的共定位效率可达到80％-89％(图6B)。
步骤三、向步骤二所得的细胞A中加入荧光探针---四嗪化的Cy5(Tetrazine-Cy5)，通过四嗪-烯烃之间的Diels-Alder反应得到核酸被荧光标记的子代病毒B；向所得的子代病毒B中加入荧光探针---环辛炔化的Flour 525(DBCO-Flour 525)；通过叠氮-环辛炔之间的无铜催化点击化学反应得到包膜蛋白被荧光标记的子代病毒，即实现了病毒的核酸和蛋白的双重荧光标记。
将核酸和包膜蛋白双重荧光标记的病毒，按照步骤二，病毒纯化的具体操作步骤进行纯化。
将纯化的未标记或核膜双重荧光标记的病毒，分别滴在病毒抗体包被的玻片上，37℃反应1h,用PBS洗两次；将上述处理好的玻片取出，用滤纸吸干多余的液体；滴一滴抗荧光淬灭液于载玻片上；用指甲油将盖玻片的边缘与载玻片粘合；将玻片置于共聚焦显微镜下，观察病毒核酸和包膜蛋白的共定位情况。具体实验结果如图7所示。
本次试验的结果：本发明的基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，合成的叠氮甲硫氨酸及乙烯脱氧尿苷，可以通过两个温和、高效的生物正交反应：四嗪-烯烃之间的Diels-Alder反应以及叠氮-环辛炔之间的无铜催化点击化学反应，自然地实现了病毒的核酸和包膜蛋白的双重荧光标记。标记的病毒共定位效率可达71％-88％。具体表征结果如图7所示。
实施例2
基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，具体步骤如下：
步骤一、合成甲硫氨酸类似物---叠氮甲硫氨酸(azidohomoalanine，AHA)及脱氧胸苷类似物---乙烯脱氧尿苷(5-Vinyl-2'-deoxyuridine，VdU)；
步骤二、将病毒加入含有宿主细胞的培养液中进行侵染，待病毒完全侵染宿主细胞，即宿主细胞发生病变的时候，加入叠氮甲硫氨酸与乙烯脱氧尿苷，得到细胞A；利用核酸和蛋白质的生物合成过程实现了病毒核酸的乙烯基衍生和蛋白的叠氮基衍生。
步骤三、向步骤二所得的细胞A中加入荧光探针---四嗪化的Cy5(Tetrazine-Cy5)，通过四嗪-烯烃之间的Diels-Alder反应得到核酸被荧光标记的子代病毒B；向所得的子代病毒B中加入荧光探针---环辛炔化的Flour 525(DBCO-Flour 525)；通过叠氮-环辛炔之间的无铜催化点击化学反应得到包膜蛋白被荧光标记的子代病毒，即实现了病毒的核酸和蛋白的双重荧光标记。
对结果表征：将纯化的未标记或核膜双重荧光标记的病毒分别加入种有宿主细胞的共聚焦小皿中，4℃吸附30min,用PBS洗一次；加入4％多聚甲醛(PFA)固定15min，PBS洗三次；用含5％BSA的PBS室温封闭30min；将抗病毒H3蛋白的抗体用含2％BSA的PBS按1:1000的比例稀释，并加入小皿，37℃孵育1h,PBS洗三次，每次5min；将Dylight 488标记的二抗用含2％BSA的PBS按1:1000的比例稀释并加入小皿中，37℃孵育1h,用PBS洗三次，每次5min；将Hoechst 33342稀释10000倍，室温标记细胞核15min，PBS洗三次；置于共聚焦显微镜下成像。具体实验结果如图8所示。
本次试验的结果：本发明的基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，经过核膜双标后，病毒仍可以有效地识别宿主细胞，并进行侵染。具体表征结果如图8所示。
实施例3
基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，具体步骤如下：
步骤一、合成甲硫氨酸类似物---叠氮甲硫氨酸(azidohomoalanine，AHA)及脱氧胸苷类似物---乙烯脱氧尿苷(5-Vinyl-2'-deoxyuridine，VdU)；
步骤二、将病毒加入含有宿主细胞的培养液中进行侵染，待病毒完全侵染宿主细胞，即宿主细胞发生病变的时候，加入叠氮甲硫氨酸与乙烯脱氧尿苷，得到细胞A；利用核酸和蛋白质的生物合成过程实现了病毒核酸的乙烯基衍生和蛋白的叠氮基衍生。
步骤三、向步骤二所得的细胞A中加入荧光探针---四嗪化的Cy5(Tetrazine-Cy5)，通过四嗪-烯烃之间的Diels-Alder反应得到核酸被荧光标记的子代病毒B；向所得的子代病毒B中加入荧光探针---环辛炔化的Flour 525(DBCO-Flour 525)；通过叠氮-环辛炔之间的无铜催化点击化学反应得到包膜蛋白被荧光标记的子代病毒，即实现了病毒的核酸和蛋白的双重荧光标记。
对结果表征：将相同浓度未标记或核膜双重荧光标记的病毒分别加入种有宿主细胞的孔板中，37℃侵染12h，24h，48h。病毒侵染宿主细胞过程中，会表达游离的绿色荧光蛋白(GFP)。通过荧光显微成像观察GFP的表达量，以检测病毒的感染力强弱。
本次试验的结果：本发明的基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，核膜双标的病毒对宿主细胞仍可保持与未修饰的病毒相当的感染力。具体表征结果如图9所示。
综上所述，发明的基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法。通过化学方法成功合成了甲硫氨酸类似物---叠氮甲硫氨酸(azidohomoalanine，AHA)及脱氧胸苷类似物---乙烯脱氧尿苷(5-Vinyl-2'-deoxyuridine，VdU)，具体表征结果如图2-5所示；将病毒加入宿主细胞进行侵染，之后分别加入叠氮甲硫氨酸和乙烯脱氧尿苷，利用核酸和蛋白质的生物合成过程实现了病毒核酸的乙烯基衍生和蛋白的叠氮基衍生，玻片荧光共定位成像表明，病毒核酸的乙烯基衍生与病毒核酸的共定位效率可达83％-96％，其蛋白的叠氮基衍生与病毒核酸的共定位效率可达80％-89％，具体表征结果如图6所示；进而通过生物正交反应：四嗪-烯烃之间的Diels-Alder反应以及叠氮-环辛炔之间的无铜催化点击化学反应，自然地实现了病毒的核酸和包膜蛋白的双重荧光标记，荧光标记的病毒核膜的共定位效率可达71％-88％，具体表征结果如图7所示；标记的病毒仍可以很好地识别宿主细胞，且表现出与未修饰病毒相当的感染力，具体表征结果如图8，9所示；此标记方法简便、可靠，且可以应用于所有的DNA病毒：包括单链DNA病毒和双链DNA病毒，以及包膜病毒和非包膜病毒，是一种绝对意义上的普适性病毒荧光标记方法。

Claims (1)

1.基于核酸和蛋白质生物合成的病毒双荧光标记新方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤一、合成甲硫氨酸类似物---叠氮甲硫氨酸及脱氧胸苷类似物---乙烯脱氧尿苷；
步骤二、将病毒加入含有宿主细胞的培养液中进行侵染，待病毒完全侵染宿主细胞，即宿主细胞发生病变的时候，加入叠氮甲硫氨酸与乙烯脱氧尿苷，得到细胞A；
步骤三、向步骤二所得的细胞A中加入荧光探针---四嗪化的Cy5，通过四嗪-烯烃之间的Diels-Alder反应得到核酸被荧光标记的子代病毒B；向所得的子代病毒B中加入荧光探针---环辛炔化的Flour 525；通过叠氮-环辛炔之间的无铜催化点击化学反应得到包膜蛋白被荧光标记的子代病毒，即实现了病毒的核酸和包膜蛋白的双重荧光标记。
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