CN104894145A - 一种乌克兰鳞鲤pepck基因及标定鲤科鱼类血糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因及标定鲤科鱼类血糖的方法，该基因的全长cDNA序列为：SQ1，标定鲤科鱼类血糖的方法，包括步骤：第一步，乌克兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列的确定，第二步，得出不同饲养条件下乌克兰鳞鲤各组织PEPCK基因的亮度，建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线；第三步，利用各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，对生产中的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定。本发明提出了一种全新的鲤科鱼类血糖标定方法，标定成本低，标定方法操作简单，标定结果可靠，减少了测定过程中易于感染的风险。

Description

一种乌克兰鳞鲤PEPCK基因及标定鲤科鱼类血糖的方法

技术领域

本发明属于分子生理检测技术领域，特别是一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因及标定鲤科鱼类血糖的方法。

背景技术

目前对于鲤科鱼类血糖水平的方法普遍采用GB-T19634-2005自测用血糖监测系统，或是采用市场上通用的葡萄糖氧化酶法，即测定血糖的试剂盒与试纸条，在鲤科鱼类养殖过程中，使用现有国标方法鉴定的总糖含量相同的饲料喂养鲤科鱼类时，各种饲料对鱼的血糖含量的影响是不同的。使用上述常规血糖测定法测定鲤科鱼类血糖含量，测量值灵敏度不高，而且会出现假阳性的情况，并且现有测量技术成本偏高，单次成本在4元以上，对于个体较小的鱼和观赏鱼等，血液组织采集困难，而对于大型鱼类、经济型鱼类的亲鱼，采血容易感染并造成经济损失，并且现有常规血糖测定法前处理过程复杂，因此，需要一种成本低，检测方便快捷的血糖水平测定方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因及标定鲤科鱼类血糖的方法。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因，该基因的全长cDNA序列为：SQ1。

一种应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，步骤如下：

第一步，乌克兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列的确定，包括步骤如下：

(一)制备乌克兰鳞鲤肝胰脏总RNA；

(二)合成第一链cDNA；

(三)PCR扩增PEPCK基因中间片段；

(四)3’RACE PCR及5’RACE PCR；

(五)琼脂糖电泳检测中间片段；

(六)制备感受态细胞；

(七)T-A克隆；

(八)转化感受态细胞；

(九)菌液PCR方法筛选阳性克隆；

(十)序列拼接，使用DNAStar软件中的EditSeq程序将乌克兰鳞鲤PEPCK基因中间序列的3’端序列和5’端序列的核苷酸数据使用软件将它们按顺序拼接起来，得到乌克兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列为：SQ1；

第二步，得出不同饲养条件下乌克兰鳞鲤各组织PEPCK基因的亮度，建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线，具体步骤如下：

(一)检测鱼类的饲养和取样

(1)饲养，取两个养殖箱冲洗干净后盛放好自来水，24小时连续曝气，将乌克兰鳞鲤每箱三条分别放入两个养殖箱中暂养，先在每天9点分别向两箱鱼中投喂低糖饲料，在15点更换养殖水体的三分之一，使其适应一周，然后禁食一天，再在第二天9点分别向两箱中投喂低糖饲料、高糖饲料，15点分别将低糖组和高糖组各三条鱼活体解剖；

(2)取样，将解剖鱼体肝胰脏、脑、肾脏、心脏、肌肉取出，记好标记存入液氮中备用，以进行后续试验；

(二)制备乌克兰鳞鲤各组织总RNA；

(三)合成低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织第一链cDNA；

(四)PCR确定低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织PEPCK、对比基因的表达量，建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，具体步骤为：

(1)PCR扩增内参基因，在冰上配制PCR反应体系，然后进行PCR反应程序；

(2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于-20℃备用；

(3)使用1％琼脂糖电泳检测内参基因PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电泳结果拍照；

(4)使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织内参基因的亮度比；

(5)按照上一步得出的亮度比调整各组织cDNA的添加量，以PEP-F和PEP-R作为引物进行半定量PCR；

(6)使用1％琼脂糖电泳检测各组织PEPCK基因PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电泳结果拍照；

(7)使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织PEPCK基因的亮度比；

(8)建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线；

第三步，利用各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，对生产中的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定。

而且，所述第二步的步骤(一)中低糖饲料各原料的质量分数为：鱼粉8％、豆粕15％、花生粕16％、棉粕8％、菜粕10％、DDGS3％、豆油4％、预混料1％、微晶纤维素25％及麸皮10％；高糖饲料各原料的质量分数为：鱼粉8％，豆粕15％，花生粕16％，棉粕8％，菜粕10％，DDGS3％，豆油4％，预混料1％，麸皮10％及糊精25％。

而且，所述第二步的步骤(四)中第(1)步在冰上配制PCR反应体系的组份为：

而且，所述第二步的步骤(四)中第(1)进行PCR反应程序的具体内容为：

而且，所述第二步的步骤(四)中第(5)的PEP-F和PEP-R的引物序列为：

SQ2：CTCAGCAGTCTGATATGAGA

SQ3：TTTGGGACATAGTTTGTAAAC。

而且，所述第二步的步骤(四)中第(8)步建立各组织PEPCK基因的半定量PCR扩增条带亮度与鱼血糖值的对应曲线的具体步骤为：

①将鲤鱼进行不同含糖量的饲料饲喂实验：高糖组，低糖组，禁食组；

②获得三个组别鲤鱼的血样并进行常规血糖检测；

③对三个组别的鲤鱼进行非血组织取样，并分别进行RNA抽提并反转录为cDNA，以cDNA为模板，SQ2与SQ3为引物进行PEPCK基因的半定量PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并使用紫外摄像系统检测扩增目的条带亮度值；

④将三个组别的血糖值与相应的PEPCK基因目的条带亮度值在直方图上进行描点并连线建立二者的对应曲线模型，建立曲线后根据相应的亮度值从曲线上查出相应的血糖值，为了得到更精确的血糖值，对曲线的描点进行细化。

而且，所述第三步的步骤(四)中第(9)步对生产中的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定的具体步骤为：

①选取待检测鱼，获得非血液组织中的鳞片根部肌肉组织为样品，按照权利要求2中所述第二步的步骤(二)至步骤(四)的(7)步得出检测鱼各组织PEPCK基因的亮度值；

②利用PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线，最终确定该被检测鱼的血糖值。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明对鲤科鱼类血糖水平的测定，对于成百上千的大样本量统计学实验和检测，能够节省大量的人力以及物料成本，测定成本低，单次测定成本在1元以下。

2、本发明的测定方法操作简单，采用非血液组织中的鳞片根部肌肉组织的取样对鱼体造成的创伤最小，不易感染，更不用处死样本，这种取样方法对珍惜样品，如大型观赏鱼和经济鱼类的亲本身体指标的连续观察尤为重要，降低了取样的难度，减少了测定过程中易于感染的风险

附图说明

图1是不同喂食条件下乌克兰鳞鲤PEPCK各组织表达特征，其中，内参为β-actin基因；

图2是不同喂食条件PEPCK表达量所对应标定的鱼血糖值。

具体实施方式

以下对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因及标定鲤科鱼类血糖的方法，该方法包括步骤如下：

第一步，制备乌克兰鳞鲤肝胰脏总RNA

(一)抽提乌克兰鳞鲤肝胰脏总RNA

(1)将禁食的健康乌克兰鳞鲤用解剖剪活体解剖，快速用镊子取出肝胰脏组织；

(2)取100mg组织置于5ml组织匀浆器中加入1ml裂解液RNAiso Plus，放置在冰上匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状；

(3)将匀浆液转移至已经用DEPC处理好的1.5ml RNasefree离心管中，室温静置5min；

(4)12000g，4℃离心5min；

(5)小心吸取上清液，移入新的RNasefree离心管中，切勿吸取沉淀；

(6)加入200μl氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s,待溶液充分乳化后，再室温静置5min；

(7)12000g,4℃离心15min

(8)从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相三层，吸取上清液转移至另一DEPC处理过的离心管中，切忌吸出白色中间层；

(9)向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10min；

(10)12000g,4℃离心10min，离心完成后，试管底部出现白色沉淀；

(11)小心地弃去上清液，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml，切勿触及沉淀，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g,4℃离心5min后小心地弃去乙醇，尽量将其除净；

(12)室温干燥沉淀2～5min,加入20μlDEPC处理水充分溶解RNA，置于-20℃保存用于后续试验；

(二)检测RNA质量

(1)将电泳槽等检测设备依次用浓度为3％的H₂O₂和浓度为0.1％的DEPC水清洗处理，晾干待用；

(2)配制1％琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖，加入20ml 1×TAE缓冲液，摇匀使之充分溶解，加热使混合液呈熔融状态，稍微冷却后加入2ulEB溶液，轻轻混匀，倒入到制胶槽中使其凝固；

(3)取配好的1％琼脂糖凝胶，放入充满1×TAE缓冲液的电泳槽中；

(4)使用10μl单道可调量程移液器加样，取5μl所提取的RNA，另取1μl6×DNA电泳LoadingBuffer与RNA混匀，加入凝胶加样孔中；

(5)在实验样品右边的剩余加样孔道中加入5μl DL2000 DNA Marker；

(6)打开电泳仪，电压调至130V，电泳时间15min；

(7)使用凝胶成像分析系统对电泳结果进行拍照；

(8)使用微量分光光度计测定RNA的浓度；

第二步，合成第一链cDNA

(1)在已用DEPC处理过的0.2ml离心管中配制下列RNA和引物的混合液：

(2)65℃水浴5min后,迅速在冰上急冷；

(3)在上述离心管中继续配制以下反转录反应液：

(4)在PCR仪上42℃保温60min；

(5)在PCR仪上95℃保温5min；

(6)随即将反转录产物置于冰上冷却，然后进行下一步反应或存于-20℃备用；

第三步，PCR扩增PEPCK基因中间片段，

(1)按照下列组份，在冰上配制PCR反应体系：

PCR反应程序：

(2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于-20℃备用

第四步，3’RACE PCR

(一)RACE反应，

(1)在已用DEPC处理过的0.2ml离心管中配制下列反转录的反应液：

(2)在PCR仪上42℃保温60min；

(3)在PCR仪上70℃保温15min；

(4)随即将反转录产物置于冰上冷却，然后进行下一步反应或存于-20℃备用；

(二)PCR反应

(1)按照下列组份，在冰上配制PCR反应体系：

PCR反应程序：

(2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于-20℃备用；

第五步，5’RACE PCR

(一)5’RACE反应

(1)在已用DEPC处理过的0.2ml离心管中配制下列RNA和引物的混合液：

(2)65℃水浴5min后,迅速在冰上急冷2min；

(3)在上述离心管中继续配制以下反转录反应液：

(4)在PCR仪上37℃孵育1h；

(5)随即将反转录产物置于冰上冷却，然后进行下一步反应或存于-20℃备用；

(二)PCR反应

(1)按照下列组份，在冰上配制PCR反应体系：

(2)PCR反应程序：

(3)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于-20℃备用；

第六步，琼脂糖电泳检测中间片段，

(一)3’RACE和5’RACE PCR扩增结果

(1)取配制好的1％琼脂糖凝胶(在配制琼脂糖凝胶时加入2ulEB溶液)，放入充满1×TAE缓冲液的电泳槽中；

(2)使用10μl单道可调量程移液器，分别从以上三个PCR管中取5μl扩增产物，另取1μl6×DNA电泳Loading Buffer与PCR扩增产物DNA混匀，加入凝胶孔中；

(3)在与(2)所述凝胶孔右边相邻的两个凝胶孔中依次加入阴性对照扩增产物和5μlDL2000 DNA Marker；

(4)打开电泳仪，电压调至120V，电泳时间20min；

(5)使用凝胶成像分析系统对电泳结果进行拍照，中间片段条带长度约1000bp，3’端片段条带长度约1200bp，5’端片段条带长度约750bp；

(二)回收纯化PCR产物

按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作进行DNA回收和纯化，具体步骤为：

(1)在漂洗液PW中加入无水乙醇60ml，

(2)柱平衡步骤：将吸附柱CA2放入到一个收集管中，并在吸附柱中加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(3)在紫外灯下，用解剖刀小心将目的条带切下(尽量切除多余部分)，将其盛入1.5ml无菌离心管中，称取重量，

(4)向胶块中加入等倍体积溶液PN，50℃水浴放置,其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，可以再补加一些胶溶液，直至胶块完全溶解；

(5)将胶块完全溶解后的溶液温度降至室温，然后加入到一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；

(6)向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；

(7)重复操作步骤(6)

(8)将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸，附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；

(9)将吸附柱CA2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μlddH₂O,室温放置2min，12000rpm离心2min；

(10)将离心得到的溶液重新加回吸附柱中，室温放置2min,12000rpm离心2min，将DNA溶液收集到离心管中；

第七步，制备感受态细胞

(1)在LB固体培养基上将保藏于-20℃的大肠杆菌(E.coli)进行划线，并放入恒温培养箱于37℃培养过夜；

(2)在LB平板上挑取单菌落，加入4ml的LB液体培养基中，置于空气摇床中于37℃震荡培养过夜；

(3)将上一步培养好的菌液取出1ml，加入到100mlLB液体培养基中并置于空气摇床中于37℃震荡培养数小时，直至用紫外分光光度计测定其OD₆₀₀值为0.5

(4)将上一步培养好的菌液置于冰上5min；

(5)将菌液倒入到两个50ml的塑料离心管中，4℃,5000rpm离心5min；

(6)将上清液弃去，迅速将装有沉淀的离心管置于冰上待用；

(7)向每个离心管中加入预冷的0.1mol/L的CaCl₂各10ml，轻轻用手在冰上摇动30min以上，直至沉淀全部溶解；

(8)重复操作步骤(6)，弃上清，并向每个离心管加入2ml预冷的含15％甘油的0.1mol/LCaCl₂

(9)向每个1.5ml的灭菌离心管中分装100μl的感受态细胞，然后直接放入液氮中，等到响声消失后放置-80℃冰箱储存；

第八步，T-A克隆

在0.2ml的灭菌离心管中配制以下溶液：

室温孵育1h,然后放入4℃冰箱过夜；

第九步，转化感受态细胞

(1)取一管100μl的感受态细胞置于冰浴中，然后将上述连接产物加入到感受态细胞中，并用枪头轻轻搅拌混匀内容物，在冰浴中静置30min；

(2)将离心管置于42℃水浴中放置60sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3min，该过程不要摇动离心管；

(3)向离心管中加入900μl无菌不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于空气摇床中于37℃，170rpm/min震荡培养45min，为了使质粒上相关的抗性基因表达，使菌体复苏；

(4)将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的感受态细胞加到含氨苄青霉素、X-gal、IPTG的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻地将细胞均匀涂开，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，放入恒温培养箱37℃避光培养16h；

第十步，菌液PCR方法筛选阳性克隆

观察上述平板中菌落的颜色，蓝斑为阴性，白斑一般为阳性，为确定白斑的确为阳性，一般将平板拿出后放置4℃冰箱中一段时间甚至过夜，再看菌落的颜色，挑选白色菌落进行PCR检测；

用已灭菌的牙签挑取10个白色菌落，对应接种至10个含氨苄青霉素(50μg/ml)的1mlLB液体培养基的1.5ml离心管中并将其标号，置于空气摇床中于37℃，170rpm/min震荡培养6h左右，然后进行菌液PCR：

(1)按照下列组分在冰上配制PCR反应体系：

PCR反应程序：

a.扩增PEPCK基因中间片段的PCR反应程序为：

b.扩增PEPCK基因3’端片段的PCR反应程序为：

c.扩增PEPCK基因5’端片段的PCR反应程序为：

(2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于-20℃备用

(3)琼脂糖电泳检测菌液PCR扩增结果

①取配制好的1％琼脂糖凝胶(在配制琼脂糖凝胶时加入2ulEB溶液)，放入充满1×TAE缓冲液的电泳槽中；

②使用10μl单道可调量程移液器加样，按照标号顺序分别从每个PCR管中取5μl PCR扩增产物DNA，另取1μl 6×DNA电泳Loading Buffer与PCR扩增产物DNA混匀，加入凝胶孔中；

③在与⑵所述凝胶孔右边相邻的两个凝胶孔中依次加入阴性对照扩增产物和5μlDL 2000DNA Marker；

④打开电泳仪，电压调至120V，电泳时间20min；

⑤使用凝胶成像分析系统对电泳结果进行拍照，记下长度正确的条带所对应的1.5ml离心管号，这几管菌液即为阳性，选取一管菌液送去苏州金唯智生物科技(北京)有限公司测序；

第十一步，序列拼接

使用DNAStar软件中的EditSeq程序将乌克兰鳞鲤PEPCK基因中间序列、3’端序列和5’端序列的核苷酸数据使用软件将它们按顺序拼接起来，得到乌克兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列为：SQ1,

ATCACACTCAGCAGTCTGATATGAGAGGTGCACAGGACTGAAGAGGAACAAGACACACCTCTCATATTGCTTTATTATATTTTTAGTCATAATTTCGGTTGTTTACTCACCACCTGCACTTGCACCAAAGATGTCCTGCCTGTTCCTCGGAGTACTAAGGTGGCGAAATGTCATCAGTACAGCTTCAGTGGGGGTGCGGTCACTCGCCTCCATCCCCTCTCTGCCACCGTCAGTGGCGGAGTTTGTGTCAGGTGCTGTGGCTGAATGTAAACCTGCTAAAGTGCACGTGGTCACAGGCACTCCAGAGGAGACAGCAGACATCCTGGCCAACCTGGAGAAAGATGGCATGGTGAAGAAACTCGCCAAATATGAAAACTGCTGGCTGGCACGCACTGACCCCAAAGATGTGGCTCGTGTAGAGAGTAAAACTGTGATTGTCACTAAGGACCAAAGAGACACTATTCCCATTCCCACCGGAGGTGCCAAGTCCCAGCTGGGCAGCTGGATGAGTGAGGAAACCTTTCAGAAAGCCAGAGAGGACCGCTTTCCTGGCTGCATGGCGGGACGCACCATGTATGTGATCCCCTTCAGCATGGGCCCTGTGAACTCTTCTCTTGCTAAGTTTGGTGTTCAGGTGACAGATTCTCCATATGTGGTGGCTAGCATGGGCATCATGACACGCATGGGGACTCCTGTGCTGGAAAAACTAGCCGAGGGTGCGGAGTTTGTGCGCTGCCAGCACTCTTTGGGCAGACCTTTACCACTCAAAGCTCCTTTAGTAAACAGCTGGCCTTGTAACCCGGACAAGGTGTTGATCTCACATCTTCCTGACACCAGACAGATCCTGTCCTTCGGCAGCGGTTACGGTGGAAACTCGCTCCTTGGAAAGAAATGTTTTGCTCTTCGTATCGCCTCACGCATTGCCAAAGACGAAGGCTGGTTGGCTGAACACATGCTGATTCTGGGAATCACAAATCCTCAGGGTGTAAAACGGTACATTGCAGCAGCGTTCCCGAGCGCTTGTGGGAAAACTAACCTGGCCATGATGAAACCATCACTGCCAGGCTGGACGGTTGAGTGTGTGGGCGATGACATCGCCTGGATGAAATTTGACAGTCAGGGTAAACTCAGAGCCATTAATCCAGAGAATGGTTTTTTTGGAGTCGCCCCCGGGACATCCCTAAAGACAAACCCTCATGCCATGGCAACCATCTCCAGGAACACAGTGTTCACTAACGTGGGAGAGACCAGCGATGGAGGAGTTTGGTGGGAGGGTCTGGAACCACCTGCACCTGGAATCAAACTCACAGACTGGCATGGAAAATCCTGGAAGTATGGTGATCCTACACTGTGTGCTCACCCGAACTCCAGGTTTTGTGCCCCAGCTGGCCAGTGCCCCATCATAGACCCACTCTGGGAAAGTGATGAGGGCGTCCCCATTGATGCCATTGTATTTGGTGGAAGAAGACCAGAAGGTGTGCCTTTGGTGTACGAGTCATTTAACTGGAAACATGGCGTGTTTGTAGGAGCAGCCATGAAATCTGAATCCACAGCTGCTGCTGAACATAAGGGTAAAGTAATCATGCATGACCCCTTCGCCATGCGTCCTTTCTTCGGTTACAACTTCGGTGACTACTTGGCCCACTGGTTGAGTATGGAGACGCACAAGGGCCAGACCCAACTCCCCAAGATCTTCCACGTCAACTGGTTCCGTAAAGATCAGAAGACCGGGTCTTTCTTGTGGCCAGGGTTTGGAGAGAACGCCCGCGTCCTCGAGTGGATCTTCAAACGATGCGGCCGTACCAGTGAAGACGAGGCTGCCACCAAAAGCATTGTGGGATGGATTCCACAAAACGGTGCCATAAACACAGAAGGCCTGGGTGGAAATATCGATATGGGTGCCCTCTTTGACCTGCCCAAACCCTTCTGGCAGAAGGAAACACAAGAGCTTCGGACCTACTTCACCCAGCAGGTTGGAGCTGATCTGCCCGCACAAGTGGAAGGAGAGCTGAGGGCGCTGGAGGAGAGAGTGAGGGATTGAACAGACGCTACATTACATTGATGTTGAGCAGATGTGAAGAATAGGATGGGTTGAGGTGGAGATAACTGTTTTAATCTGACTGTTGCACTGCAGTGGACACTGCACCTGAGAAAACACAAAACCAAAAAGTTCACAAGATGCCATCAGTGGTATCGATACCTAGGTGCCTTATTTGATCTTACAGTAGAAGCTAAAAaCTCTATTAAATGTTTACAAACTATGTCCCAAAATGCCTTTTAGATTATTACTATAGTTTCTTTATTACTACAGTTTATTTTGAGCAAAGGTATTAGACATGTCTTTAAGGAGAGCACCAGTACCATCGTTTTTTACCTATCTAATGTAAGCTGAAGTTTTATTTCTAAAGATTTTGCCTTTTATCAGTGGAATTTGATTGACATGGATCAGGTTTAGCTAGGGTTGAAAGATCCAGACCAAAGAACACAGACAAGTCTCAGTCATTGAATGTGTGCATGTTTTTACATGAGCTGACTGAATAAATACAACTCTAAACCAAAAAAAAAAA

第十二步，半定量PCR

(一)饲养和取样

取两个养殖箱冲洗干净后盛放好自来水，24小时连续曝气，将乌克兰鳞鲤每箱三条分别放入两个养殖箱中暂养，先在每天9点分别向两箱鱼中投喂低糖饲料，在15点更换养殖水体的三分之一，使其适应一周，然后禁食一天，再在第二天9点分别向两箱中投喂低糖、高糖饲料，15点分别将低糖组和高糖组各三条鱼活体解剖，将肝胰脏、脑、肾脏、心脏、肌肉取出，记好标记存入液氮中备用，以进行后续试验；

其中，低糖饲料各原料的质量分数

鱼粉8％，豆粕15％，花生粕16％，棉粕8％，菜粕10％，DDGS3％，豆油4％，预混料1％，微晶纤维素25％，麸皮10％，糊精0；

其中，高糖饲料各原料的质量分数

鱼粉8％，豆粕15％，花生粕16％，棉粕8％，菜粕10％，DDGS3％，豆油4％，预混料1％，微晶纤维素0，麸皮10％，糊精25％

(二)制备乌克兰鳞鲤各组织总RNA

(三)合成低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织第一链cDNA

(四)PCR确定低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织PEPCK、对比基因的表达量

(1)PCR扩增内参基因

①按照下列组份，在冰上配制PCR反应体系：

PCR反应程序：

②随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于-20℃备用；

③使用1％琼脂糖电泳检测内参基因PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电泳结果拍照；

④使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织内参基因的亮度比；

⑤按照上一步得出的亮度比调整各组织cDNA的添加量，以PEP-F和PEP-R作为引物进行半定量PCR；

⑥使用1％琼脂糖电泳检测各组织PEPCK基因PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电泳结果拍照

⑦使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织PEPCK基因的亮度比,对比结果如图1所示；

⑧建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线；

如，对乌克兰鳞鲤肾脏组织建立PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，如图2所示，具体如下：

①将鲤鱼进行不同含糖量的饲料饲喂实验：高糖组，低糖组，禁食组。

②获得三个组别鲤鱼的血样并进行常规血糖检测。

③对三个组别的鲤鱼进行非血组织取样，并分别进行RNA抽提并反转录为cDNA，以cDNA为模板，Q2与Q3为引物进行PEPCK基因的半定量PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并使用紫外摄像系统检测扩增目的条带亮度值。

④将三个组别的血糖值与相应的PEPCK基因目的条带亮度值在直方图上进行描点并连线建立二者的对应曲线模型。建立曲线后根据相应的亮度值从曲线上查出相应的血糖值。为了得到更精确的血糖值，可对曲线的描点进行细化，建立曲线模型的点越多，对照检测的值越准确。

⑨利用各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，对生产中的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定，

A,选取待检测鱼，获得非血液组织中的鳞片根部肌肉组织的取样对鱼体造成的创伤最小，不易感染，更不用处死样本，这种取样方法对珍惜样品，如大型观赏鱼和经济鱼类的亲本身体指标的连续观察尤为重要；而对于成百上千的大样本量统计学实验和检测，也能够节省大量的人力以及物料成本。，调整各组织cDNA后，以PEP-F，SQ2和PEP-R,SQ3

SQ2：CTCAGCAGTCTGATATGAGA

SQ3：TTTGGGACATAGTTTGTAAAC

作为引物进行半定量PCR，电泳检测各组织PEPCK基因，得出各组织PEPCK基因的亮度值；

B，利用PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，最终确定该被检测鱼的血糖值。

Claims (8)

1.一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因，其特征在于：该基因的全长cDNA序列为：SQ1。

2.一种应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其特征在于步骤如下：

第一步，乌克兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列的确定，包括步骤如下：

(一)制备乌克兰鳞鲤肝胰脏总RNA；

(二)合成第一链cDNA；

(三)PCR扩增PEPCK基因中间片段；

(四)3’RACE PCR及5’RACE PCR；

(五)琼脂糖电泳检测中间片段；

(六)制备感受态细胞；

(七)T-A克隆；

(八)转化感受态细胞；

(九)菌液PCR方法筛选阳性克隆；

(十)序列拼接，使用DNAStar软件中的EditSeq程序将乌克兰鳞鲤PEPCK基因中间序列的3’端序列和5’端序列的核苷酸数据使用软件将它们按顺序拼接起来，得到乌克兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列为：SQ1；

第二步，得出不同饲养条件下乌克兰鳞鲤各组织PEPCK基因的亮度，建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线，具体步骤如下：

(一)检测鱼类的饲养和取样

(1)饲养，取两个养殖箱冲洗干净后盛放好自来水，24小时连续曝气，将乌克兰鳞鲤每箱三条分别放入两个养殖箱中暂养，先在每天9点分别向两箱鱼中投喂低糖饲料，在15点更换养殖水体的三分之一，使其适应一周，然后禁食一天，再在第二天9点分别向两箱中投喂低糖饲料、高糖饲料，15点分别将低糖组和高糖组各三条鱼活体解剖；

(2)取样，将解剖鱼体肝胰脏、脑、肾脏、心脏、肌肉取出，记好标记存入液氮中备用，以进行后续试验；

(二)制备乌克兰鳞鲤各组织总RNA；

(三)合成低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织第一链cDNA；

(四)PCR确定低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织PEPCK、对比基因的表达量，建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，具体步骤为：

(1)PCR扩增内参基因，在冰上配制PCR反应体系，然后进行PCR反应程序；

(2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于-20℃备用；

(3)使用1％琼脂糖电泳检测内参基因PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电泳结果拍照；

(4)使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织内参基因的亮度比；

(5)按照上一步得出的亮度比调整各组织cDNA的添加量，以PEP-F和PEP-R作为引物进行半定量PCR；

(6)使用1％琼脂糖电泳检测各组织PEPCK基因PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电泳结果拍照；

(7)使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织PEPCK基因的亮度比；

(8)建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线；

第三步，利用各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，对生产中的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定。

3.根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其特征在于：所述第二步的步骤(一)中低糖饲料各原料的质量分数为：鱼粉8％、豆粕15％、花生粕16％、棉粕8％、菜粕10％、DDGS3％、豆油4％、预混料1％、微晶纤维素25％及麸皮10％；高糖饲料各原料的质量分数为：鱼粉8％，豆粕15％，花生粕16％，棉粕8％，菜粕10％，DDGS3％，豆油4％，预混料1％，麸皮10％及糊精25％。

4.根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其特征在于：所述第二步的步骤(四)中第(1)步在冰上配制PCR反应体系的组份为：

5.根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其特征在于：所述第二步的步骤(四)中第(1)进行PCR反应程序的具体内容为：

6.根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其特征在于：所述第二步的步骤(四)中第(5)的PEP-F和PEP-R的引物序列为：

SQ2：CTCAGCAGTCTGATATGAGA 

SQ3：TTTGGGACATAGTTTGTAAAC。

7.根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其特征在于：所述第二步的步骤(四)中第(8)步建立各组织PEPCK基因的半定量PCR扩增条带亮度与鱼血糖值的对应曲线的具体步骤为：

①将鲤鱼进行不同含糖量的饲料饲喂实验：高糖组，低糖组，禁食组；

②获得三个组别鲤鱼的血样并进行常规血糖检测；

③对三个组别的鲤鱼进行非血组织取样，并分别进行RNA抽提并反转录为cDNA，以cDNA为模板，SQ2与SQ3为引物进行PEPCK基因的半定量PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并使用紫外摄像系统检测扩增目的条带亮度值；

④将三个组别的血糖值与相应的PEPCK基因目的条带亮度值在直方图上进行描点并连线建立二者的对应曲线模型，建立曲线后根据相应的亮度值从曲线上查出相应的血糖值，为了得到更精确的血糖值，对曲线的描点进行细化。

8.根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其特征在于：所述第三步的步骤(四)中第(9)步对生产中的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定的具体步骤为：

①选取待检测鱼，获得非血液组织中的鳞片根部肌肉组织为样品，按照权利要求2中所述第二步的步骤(二)至步骤(四)的(7)步得出检测鱼各组织PEPCK基因的亮度值；

②利用PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线，最终确定该被检测鱼的血糖值。