CN104888273A - 一种双层复合型硬脑膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双层复合硬脑膜及其制备方法，首先采用交联剂对医用纯化猪真皮进行改性，制得基质层；采用涂覆法将可降解高分子膜液涂覆于基质层上、经水洗、干燥，制得具有双层结构的复合型硬脑膜。该硬脑膜修复材料柔韧性好，具有良好的力学性能、生物相容性、生物降解性，可有效地防止脑脊液渗漏和脑组织粘连。相对于静电纺丝技术，涂覆法大大提高了基底层和防渗层之间的剥离强度，该硬脑膜修复材料具有良好的应用前景。

Description

一种双层复合型硬脑膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种双层复合型硬脑膜及其制备方法，属于医用生物材料领域。

背景技术

硬脑膜是一层紧贴在颅骨内侧和脑组织之间的坚硬膜性组织，由胶原纤维网和缠绕其中的成纤维细胞所组成，紧贴颅骨内侧，主要作用是保护大脑。当人患颅内肿瘤，硬脑膜组织容易受到侵蚀破坏；此外，因手术、外伤等原因也可能造成硬脑膜缺损（陈振军.硬脑膜替代材料的研究与应用[J].中国组织工程与临床康复，2008，12（14）：2697-2700.）。硬脑膜缺损可引起脑医源性损伤、脑脊液渗漏、颅内感染以及继发性癫痫等一系列并发症。为预防脑、脊髓与周围组织发生粘连，防治脑脊液漏和感染，并为神经组织提供容纳和保护作用，必须进行及时有效的硬膜修补术。据资料统计，有10%~30%的脑外科手术都需要实施硬脑膜修补。因此，制备一种综合性能优良的硬脑膜修复材料已成当务之急。

目前市场上硬脑膜修复材料产品种类繁多，其中主要包括可吸收和不可吸收材料。其中可吸收产品如以牛跟腱Ⅰ型胶原为原材料的DuraGen，DuraMax等，这类材料虽具有良好的生物相容性和可降解性，能够诱导成纤维细胞成长，但也存在降解速度不易控制、材料脆性较大、容易破碎、难以缝合，引起脑脊液渗漏等问题。目前临床上常用生物型硬脑膜替代材料，如冠昊的NormalGen ，佰仁思的Dura scaffold，Dura-Guard等，这类材料主要以猪心包膜、牛心包膜等为原材料，其显著的优点是材料来源广泛、价格低廉、较为安全有效、易于操作等。但同时又有易导致粘连、不易保存、不易消毒、不易降解、可能产生免疫反应、有传染疾病的风险等缺陷。可吸收硬脑膜修复材料如聚乳酸（PLA）、聚己内酯(PCL)、聚已醇酸（PGA）、聚羟基丁酸酯(PHB)、PLA-PCL-PGA三元共聚物等，这类惰性生物材料无毒，可控降解性能，避免了由于长期停留在体内而引发感染和免疫反应等（Ting-Yu Shih，Jean-Dean Yang, Jui-Hsiang Chen. Synthesis, Characterization and Evaluation of Segmented Polycaprolactone for Development of Dura Substitute[J]. Procedia  Engineering  2012，36 : 144 – 149.），而且由于这类材料具有超强疏水性能，可以有效防止脑脊液渗漏。然而这类材料缺乏生物活性和诱导成纤维细胞生长的能力，对自身硬脑膜组织的形成促进作用较弱。

综上所述，现有硬脑膜修复材料制备技术存在以下不足：

    （1）材料力学强度不高，无法满足医用缝合要求；

    （2）材料自身不具有防水密封的特点，导致硬脑膜修复材料在使用过程中出现脑脊液渗漏或发生粘连；

    （3）材料在体内无法降解或降解时间过快，耐酶解性能较弱，降解速度与新生硬脑膜生长速度无法匹配；

    （4）材料缺乏生物活性，促进细胞生长和新生硬脑膜形成的能力弱。

理想的硬脑膜修补材料需具备以下特点：（1）致密无渗漏能够防止脑脊液渗漏；（2）合适的生物降解性，新生组织生成后能够完全被吸收；（3）生物相容性良好，能够促进成纤维细胞生长，形成新生硬脑膜；（4）合适的物理机械性能，缝合性优良；（5）原料来源丰富，价格适中，制备工艺简单，贮运方便。

脱细胞真皮基质ADM(acellular dermal matrix,ADM)（ 是由动物或人类的皮肤，通过物理、化学、生物学等方法，除去了皮肤的全层表皮及真皮层中的全部细胞成分，保留了真皮的胶原（纤维）成分和组织基本结构（同时也保留了基底膜成分）的材料（但卫华，廖隆理，李志强，等.脱细胞真皮基质材料的制备方法.中国发明专利.200410022506.9）。人体真皮组织的主要成分包括成纤维细胞、血管内皮细胞等细胞成分和细胞外基质蛋白、胶原等非细胞成分等。皮肤移植中，主要是细胞免疫引起的排斥, 当除去了具有较强免疫原性的细胞成分之后，ADM只留有很低的抗原性, 而同种脱细胞真皮基质则几乎不会引起宿主的排异反应,在宿主体内可以长期存留，最终材料被正常组织吸收、改建。脱细胞真皮( ADM ) 的细胞成分及Ⅰ、Ⅱ型细胞相容性抗原已经被完全清除掉,因而免疫活性很低, 故而它不会诱发针对异体组织移植所产生的特异性细胞免疫反应,也不会诱发非特异性异物反应。这样，既消除了应用其它同种异体材料时可见的免疫反应，又因为分子超微结构的存在成为一个模板，诱导组织内皮细胞和血管内皮细胞再生形成新的脑膜， 并且有较长的保存期。然而脱细胞真皮基质也存在一些缺点，如力学强度不足，耐酶解性较差，孔隙较大导致脑脊液渗漏等。胡杨等人以脱细胞猪真皮基质和胶原为原料，采用静电纺丝技术制备了胶原基硬脑膜，具有良好的生物相容性（胡杨，但卫华，但年华，等.一种胶原基硬脑膜及其制备方法.中国发明专利.201310176893.0）。

发明人在前期脱细胞猪真皮基质材料的基础上，研发出一种医用纯化猪真皮，其特点是具有完整的三维立体网状结构、良好生物相容性、良好的生物活性、良好力学性能和适当的可生物降解性等。大量研究证实，这种医用纯化猪真皮可以用作医用胶原提取制备的原料、体表创伤敷料、组织工程支架材料、生物填充材料、修复与重建材料等。本发明的目的就是克服现有技术的不足，以医用纯化猪真皮为基质层，构建具有双层结构的胶原基复合型硬脑膜。

发明内容

本发明针对现有硬脑膜修复材料存在的问题和不足提供一种双层复合型硬脑膜的制备方法，该方法制备的复合型硬脑膜具有良好的力学性能、柔韧性、可生物降解性，有效防止粘连，优良的防渗功能，能够承受较高的颅内高压而防止脑脊液渗漏，更重要的是具有良好的生物相容性，促进成纤维细胞的生长，是一种理想的硬脑膜修复材料。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，其中，所用原材料除特殊说明外，均按重量份计。

（1）基质层的制备

    医用纯化猪真皮的改性：将100重量份的医用纯化猪真皮放入不锈钢转鼓中，加入常温100~500重量份的0.01~0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，浸泡1~3h后，用0.25M的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液调节转鼓中液体的pH至8.5~10.5，加入5~20重量份的异氰脲酸三缩水甘油酯，启动转鼓，反应10~20h，反应温度为30~42℃；

    水洗：称取100重量份的改性后的医用纯化猪真皮，加入不锈钢转鼓中，加入常温水200~400重量份，水洗10~30min，弃去废液，如此重复水洗3~6次；加入常温水200~400重量份，水洗30~60min，弃去废液，如此重复水洗2~5次；加入常温水200~400重量份，水洗60~90min，弃去废液，如此重复水洗1~4次；

    沥水、冷冻干燥：沥水6~10h后，冷冻干燥，制得基质材料；

（2）防渗层膜液的制备

    将10~40重量份的Ⅰ型胶原溶于六氟异丙醇中，4℃搅拌30min~90min。再加入90~60重量份的聚己内酯和聚左旋乳酸共混物（P(LLA-CL)），两者的重量比为1:9~9:1，配制成总质量比为5%的溶液，P(LLA-CL)与Ⅰ型胶原重量比为60:40~90:10；

（3）双层复合型硬脑膜的构建

    涂覆：采用涂膜器将上述制备好的防渗层膜液涂覆于基质材料上，待溶液挥发1~3h后，进行下一次涂覆，如此重复 6~10次；

    称重：称取涂覆过的基质材料100重量份；

    水洗：将称重后的材料加入不锈钢转鼓中，加入常温水200~400重量份，水洗10~30min，弃去废液，如此重复水洗3~6次；加入常温水200~400重量份，水洗30~60min，弃去废液，如此重复水洗2~5次；加入常温水200~400重量份，水洗60~90min，弃去废液，如此重复水洗2~5次；

    真空干燥：将水洗后的半成品置于20~40℃真空干燥箱中干燥4~8h；

    包装灭菌：将采用Co⁶⁰所产生的γ射线或环氧乙烷进行消毒灭菌，成型包装，即制得双层复合型硬脑膜。

本发明所得到的双层复合型硬脑膜满足以下关键性能指标：

    （1）外观：白色或接近白色，无异味；

    （2）水分：≤30.0%（质量分数），按照《中华人民共和国药典》（2010年版）三部附录Ⅸ  H水分测定法规定的方法进行；

    （3）抗张强度：≥5.0Mpa，将硬脑膜样品剪成哑铃棒状，在温度 25℃，相对湿度 50%的标准环境下进行空气调节 48h后使用万能拉力机进行测试，按照GB/T1040-2006方法进行；

    （4）断裂伸长率：≥10%，将硬脑膜样品剪成哑铃棒状，在温度 25℃，相对湿度 50%的标准环境下进行空气调节 48h后使用万能拉力机进行测试，按照GB/T2918-1998方法进行；

    （5）剥离强度：≥0.343kN/m，参照 GB/T 2792-1998 方法进行；

    （6）重金属含量：≤10μg/ml，按照《中华人民共和国药典》（2010年版）二部附录Ⅸ E重金属检查法规定的方法进行；

    （7）灰分：≤2%（质量分数），按照《中华人民共和国药典》（2010年版）二部附录Ⅸ K灰分测定法规定的方法进行；

    （8）防脑脊液渗漏时间：＞180h，采用面革防水测定仪进行动态防水性检测，曲挠幅度为 15%，曲挠频率为 30 次/min；

    （9）羟脯氨酸含量：应不小于氨基酸总含量的5%（质量分数），参照Wossner法检测羟脯氨酸含量；

    （10）降解时间：应不少于120d，按照GB/T 16886.6-1997医疗器械生物学评价第6部分：植入后局部反应试验中肌肉植入试验方法进行；

    （11）体外细胞毒性：细胞毒性反应不大于1级，按照GB/T 16886.5-2003规定的细胞毒性评价方法进行；

    （12）致敏试验：应无迟发型超敏反应，按照GB/T 16886.10-2005刺激与迟发型超敏反应试验中的规定方法进行；

    （13）皮内刺激：原发性刺激PⅡ应小于0.4，按照GB/T16886.10-2005刺激与迟发型超敏反应试验中的规定方法进行。

本技术与现有硬脑膜修复材料制备技术相比，具有如下优点：

    （1）本发明所制备的双层复合型硬脑膜，基质层为医用纯化猪真皮，这是一种经过特殊物理化学方法处理，彻底除去了猪皮中的非胶原成分和小分子物质，充分分离和松散胶原纤维，具有完整的三维立体网状结构的、良好生物相容性、良好力学性能和适当的可生物降解性以及生物活性；

    （2）提供了一种对胶原进行有效改性的方法，采用异氰脲酸三缩水甘油酯对医用纯化猪真皮进行交联，提高了其生物稳定性和耐酶降解性；

    （3）本发明的双层复合型硬脑膜，防渗层不仅有效地防止脑脊液渗漏，加入的Ⅰ型胶原，具有诱导细胞再生功能，可促进新生硬脑膜的形成；

    （4）相对于静电纺丝技术而言，采用涂覆方法制备的双层复合型硬脑膜，基质材料与防渗层结合牢固，提高基质层与防渗层的剥离强度，具有良好的实际应用前景；

    （5）采用“梯度水洗法”对材料中残留的溶剂进行清洗，操作方法简单，快捷有效，便于实现产业化；

    （6）本发明所制备的双层复合型硬脑膜，利用仿生学原理模拟天然硬脑膜结构，面向脑组织的聚乳酸-聚己内酯-胶原防渗层，是一层致密平整的薄膜，可有效防止脑组织粘连，克服脑脊液渗漏的缺陷，而且具有诱导成纤维细胞再生的功能；背向脑组织的基质材料具有一定的空隙结构，利于细胞的进入和增殖；

    （7）本发明所制备的双层复合型硬脑膜，具有良好的力学性能，满足该类产品性能要求。

附图说明

图1为基于医用纯化猪真皮的双层复合硬脑膜的结构示意图。

具体实施方式

下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可根据上述发明的内容作非本质的改进和调整。

实施例1

（1）基质层的制备

    医用纯化猪真皮的改性：将100重量份的医用纯化猪真皮放入不锈钢转鼓中，加入常温100重量份的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，浸泡1h后，用0.25M的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液调节转鼓中液体的pH至8.5，加入5重量份的异氰脲酸三缩水甘油酯，启动转鼓，反应10h，反应温度为30℃；

    水洗：称取100重量份的改性后的医用纯化猪真皮，加入不锈钢转鼓中，加入常温水200重量份，水洗10min，弃去废液，如此重复水洗3次；加入常温水200重量份，水洗30min，弃去废液，如此重复水洗2次；加入常温水200重量份，水洗60min，弃去废液，如此重复水洗1次；

    沥水、冷冻干燥：沥水1h后，冷冻干燥，制得基质材料；

（2）防渗层膜液的制备

    将10重量份的Ⅰ型胶原溶于六氟异丙醇中，4℃搅拌30min。再加入90重量份的聚己内酯和聚左旋乳酸共混物（P(LLA-CL)），两者的重量比为1:9，配制成总质量比为5%的溶液，P(LLA-CL)与Ⅰ型胶原重量比为60:40；

（3）双层复合型硬脑膜的构建

    涂覆：采用涂膜器将上述制备好的防渗层膜液涂覆于基质材料上，待溶液挥发1h后，进行下一次涂覆，如此重复6次；

    称重：称取涂覆过的基质材料100重量份；

    水洗：将称重后的材料加入不锈钢转鼓中，加入常温水200重量份，水洗10min，弃去废液，如此重复水洗3次；加入常温水200重量份，水洗30min，弃去废液，如此重复水洗2次；加入常温水200重量份，水洗60min，弃去废液，如此重复水洗1次；

    真空干燥：将水洗后的半成品置于20℃真空干燥箱中干燥4h；

    包装灭菌：将采用Co⁶⁰所产生的γ射线进行消毒灭菌，成型包装，即制得双层复合型硬脑膜。

实施例2

（1）基质层的制备

    医用纯化猪真皮的改性：将100重量份的医用纯化猪真皮放入不锈钢转鼓中，加入常温300重量份的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，浸泡2h后，用0.25M的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液调节转鼓中液体的pH至9.5，加入12重量份的异氰脲酸三缩水甘油酯，启动转鼓，反应15h，反应温度为37℃；

    水洗：称取100重量份的改性后的医用纯化猪真皮，加入不锈钢转鼓中，加入常温水300重量份，水洗20min，弃去废液，如此重复水洗5次；加入常温水300重量份，水洗45min，弃去废液，如此重复水洗4次；加入常温水300重量份，水洗75min，弃去废液，如此重复水洗3次；

    沥水、冷冻干燥：沥水8h后，冷冻干燥，制得基质材料；

（2）防渗层膜液的制备

    将30重量份的Ⅰ型胶原溶于六氟异丙醇中，4℃搅拌60min。再加入75重量份的聚己内酯和聚左旋乳酸共混物（P(LLA-CL)），两者的重量比为5:5，配制成总质量比为5%的溶液，P(LLA-CL)与Ⅰ型胶原重量比为75:25；

（3）双层复合型硬脑膜的构建

    涂覆：采用涂膜器将上述制备好的防渗层膜液涂覆于基质材料上，待溶液挥发2h后，进行下一次涂覆，如此重复8次；

    称重：称取涂覆过的基质材料100重量份；

    水洗：将称重后的材料加入不锈钢转鼓中，加入常温水300重量份，水洗20min，弃去废液，如此重复水洗5次；加入常温水300重量份，水洗45min，弃去废液，如此重复水洗4次；加入常温水300重量份，水洗75min，弃去废液，如此重复水洗3次；

    真空干燥：将水洗后的半成品置于30℃真空干燥箱中干燥6h；

    包装灭菌：将采用Co⁶⁰所产生的γ射线进行消毒灭菌，成型包装，即制得双层复合型硬脑膜。

实施例3

（1）基质层的制备

    医用纯化猪真皮的改性：将100重量份的医用纯化猪真皮放入不锈钢转鼓中，加入常温500重量份的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，浸泡3h后，用0.25M的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液调节转鼓中液体的pH至10.5，加入20重量份的异氰脲酸三缩水甘油酯，启动转鼓，反应20h，反应温度为42℃；

    水洗：称取100重量份的改性后的医用纯化猪真皮，加入不锈钢转鼓中，加入常温水400重量份，水洗30min，弃去废液，如此重复水洗6次；加入常温水400重量份，水洗60min，弃去废液，如此重复水洗5次；加入常温水400重量份，水洗90min，弃去废液，如此重复水洗4次；

    沥水、冷冻干燥：沥水10h后，冷冻干燥，制得基质材料；

（2）防渗层膜液的制备

    将40重量份的Ⅰ型胶原溶于六氟异丙醇中，4℃搅拌90min。再加入60重量份的聚己内酯和聚左旋乳酸共混物（P(LLA-CL)），两者的重量比为9:1，配制成总质量比为5%的溶液，P(LLA-CL)与Ⅰ型胶原重量比为90:10；

（3）双层复合型硬脑膜的构建

    涂覆：采用涂膜器将上述制备好的防渗层膜液涂覆于基质材料上，待溶液挥发3h后，进行下一次涂覆，如此重复10次；

    称重：称取涂覆过的基质材料100重量份；

    水洗：将称重后的材料加入不锈钢转鼓中，加入常温水400重量份，水洗30min，弃去废液，如此重复水洗6次；加入常温水400重量份，水洗60min，弃去废液，如此重复水洗5次；加入常温水400重量份，水洗90min，弃去废液，如此重复水4次；

    真空干燥：将水洗后的半成品置于40℃真空干燥箱中干燥8h；

    包装灭菌：将环氧乙烷进行消毒灭菌，成型包装，即制得双层复合型硬脑膜。

Claims (3)

1.一种双层复合型硬脑膜，其特征在于，该脑硬膜满足以下关键性能指标：

（1）外观：白色或接近白色，无异味；

（2）水分：≤30.0%（质量分数），按照《中华人民共和国药典》（2010年版）三部附录Ⅸ  H水分测定法规定的方法进行；

（3）抗张强度：≥5.0Mpa，将硬脑膜样品剪成哑铃棒状，在温度 25℃，相对湿度 50%的标准环境下进行空气调节 48h后使用万能拉力机进行测试，按照GB/T1040-2006方法进行；

（4）断裂伸长率：≥10%，将硬脑膜样品剪成哑铃棒状，在温度 25℃，相对湿度 50%的标准环境下进行空气调节 48h后使用万能拉力机进行测试，按照GB/T2918-1998方法进行；

（5）剥离强度：≥0.343kN/m，参照 GB/T 2792-1998 方法进行；

（6）重金属含量：≤10μg/ml，按照《中华人民共和国药典》（2010年版）二部附录Ⅸ E重金属检查法规定的方法进行；

（7）灰分：≤2%（质量分数），按照《中华人民共和国药典》（2010年版）二部附录Ⅸ K灰分测定法规定的方法进行；

（8）防脑脊液渗漏时间：＞180h，采用面革防水测定仪进行动态防水性检测，曲挠幅度为 15%，曲挠频率为 30 次/min；

（9）羟脯氨酸含量：应不小于氨基酸总含量的5%（质量分数），参照Wossner法检测羟脯氨酸含量；

（10）降解时间：应不少于120d，按照GB/T 16886.6-1997医疗器械生物学评价第6部分：植入后局部反应试验中肌肉植入试验方法进行；

（11）体外细胞毒性：细胞毒性反应不大于1级，按照GB/T 16886.5-2003规定的细胞毒性评价方法进行；

（12）致敏试验：应无迟发型超敏反应，按照GB/T 16886.10-2005刺激与迟发型超敏反应试验中的规定方法进行；

（13）皮内刺激：原发性刺激PⅡ应小于0.4，按照GB/T16886.10-2005刺激与迟发型超敏反应试验中的规定方法进行。

2.如权利要求1所述的双层复合型硬脑膜的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）基质层的制备

    医用纯化猪真皮的改性：将100重量份的医用纯化猪真皮放入不锈钢转鼓中，加入常温100~500重量份的0.01~0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，浸泡1~3h后，用0.25M的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液调节转鼓中液体的pH至8.5~10.5，加入5~20重量份的异氰脲酸三缩水甘油酯，启动转鼓，反应10~20h，反应温度为30~42℃；

    水洗：称取100重量份的上述改性后的医用纯化猪真皮，加入不锈钢转鼓中，加入常温水200~400重量份，水洗10~30min，弃去废液，如此重复水洗3~6次；加入常温水200~400重量份，水洗30~60min，弃去废液，如此重复水洗2~5次；加入常温水200~400重量份，水洗60~90min，弃去废液，如此重复水洗1~4次；

    沥水、冷冻干燥：沥水6~10h后，冷冻干燥，制得基质材料；

（2）防渗层膜液的制备

    将10~40重量份的Ⅰ型胶原溶于六氟异丙醇中，4℃搅拌30min~90min，再加入90~60重量份的聚己内酯和聚左旋乳酸共混物（P(LLA-CL)），两者的重量比为1:9~9:1，配制成总质量比为5%的溶液，P(LLA-CL)与Ⅰ型胶原重量比为60:40~90:10；

（3）双层复合型硬脑膜的构建

    涂覆：采用涂膜器将上述制备好的防渗层膜液涂覆于基质材料上，待溶液挥发1~3h后，进行下一次涂覆，如此重复 6~10次；

    称重：称取涂覆过的基质材料100重量份；

    水洗：将称重后的材料加入不锈钢转鼓中，加入常温水200~400重量份，水洗10~30min，弃去废液，如此重复水洗3~6次；加入常温水200~400重量份，水洗30~60min，弃去废液，如此重复水洗2~5次；加入常温水200~400重量份，水洗60~90min，弃去废液，如此重复水洗1~4次；

    真空干燥：将水洗后的半成品置于20~40℃真空干燥箱中干燥4~8h；

    包装灭菌：将采用Co⁶⁰所产生的γ射线或环氧乙烷进行消毒灭菌，成型包装，即制得双层复合型硬脑膜。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的聚左旋乳酸和聚己内酯的数均分子量均为80000。