CN104887715B

CN104887715B - 一种枯草芽孢杆菌喷雾剂

Info

Publication number: CN104887715B
Application number: CN201510346090.4A
Authority: CN
Inventors: 周云久; 鲁丽; 杨慧; 姜玉娟; 冯媛; 肖颖; 于凯; 吕雪; 董志玲
Original assignee: HHT White Swan Pharmacy Group Co Ltd
Current assignee: HHT White Swan Pharmacy Group Co Ltd
Priority date: 2015-06-19
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2035-06-19
Also published as: CN104887715A

Abstract

一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，它涉及一种喷雾剂。本发明的其中一个目的是为了解决现有治疗烧伤药物存在耐药性，枯草芽孢杆菌菌剂应用到烧伤治疗时，存活率低且成膜效果差的问题，本发明另外一个目的是为了解决现有枯草芽孢杆菌菌剂应用到烧伤治疗时，作用过于单一，止血效果差的问题。它由枯草芽孢杆菌、85～94％的营养液、5～10％的甘油和1～5％的分散剂制成。本发明一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，它用于烧伤的抗菌感染中。本发明的枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)喷雾剂通过对创面植入优势菌，以迅速形成菌膜和利用其生物拮抗作用，对烧伤创面起到生物屏障和抑菌作用。本发明制备的枯草芽孢杆菌喷雾剂用于烧伤的抗菌感染中。

Description

一种枯草芽孢杆菌喷雾剂

技术领域

本发明涉及一种喷雾剂及其应用。

背景技术

烧伤无论在和平时期和战争时期都是常见疮伤，一般以热力烧伤(包括热液、如水、汤、油等、蒸汽、高温气体、火焰、炽热金属或塑料液体和固体，如钢水、钢锭或高温塑料等)为主。随着现代工农业生产技术的发展，化学和电子烧伤呈现增多的趋势，在森林火灾、易燃易爆、公共场所失火及现代战争均可造成成批的伤员。

烧伤感染是造成创面加深和败血症的重要原因，为此预防和控制创面感染是烧伤研究的一项内容。由于烧伤引起的组织坏死，形成微生物生长繁殖的良好培养环境，加上局部循环受到损害，影响了免疫因子和抗菌药物的进入，使针对全身感染的防治措施难以收到理想的结果，因此，大量使用外用抗菌药物进行治疗烧伤感染是目前的趋势。然而，随着耐药菌株的不断增加，致使一些药物收不到长期稳定理想的效果，由于伤口不能保湿使得创面容易结痂，清创比较痛苦，给要不太方便等缺陷。

目前用于治疗烧伤烫伤的烧伤灵酊，具有清热藻湿、解读消肿、收敛止痛的功能。对烧伤的治疗有着明显功效，由于其制剂为酊，用乙醇作为挥发性，需在患处多次喷洒，为患者带来著多不便。

而人们从健康人的皮肤上分离到一株枯草芽胞杆菌BS₂₂₄菌株，经过多年大量实验室研究，发现由该菌株培养液制成悬浮组合物喷洒于创伤或烧伤表面上后，可在短时间内明显防治包括绿脓杆菌在内的其他致病菌的感染，并有利创面结痂的形成及愈合，而未见任何明显的毒副作用。但枯草芽胞杆菌BS224菌株普遍存在活菌浓度不够高、稳定性较差的缺点。而活菌的数量直接影响枯草芽孢杆菌对创伤的治疗效果，因此如何提高枯草芽孢杆菌制剂中枯草芽孢杆菌的活菌数是现在急需解决的问题，并且该菌成膜是依靠自身成膜，成膜效果差，并不能够很好地起到生物屏障的作用，且该菌剂的使用过于单一，只是起到抑菌作用，并没有结合其他组分共同应用，因此，在止血方面其并没有特殊的作用。

芦荟是百合科芦荟属肉质草本植物，在全世界范围内，大约有360多种的不同品种的芦荟分布在北美、亚洲、欧洲和非洲的干旱地区，其中库拉索芦荟无论在商业用途还是在治疗学研究中都是应用地最广泛的一种。芦荟富含多种生物活性物质，其中，芦荟多糖是芦荟凝胶的主要生物活性组分，一般来说，芦荟多糖的含量与组成随芦荟品种、采收季节和生长地区不同而异。芦荟多糖(Aloe Polysaccharide，AP)为百合科植物，库拉索芦荟(Aloe barbadensis Miller)、木立芦荟(Aloe Arboresecens Miller)、元江芦荟(Aloe yuan-jiangensis)、华芦荟(Aloe chinenesis)及其他近缘植物中提取分离得到的多糖。芦荟多糖是一大类具有不同生理功能的大分子化合物，主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖组成，其中以甘露糖、半乳糖和葡萄糖含量居多，芦荟叶肉中的黏性物质以甘露聚糖为主。同其他植物多糖一样，芦荟多糖具有免疫调节、抗肿瘤、保肝护肝、抗辐射、抗溃疡、抗氧化、抗衰老和降血糖等保健功能。目前尚未有因使用芦荟多糖而出现过敏反应的报道，且其本身的毒副作用小，因而是近年来芦荟研究的重点之一。被联合国粮农组织(FAO)誉为“21世纪最佳保健食品”。芦荟多糖多用于增稠剂、稳定剂、胶凝剂、黏结剂。

薄荷为唇形科多年草本植物的茎叶，具有疏散风热，清利头目，利咽，透疹，疏肝解郁的功效。临床多用于风热感冒，温病初起，头痛目赤，咽喉肿痛等证。现代药理学研究表明薄荷具有抗菌、镇静止痛、驱虫等作用。

薄荷具有刺激中枢神经的功效，对感觉神经末梢有抑制和麻痹的作用，对皮肤瘙痒具有抗过敏和止痒的作用。

发明内容

本发明的其中一个目的是为了解决现有治疗烧伤药物存在耐药性，枯草芽孢杆菌菌剂应用到烧伤治疗时，存活率低且成膜效果差的问题，而提供了一种枯草芽孢杆菌喷雾剂。

本发明另外一个目的是为了解决现有枯草芽孢杆菌菌剂应用到烧伤治疗时，作用过于单一，止血效果差的问题，而提供了一种枯草芽孢杆菌喷雾剂的应用。

本发明一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由85～94％的营养液、5～10％的甘油和1～5％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为3～5mg/mL、营养液中氮源浓度为10～13mg/mL、营养液中无机盐浓度为0.05～0.1mg/mL；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：(2～3)：(2～3)的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。

本发明一种枯草芽孢杆菌喷雾剂的应用，它用于烧伤的抗菌感染中。

本发明包含以下有益效果:

本发明的枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)喷雾剂，对烧伤创面能够有效控制感染、防止感染加重；加速了创面愈合的速度，缩短了治愈时间，在短时间内抑制创面细菌的生长，有效的防止了创面脓毒症的发生，还能防止败血症发生，为保护创面植皮手术的成功创造了良好的条件。且使用方便，可大量减轻医务人员的劳动强度，节省大量的抗生素和资金。在本发明的枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)喷雾剂进行烧伤治疗时，并不会对周围环境造成污染，也不会对人体产生副作用。

本发明的枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)喷雾剂通过对创面植入优势菌，以迅速形成菌膜和利用其生物拮抗作用，对烧伤创面起到生物屏障和抑菌作用，达到防治由金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、鲍氏不动杆菌等外袭菌感染的目的。

通过本发明的优化枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)的方法，能够使枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)的芽孢数明显增加，使枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)的芽孢数达5.6～5.9×10⁸CFU/mL。采用该枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)制得的喷雾剂对金黄色葡萄球菌的抑菌率为：95％～98％，对绿脓杆菌的抑菌率为：75％～78％，对鲍氏不动杆菌的抑菌率为：76％～79％。

并且，本发明的优化培养方法，缩短了枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)菌株的培养时间，控制其在对数生长期内，提高了菌株的活性；在发酵培养基中添加1％琼脂粉既延长抑菌时间，又省去离心收集菌体的步骤，缩短了工时。原始工艺的工时为140h，改进工艺的工时为122h，缩短了18h。

而且，由于芦荟多糖是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖及微量的岩藻糖、木糖组成，在枯草芽孢杆菌活菌制剂中加入芦荟多糖，既可以为枯草芽孢杆菌活菌提供营养物质，又可以促进伤口愈合，同时帮助枯草芽孢杆菌在创口形成一层保护膜，为枯草芽孢杆菌营造厌氧的生长环境。

薄荷多糖中主要含有葡萄糖，半乳糖和阿拉伯糖，另外还含有甘露糖和鼠李糖；薄荷多糖可以为枯草芽孢杆菌提供营养物质；薄荷多糖具有低分子量糖类的特性，具有渗透性和锁水性强的能力，可以即时成膜，具有较好的保湿效果；因此，薄荷多糖既可以为枯草芽孢杆菌活菌提供营养物质，又可以促进伤口愈合，同时帮助枯草芽孢杆菌在创口形成一层保护膜。因此，芦荟多糖和薄荷多糖又可以为枯草芽孢杆菌提供碳源，一举两用。

本发明的枯草芽孢杆菌喷雾剂同时还具有如下功能:

1、喷雾剂本身具有抑制菌类生长的功能；2、膜剂产生生物粘附性，牢牢地粘附于患处；3、由于在喷雾剂中加入甘油，能够对烧烫伤后产生的组织液有吸附作用；4、有抑制纤维细胞生长，减少疤痕的作用；5、不粘连皮肤，揭开取容易，不会造成二次出血和伤害；6、加入分散剂后，使喷雾剂更容易喷出。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式是一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由85～94％的营养液、5～10％的甘油和1～5％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为3～5mg/mL、营养液中氮源浓度为10～13mg/mL、营养液中无机盐浓度为0.05～0.1mg/mL；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：(2～3)：(2～3)的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。

本实施方式的基质经灭菌后与枯草芽孢杆菌混合后，得枯草芽孢杆菌喷雾剂。

本实施方式包含以下有益效果:

本实施方式的枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)喷雾剂，对烧伤创面能够有效控制感染、防止感染加重；加速了创面愈合的速度，缩短了治愈时间，在短时间内抑制创面细菌的生长，有效的防止了创面脓毒症的发生，还能防止败血症发生，为保护创面植皮手术的成功创造了良好的条件。且使用方便，可大量减轻医务人员的劳动强度，节省大量的抗生素和资金。在本实施方式的枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)喷雾剂进行烧伤治疗时，并不会对周围环境造成污染，也不会对人体产生副作用。

本实施方式的枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)喷雾剂通过对创面植入优势菌，以迅速形成菌膜和利用其生物拮抗作用，对烧伤创面起到生物屏障和抑菌作用，达到防治由金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、鲍氏不动杆菌等外袭菌感染的目的。

通过本实施方式的优化枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)的方法，能够使枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)的芽孢数明显增加，使枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)的芽孢数达5.6～5.9×10⁸CFU/mL。采用该枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)制得的喷雾剂对金黄色葡萄球菌的抑菌率为：95％～98％，对绿脓杆菌的抑菌率为：75％～78％，对鲍氏不动杆菌的抑菌率为：76％～79％。

并且，本实施方式的优化培养方法，缩短了枯草芽孢杆菌(BS₂₂₄)菌株的培养时间，控制其在对数生长期内，提高了菌株的活性；在发酵培养基中添加1％琼脂粉既延长抑菌时间，又省去离心收集菌体的步骤，缩短了工时。原始工艺的工时为140h，改进工艺的工时为122h，缩短了18h。

本实施方式的枯草芽孢杆菌喷雾剂同时还具有如下功能:

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：所述的无机盐是由质量百分含量为0.05％的氯化钙溶液、质量百分含量为0.05％的氯化锰溶液、质量百分含量为0.1％的硫酸镁溶液和质量百分含量为0.2％的磷酸氢二钠溶液按等比例混合而成。其他步骤与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同点是：所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：2：2的比例组成。其他步骤与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：所述的芦荟多糖的提取是按以下步骤进行：

一、芦荟前处理：取新鲜库拉索芦荟叶洗净去刺，横切成5mm薄片架在培养皿上，用鼓风干燥箱55℃的条件下烘干12h，然后将烘干的芦荟叶放入粉碎机粉碎，得到芦荟粉，置于棕色试剂瓶密封保存备用；

二、按质量体积比为1:30g/mL的比例将芦荟干粉放入蒸馏水中，复水30min后用超声波辅助进行提取，然后8000r/min离心15min，取上清液，再放入旋转发仪在0.085MPa，65℃的条件下浓缩至原体积的1/2～1/3，然后加入4倍体积的无水乙醇再置于4℃冰箱，静置过夜，然后2500r/min离心10min，取沉淀，即完成。其他步骤与具体实施方式一至三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：所述的薄荷多糖是按以下步骤制备的：

一、称取干燥的薄荷药材，粉碎后过40目～60目筛，得到薄荷粉末；将薄荷粉末加入到蒸馏水中浸泡12h～20h，再加热回流提取1h～2h，得到混合物A；向混合物A中加入纤维素酶，调节pH值至5～6，再在温度为40℃～55℃、pH值为5～6的条件下酶解0.5h～3h，得到纤维素酶水解后的混合物A；

步骤一中所述的纤维素酶的加入量与混合物A的质量比为(0.3～1.5):100；

二、向纤维素酶水解后的混合物A中加入蛋白酶和菠萝蛋白酶，调节pH至7～7.5，再在温度为55℃～60℃下酶解0.5h～3h，得到提取液；

步骤二中所述的蛋白酶的加入量与纤维素酶水解后的混合物A的质量比为(0.3～0.8):100；步骤二中所述的菠萝蛋白酶的加入量与纤维素酶水解后的混合物A的质量比为(0.3～0.6):100；

三、使用旋转蒸发仪在温度为62℃～68℃下将提取液的体积减压浓缩至原体积的1/2～1/3，得到浓缩液；向浓缩液中加入无水乙醇，再在室温下静置8h～16h，再进行抽滤，得到沉淀物质；依次使用无水乙醇、无水乙醚和丙酮洗涤对沉淀物质分别清洗3次～5次，再在零下15℃～30℃，冷冻干燥5h～10h，得到薄荷多糖；

步骤三中所述的浓缩液的体积与无水乙醇的体积比为1:(4～6)。其他步骤与具体实施方式一至四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是：所述的枯草芽孢杆菌是按照以下步骤进行优化培养的：

一、取枯草芽孢杆菌接种于LB固体斜面培养基上，在37℃条件下，培养18～20h；

二、取步骤一培养至第2～3代的枯草芽孢杆菌的菌种接种于LB液体培养基中，在温度为37℃、转速为200rpm的条件下培养12～14h；

三、取步骤二培养的枯草芽孢杆菌液接种至含有质量百分含量为0.009～0.08％的氯化钙和质量百分含量为0.01～0.07％的氯化锰的LB液体培养基中，在培养温度为37℃、转速为200rpm、pH为7.2～7.4、通气比例为1:1的条件下培养20h，然后将培养温度降至15℃～20℃继续培养60h，即完成所述的枯草芽孢杆菌的优化。其他步骤与具体实施方式一至五相同。

LB固体斜面培养基是由葡萄糖、酵母膏和蛋白胨混合而成，其中，葡萄糖的浓度为4g/L、酵母膏的浓度为12g/L，蛋白胨的浓度为1.5g/L。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是：所述的枯草芽孢杆菌为BS224菌株。其他步骤与具体实施方式一至六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同点是：所述的LB液体培养基是由葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、氯化钙和氯化锰混合而成，其中，LB液体培养基中葡萄糖的浓度为4g/L、酵母膏的浓度为12g/L，蛋白胨的浓度为1.5g/L。其他步骤与具体实施方式一至七相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同点是：一种枯草芽孢杆菌喷雾剂的应用，它用于烧伤的抗菌感染中。其他步骤与具体实施方式一至八相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同点是：一种枯草芽孢杆菌喷雾剂的应用，是按照以下步骤进行的：

将具体实施方式一的枯草芽孢杆菌喷雾剂直接喷涂在烧伤创面，或者先在烧伤创面涂喷涂具体实施方式一的枯草芽孢杆菌喷雾剂，然后再烧伤创面涂抹羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶。其他步骤与具体实施方式一至九相同。

本实施方式所述的羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶是按照以下步骤进行的：

一、将羧甲基纤维素钠和海藻酸钠在温度为50～60℃条件下加入到水中搅拌至完全溶解后，得混液；

调节步骤一混液的渗透压摩尔浓度至300～350mOsmol/kg，然后加水调节羧甲基纤维素钠的质量浓度至4％～10％，海藻酸钠质量浓度至0.2％～0.5％，得羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶，将羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶灭菌后，即完成。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同点是：一种枯草芽孢杆菌喷雾剂它由枯草芽孢杆菌、85％的营养液、10％的甘油和5％的分散剂制成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐和余量的水组成，其中，碳源、氮源和无机盐的质量比为3:2:1；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1:2:2的比例组成。其他步骤与具体实施方式一至十相同。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同点是：一种枯草芽孢杆菌喷雾剂它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由86％的营养液、10％的甘油和4％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为4mg/mL、营养液中氮源浓度为12mg/mL、营养液中无机盐是由浓度为0.5mg/mL的无水氯化钙和浓度为0.5mg/mL的氯化锰混合而成；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：3：2的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和大豆粉中的一种或几种按任意比混合的混合物；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。其他步骤与具体实施方式一至十一相同。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同点是：一种枯草芽孢杆菌喷雾剂它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由88％的营养液、8％的甘油和4％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为4mg/mL、营养液中氮源浓度为13mg/mL、营养液中无机盐是由浓度为0.5mg/mL的无水氯化钙和浓度为0.5mg/mL的氯化锰混合而成；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：2：2的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和大豆粉中的一种或几种按任意比混合的混合物；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。其他步骤与具体实施方式一至十二相同。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一至十三之一不同点是：一种枯草芽孢杆菌喷雾剂它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由90％的营养液、7％的甘油和3％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为5mg/mL、营养液中氮源浓度为10mg/mL、营养液中无机盐是由浓度为0.5mg/mL的无水氯化钙和浓度为0.5mg/mL的氯化锰混合而成；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：2：3的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和大豆粉中的一种或几种按任意比混合的混合物；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。其他步骤与具体实施方式一至十三相同。

具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式一至十四之一不同点是：一种枯草芽孢杆菌喷雾剂它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由92％的营养液、6％的甘油和2％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为4.5mg/mL、营养液中氮源浓度为12.5mg/mL、营养液中无机盐是由浓度为0.5mg/mL的无水氯化钙和浓度为0.5mg/mL的氯化锰混合而成；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：2.5：2.5的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和大豆粉中的一种或几种按任意比混合的混合物；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。其他步骤与具体实施方式一至十四相同。

具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式一至十五之一不同点是：一种枯草芽孢杆菌喷雾剂它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由94％的营养液、5％的甘油和1％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为4mg/mL、营养液中氮源浓度为11mg/mL、营养液中无机盐是由浓度为0.5mg/mL的无水氯化钙和浓度为0.5mg/mL的氯化锰混合而成；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：2.7：2.5的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和大豆粉中的一种或几种按任意比混合的混合物；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。其他步骤与具体实施方式一至十五相同。

具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式一至十六之一不同点是：一种枯草芽孢杆菌喷雾剂它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由93％的营养液、5％的甘油和2％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为4mg/mL、营养液中氮源浓度为12mg/mL、营养液中无机盐是由浓度为0.5mg/mL的无水氯化钙和浓度为0.5mg/mL的氯化锰混合而成；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：2.7：2.7的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和大豆粉中的一种或几种按任意比混合的混合物；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。其他步骤与具体实施方式一至十六相同。

具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式一至十七之一不同点是：一种枯草芽孢杆菌喷雾剂它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由88％的营养液、7％的甘油和5％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为4mg/mL、营养液中氮源浓度为12mg/mL、营养液中无机盐是由浓度为0.5mg/mL的无水氯化钙和浓度为0.5mg/mL的氯化锰混合而成；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：2.5：3的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和大豆粉中的一种或几种按任意比混合的混合物；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。其他步骤与具体实施方式一至十七相同。

具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式一至十八之一不同点是：一种枯草芽孢杆菌喷雾剂它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由90％的营养液、7％的甘油和3％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为4mg/mL、营养液中氮源浓度为12mg/mL、营养液中无机盐是由浓度为0.5mg/mL的无水氯化钙和浓度为0.5mg/mL的氯化锰混合而成；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：2：2的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和大豆粉中的一种或几种按任意比混合的混合物；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。其他步骤与具体实施方式一至十八相同。

具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式一至十九之一不同点是：一种枯草芽孢杆菌喷雾剂它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由90％的营养液、5％的甘油和5％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为4mg/mL、营养液中氮源浓度为12mg/mL、营养液中无机盐是由浓度为0.5mg/mL的无水氯化钙和浓度为0.5mg/mL的氯化锰混合而成；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：3：3的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和大豆粉中的一种或几种按任意比混合的混合物；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。其他步骤与具体实施方式一至十九相同。

具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式六的不同点是：步骤三中所述的接种的接种量为5～9％。其他步骤与具体实施方式六相同。

具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式六的不同点是：步骤三中所述的氯化钙的质量百分含量为0.05％，氯化锰的质量百分含量为0.05％。其他步骤与具体实施方式六相同。

具体实施方式二十三：本实施方式与具体实施方式六的不同点是：步骤三中所述的氯化钙的质量百分含量为0.02％，氯化锰的质量百分含量为0.03％。其他步骤与具体实施方式六相同。

具体实施方式二十四：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤一中向混合物A中加入纤维素酶，调节pH值至5.5，再在温度为50℃下和pH值为5.5的条件下酶解2h，得到纤维素酶水解后的混合物A。其他步骤与具体实施方式五相同。

具体实施方式二十五：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤一中所述的纤维素酶的加入量与混合物A的质量比为1:100。其他步骤与具体实施方式五相同。

具体实施方式二十六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤二中向纤维素酶水解后的混合物A中加入蛋白酶和菠萝蛋白酶，调节pH至7.5，再在温度为58℃下酶解2h，得到提取液。其他步骤与具体实施方式五相同。

具体实施方式二十七：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤二中所述的蛋白酶的加入量与纤维素酶水解后的混合物A的质量比为0.5:100。其他步骤与具体实施方式五相同。

具体实施方式二十八：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤二中所述的菠萝蛋白酶的加入量与纤维素酶水解后的混合物A的质量比为0.5:100。其他步骤与具体实施五相同。

具体实施方式二十九：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤三中使用旋转蒸发仪在温度为65℃下将提取液的体积减压浓缩至原体积的1/2，得到浓缩液；向浓缩液中加入无水乙醇，再在室温下静置10h，再进行抽滤，得到沉淀物质；依次使用无水乙醇、无水乙醚和丙酮洗涤对沉淀物质清洗4次，再在零下15℃，冷冻干燥10h，得到薄荷多糖。其他步骤与具体实施方式五相同。

具体实施方式三十：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤三中所述的浓缩液的体积与无水乙醇的体积比为1:5。其他步骤与具体实施方式五相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实验验证本发明的有益效果：

实验1

本实验的枯草芽孢杆菌的优化培养方法，是按照以下步骤进行的：

一、取枯草芽孢杆菌BS224接种于LB固体斜面培养基上，在37℃条件下，培养18～20h；

三、取步骤二培养的枯草芽孢杆菌液接种至含有质量百分含量为0.05％的氯化钙和质量百分含量为0.05％的氯化锰的LB液体培养基中，在培养温度为37℃、转速为200rpm、pH为7.2～7.4、通气比例为1:1的条件下培养20h，然后将培养温度降至15℃～20℃继续培养60h，即完成；

步骤二中所述的LB液体培养基是由葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、氯化钙和氯化锰混合而成，其中，LB液体培养基中葡萄糖的浓度为4g/L、酵母膏的浓度为12g/L，蛋白胨的浓度为1.5g/L；

本实验所述的枯草芽孢杆菌BS224为市售产品。

本实验的发酵条件是有着严格的要求，稍有变化均会造成发酵效果的显著差异。因此，通过如下对温度、金属离子的条件优化最终确定出本实验的发酵条件：

1)发酵培养的降温条件分析

首先，本实验首先在37℃进行发酵培养，然后进行降温继续培养，由于现有方法中均是在37±2℃条件下进行的，而未有在低温状态下进行枯草芽孢杆菌的培养方式，因此，本实验对降温条件进行如下选择分析：

在本实验的培养时间、pH、转速、通气量保持一致的情况下，在37℃发酵20小时后，降温继续发酵，进行工艺优化如表1所示：

表1温度与芽孢数关系数据

温度(℃)	5	10	15	20	25	30
							芽孢数(×10⁸CFU/mL)	5.3	5.5	8.6	8.5	6.7	5.2

结论：从表1数据得知，当温度下降致15℃～20℃时，芽孢数最多；当温度下降致10℃以下或升高致25℃以上时，芽孢数有明显下降趋势。因此，降温15℃～20℃继续发酵为最佳的发酵工艺条件。

2)发酵培养的金属盐离子浓度分析

在本实验的培养时间、pH、转速、通气量保持一致的情况下，改变金属盐离子浓度进行工艺优化如表2所示：

表2金属盐离子浓度与芽孢数关系数据

金属盐离子浓度(％)	0.025	0.05	0.075	0.1
					芽孢数(×10⁸CFU/mL)	7.5	8.2	7.3	5.1

结论：从表2数据得知，当金属盐离子浓度为0.05％时，芽孢数最多；当金属盐离子浓度下降致0.025％以下或升高0.075％以上时，芽孢数有明显下降趋势。因此，金属盐离子浓度为0.05％为最佳的发酵工艺条件。

将实验1的方法与对照组(现有枯草芽孢杆菌的发酵工艺)进行比较，以说明本实验的方法均有明显的优势，具体分析如下：

一、对照组工艺如下：

1、培养基的组成成分：营养肉汤培养基。

1、发酵工艺参数如表3所示：

表3现有枯草芽孢杆菌发酵工艺参数

参数	温度(℃)	时间(h)	pH	转速(rpm/min)	通气量(L/min)
						数值	37	80	7.2～7.4	200	1：1

二、实验1的枯草芽孢杆菌发酵工艺如下：

1、培养基的组成成分：LB液体培养基(含0.05％氯化钙和0.05％氯化锰)。

2、发酵工艺参数如表4所示：

表4实验1枯草芽孢杆菌发酵工艺参数

参数	温度(℃)	时间(h)	pH	转速(rpm/min)	通气量(L/min)
						数值	37->(15-20)	80	7.2～7.4	200	1：1

注：温度条件为：先在37℃发酵20小时，再降温15℃～20℃继续发酵至总发酵时间为80h。

三、结果分析

通过采用本实验的方法与对照组的方法分三批实验进行分析后，得出的芽孢数结果如下：

1.芽孢数比较分析：

表5对照组的三批次实验的芽孢数

表6本实验的三批次实验的芽孢数

结果分析：由于本实验将培养基进行了优化，更适合枯草芽孢杆菌芽孢的产生，因此改进后的工艺芽孢数比对照组芽孢数提高了93.4％。

2.抑菌率比较分析：

表7对照组的三批次抑菌率

表8本实验的三批次抑菌率

结果分析：通过本实验的方法优化培养枯草芽孢杆菌，芽孢数得到了明显提高，其在种间竞争中占据了绝对的优势，所以本实验的菌株对3株致病菌的抑菌率得到了明显的提高。

3.抑菌持续时间比较分析：

表9对照组的三批次抑菌时间

表10本实验的三批次抑菌时间

结果分析：因为本实验的菌株经过优化培养，且成品能够在伤口上能够形成一层菌膜，减少了药物流失，加大了药物的局部浓度，利用生物拮抗作用，起到防治外袭菌的感染和抑菌的作用，延长抑菌时间。而对照组并不具备这一特性，因此，其抑菌时间不如本实验。

4.发酵时间比较分析：

表11对照组的三批次发酵时间

表12本实验的三批次发酵时间

结果分析：通过本实验的方法，缩短了枯草芽孢杆菌的发酵培养时间，控制其在对数生长期内，提高了菌株的活性；在发酵培养基中添加1％琼脂粉既延长抑菌时间，又省去离心收集菌体的步骤，缩短了发酵时间。对照组的方法发酵时间为140h，本实验的方法发酵时间122h，缩短了18h。

通过以上分析可知，LB液体培养基中的有效成分更容易被枯草芽孢杆菌利用，发酵过程中活菌数的增高为芽孢的增产奠下了坚实的基础。氯化钙和氯化锰为枯草芽孢杆菌形成芽孢过程中重要的金属盐离子，而发酵过程中降低温度是为了提供菌株生长的逆境，更有利于枯草芽孢杆菌进入抗逆休眠体状态。在以上理论基础的支持下，进行工艺优化，最终改进后的工艺比原始工艺芽孢数增加3.0×10⁸CFU/mL左右。

实验2

将实验1优化培养后的枯草芽孢杆菌加入到营养液中，混合均匀后，在加入甘油和萘磺酸钠甲醛缩合物，混合后即得枯草芽孢杆菌喷雾剂；所述的营养液占喷雾剂的比例为85～94％，甘油占喷雾剂的比例为5～10％，萘磺酸钠甲醛缩合物占喷雾剂的比例为1～5％；

所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐和余量的水组成，其中，碳源、氮源和无机盐的质量比为：3:2:1；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖于薄荷多糖按质量比为1：2：2的比例组成；所述的氮源为大豆粉；所述的枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；

所述的无机盐是由质量百分含量为0.05％的氯化钙水溶液、质量百分含量为0.05％的氯化锰水溶液、质量百分含量为0.1％的硫酸镁水溶液和质量百分含量为0.2％的磷酸氢二钠水溶液按等比例混合而成。

所述的芦荟多糖的提取是按以下步骤进行：

二、按质量体积比为1:30g/mL的比例将芦荟干粉放入蒸馏水中，复水30min后用超声波辅助进行提取，然后8000r/min离心15min，取上清液，再放入旋转发仪在0.085MPa，65℃的条件下浓缩至原体积的1/3，然后加入4倍体积的无水乙醇再置于4℃冰箱，静置过夜，然后2500r/min离心10min，取沉淀，即完成。

所述的薄荷多糖是按以下步骤制备的：

一、称取干燥的薄荷药材，粉碎后过40目～60目筛，得到薄荷粉末；将薄荷粉末加入到蒸馏水中浸泡15h，再加热回流提取2h，得到混合物A；向混合物A中加入纤维素酶，调节pH值至5～6，再在温度为48℃、pH值为5～6的条件下酶解1h，得到纤维素酶水解后的混合物A；

步骤一中所述的纤维素酶的加入量与混合物A的质量比为1:100；

二、向纤维素酶水解后的混合物A中加入蛋白酶和菠萝蛋白酶，调节pH至7～7.5，再在温度为55℃下酶解1.5h，得到提取液；

步骤二中所述的蛋白酶的加入量与纤维素酶水解后的混合物A的质量比为0.5:100；步骤二中所述的菠萝蛋白酶的加入量与纤维素酶水解后的混合物A的质量比为0.4:100；

三、使用旋转蒸发仪在温度为65℃下将提取液的体积减压浓缩至原体积的1/3，得到浓缩液；向浓缩液中加入无水乙醇，再在室温下静置12h，再进行抽滤，得到沉淀物质；依次使用无水乙醇、无水乙醚和丙酮洗涤对沉淀物质分别清洗3次～5次，再在零下20℃，冷冻干燥8h，得到薄荷多糖；

步骤三中所述的浓缩液的体积与无水乙醇的体积比为1:5。

创伤面的治疗应用：

首先，在烧伤创面涂喷涂实验1的枯草芽孢杆菌喷雾剂，然后再烧伤创面涂抹羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶。涂抹羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶先施用到创伤面；

所述的羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶是按照以下步骤进行的：

一、将羧甲基纤维素钠和海藻酸钠在温度为60℃条件下加入到水中搅拌至完全溶解后，得混液；二、调节步骤一混液的渗透压摩尔浓度至320mOsmol/kg，然后加水调节羧甲基纤维素钠的质量浓度至5％，海藻酸钠质量浓度至0.3％，得羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶，将羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶灭菌后，即完成。

按照实验2的方式进行如下临床实验：

1、实验对象：

以北京积水潭医院，北京解放军三O四医院，黑龙江省医院和哈医大附属第一医院对本实验进行临床研究。

1.1、实验组

共250例烧伤病人，其中，烧伤面积10％以内69例，11％～30％者71例，30％以上者43例。浅Ⅱ°创面74例，深Ⅱ°创面54例，深浅混合Ⅱ°创面55例，Ⅲ°创面50例，清洁创面53例，感染创面187例。

1.2、对照组

240例，其中，烧伤面积10％以内者112例，11％～30％者58例，30％以上者48例。浅Ⅱ°创面81例，深Ⅱ°创面59例，深浅Ⅱ°混合创面52例，Ⅲ°创面34例，清洁创面45例，感染创面178例。对照组包含：第一对照组：创面暴露或者半暴露疗法，不外用药；第二对照组：创面用磺胺嘧啶银(Ag-SD)。

2、给药方式

首先对烧伤创面先清创，用无菌纱布拭干创面渗出物和分泌物后，均匀喷施抑菌生制剂，厚度为0.2cm，不需包扎，然后再涂抹羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶。雾液喷口离创面距离不应超过5cm，创面不用其他外用药物。治疗早期每天喷洒2～3次，待结痂形成后，每天一次。

3、结果观察

实验组的浅Ⅱ°创面用药后，24h后与创面连接紧密，痂膜逐渐增厚变硬，创面在48h结薄痂，干燥，痂下无分泌物，创缘无红肿，均可达到在薄痂下愈合；深Ⅱ°用药创面保持干燥，创缘无红肿，痂下无分泌物，大部分可达到痂下愈合，部分较深创面需脱痂换药后愈合。Ⅱ°多经切痂植皮或肉芽创面植皮愈合，部分晚期小创面用药后，感染轻，可较快愈合。Ⅲ°创面可保痂植皮。两组各种Ⅱ°创面平均愈合天数见表1所示。两组实验前后G+菌检出率如表2所示，用药前后创面致病菌总检出率如表4所示，治疗第3天两组全身情况比较结果如表5所示，创面细菌定量CFU/g(x±s)值如表6所示。

表1两组不同深度创面平均愈合天数比较

*P＜0.05

表2两组实验前后G+菌检出率

与试验组比△：p＜0.05△△△：p＜0.001

Ⅲ°创面(包括Ⅲ°清洁创面和感染创面)治疗前及治疗后第4天痂下组织致病菌培养结果表明：治疗后第4天痂下组织致病菌培养阳性率及平均菌量两组相比，差别极显著，有效率占92.1％；对照组痂下组织菌量≥105/g的有7例，其中金葡球菌4例，绿脓杆菌3

例，鲍氏不动杆菌2例，见表3。

表3两组Ⅲ°创面治疗前及治疗后第4天痂下组织培养结果比较

*P＜0.01

表4用药前后创面致病菌总检出率

与试验组比△：p＜0.05△△△：p＜0.001

治疗后第3天两组全身情况比较见表3。

表5治疗第3天两组全身情况比较

表6创面细菌定量CFU/g(x±s)

△：p＜0.01

由上述实验可知，在参加临床研究的四家医院在烧伤创面诊断标准，用药方法，观察指标，细菌学检测方法均一致，各医院患者基本情况的前提下，其研究结果可以说明本枯草芽孢杆菌BS₂₂₄喷雾剂对致病菌的作用，具体如下：

枯草芽孢杆菌BS₂₂₄喷雾剂，对各种Ⅱ°创面可控制感染、防止感染加重；由于创面感染得以控制，则加速了创面愈合的速度，缩短了治愈时间，与对照组相比差别极显著，说明抑菌生可在短时间内抑制创面细菌的生长，有效的防止了创面脓毒症的发生，为保护创面植皮手术的成功创造了良好的条件。枯草芽孢杆菌BS₂₂₄喷雾剂有较好的收敛作用，可以形成薄痂，保护创面，创面感染轻，有利于愈合。浅Ⅱ°愈合良好，大部分深Ⅱ°可达到痂下愈合，较国内外烧伤界公认疗效最好的磺胺嘧啶银愈合速度快。

同时结合羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶，具有很好地止血作用，由于羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶能够形成致密的三维网状支架，具有钻石形亲水空间和大量亲水基团的三维网状支架，使其具有高吸湿性，能够迅速地吸收创面的渗血和渗液，形成分子海绵，压迫封堵创面，同时为血小板聚集提供框架，起到辅助止血作用。

从机体的全身反应结果可以看到，实验组血培养无阳性数，对照组则为2.50％，两组差别显著。说明抑菌生不仅能抑制创面感染，还能防止败血症发生。

并且，未发现本菌种导致的侵袭性感染以及脏器转移性感染，全身无感染。试验组病人未发现心、肺、肾、血液的异常变化，也未发现过敏等全身及局部的不良反应。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于它由枯草芽孢杆菌和基质组成；所述枯草芽孢杆菌喷雾剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为5.6～5.9×10⁸CFU/mL；所述的基质是按质量百分比由85～94％的营养液、5～10％的甘油和1～5％的分散剂组成，所述的营养液是由碳源、氮源、无机盐及水混合而成，其中，营养液中碳源的浓度为3～5mg/mL、营养液中氮源浓度为10～13mg/mL、营养液中无机盐浓度为0.05～0.1mg/mL；所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：(2～3)：(2～3)的比例组成；所述的氮源为大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉；所述的分散剂为萘磺酸钠甲醛缩合物或吐温-80。

2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的无机盐是由质量百分含量为0.05％的氯化钙水溶液、质量百分含量为0.05％的氯化锰水溶液、质量百分含量为0.1％的硫酸镁水溶液和质量百分含量为0.2％的磷酸氢二钠水溶液按等比例混合而成。

3.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的碳源是由葡萄糖、芦荟多糖和薄荷多糖按质量比为1：2：2的比例组成。

4.根据权利要求1或3所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的芦荟多糖的提取是按以下步骤进行：

二、按质量体积比为1g:30mL的比例将芦荟干粉放入蒸馏水中，复水30min后用超声波辅助进行提取，然后8000r/min离心15min，取上清液，再放入旋转蒸发仪在0.085MPa，65℃的条件下浓缩至原体积的1/2～1/3，然后加入4倍体积的无水乙醇再置于4℃冰箱，静置过夜，然后2500r/min离心10min，取沉淀，即完成。

5.根据权利要求1或3所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的薄荷多糖是按以下步骤制备的：

步骤三中所述的浓缩液的体积与无水乙醇的体积比为1:(4～6)。

6.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌是按照以下步骤进行优化培养的：

三、取步骤二培养的枯草芽孢杆菌液接种至含有质量百分含量为0.009～0.08％的氯化钙和质量百分含量为0.01～0.07％的氯化锰的LB液体培养基中，在培养温度为37℃、转速为200rpm、pH为7.2～7.4、通气比例为1:1的条件下培养20h，然后将培养温度降至15℃～20℃继续培养60h，即完成所述的枯草芽孢杆菌的优化。

7.根据权利要求1或6所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌为BS224菌株。

8.根据权利要求6所述的一种枯草芽孢杆菌喷雾剂，其特征在于所述的LB液体培养基是由葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、氯化钙和氯化锰混合而成，其中，LB液体培养基中葡萄糖的浓度为4g/L、酵母膏的浓度为12g/L，蛋白胨的浓度为1.5g/L。