CN104878127A - 一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法 - Google Patents

一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法，涉及发酵工程技术领域。本发明在灵芝液体种子培养及摇瓶培养过程采用日光灯包覆不同彩色塑料薄膜的方式控制光照条件，其中在液体种子培养阶段，采用日光灯包覆红膜及黄膜交替；在摇瓶培养阶段采用日光灯包覆黄膜、绿膜与蓝膜交替。通过调控各个发酵过程中的光照条件及培养基组分，改变灵芝菌丝体生长发育状态，以提高灵芝多糖的产量及品质，同时本发明方法简单，经济效益高。

Description

一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法
技术领域：
本发明涉及发酵技术领域，具体涉及一种调控液体培养光照条件以提高灵芝液体发酵多糖产量的方法。
背景技术：
多糖是存在于自然界中的醛糖和酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物，是一切有生命的有机体不可缺少的成分。多糖在海藻、真菌和高等植物中甚为丰富。多糖作为生物效应调节剂，不仅是一种非特异性免疫增强剂，还具有降血糖、降血压、降胆固醇等多种功能。
灵芝，别名赤芝、木灵芝、灵芝草，古称“瑞草”。在真菌分类上属担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，灵芝属。灵芝研究最多的是灵芝多糖(Ganodermalucidum Polysaccharide)。灵芝多糖是灵芝的主要活性成分，其种类很多，有葡聚糖、杂聚糖、半乳糖聚糖、甘露糖聚糖、甘露岩藻半乳聚糖、阿拉伯糖、阿拉伯木质葡聚糖等。
灵芝多糖的主要生物活性有：(1)调节免疫功能。(2)抗肿瘤作用。(3)刺激胰岛素分泌，促进葡萄糖在外周组织的利用，降低血糖。(4)促进核酸、蛋白质的代谢。(5)消炎。(6)抗放射与促进骨髓造血机能。(7)抗氧自由基作用。(8)对心血管系统的调节作用。(9)保肝解毒作用。
灵芝子实体对光照很敏感，而且有向光生长的特性。光照强度和光源方向对子实体生长都有很大影响。据测，光照强度在4000-6000LUX时子实体发育正常，菌柄粗壮，菌盖厚大；光线较强时菌柄细小，不分化菌盖或形成小而薄的菌盖。在子实体原基形成之后，不可随意改变光源的方向或挪动栽培袋位置，否则会影响子实体正常生长，易形成畸形灵芝。若为立袋栽培，为了使子实体正常发育，一般在原基形成之后先在顶面透光，使菌柄向上伸长，菌盖分化后，顶面遮光，改为单面透光，使菌盖沿水平向光源生长，这样就可形成菌柄与菌盖垂直且菌盖呈扇形的规则子实体。当光照为0时，平均每天的生长速度为9.8mm。在光照度为50LUX时为9.7mm,而当光照度为3000LUX时，则只有4.7mm，因此强光具有明显抑制菌丝生长作用。菌丝体在黑暗中生长最快，虽然光照对菌丝体发育有明显的抑制作用，但是对灵芝子实体生长发育有促进作用，子实体若无光照难以形成，即使形成了生长速度也非常缓慢，容易变为畸形灵芝，菌柄和菌盖的生长对光照也十分敏感，20-100LUX，只产生类似菌柄的突起物，不产生菌盖，300-1000LUX，菌柄细长，并向光源方向强烈弯曲，菌盖瘦小；3000-1万LUX菌柄和菌盖正常，以人工栽培灵芝时，可以人为的控制光照强度，进行定向和定型培养出不同形状的商品药用灵芝和盆景灵芝。
中国发明专利CN101235393公开了一种促进灵芝酸或灵芝多糖生物合成的发酵方法。该发明对灵芝细胞生长阶段和产物合成阶段所需要的条件进行了考察，依据灵芝细胞生长和产物合成阶段所需环境条件的不一致性，分别考察了pH两阶段、溶氧两阶段的控制策略对灵芝酸和灵芝多糖生物合成的影响，在此基础上，结合中间补料策略，又分别考察了pH两阶段、溶氧两阶段控制策略或补料策略相互协同在一起后对灵芝酸和灵芝多糖生物合成的影响。试验结果说明，无论是分别采用pH值两阶段控制策略、溶氧浓度两阶段控制策略或是将pH两阶段控制策略、溶氧浓度两阶段控制策略与补料策略协同在一起，均显著促进灵芝细胞生长，大幅度提高灵芝酸或灵芝多糖的含量或产量。
中国发明专利CN101880700A涉及了一种提高灵芝多糖产量的液体发酵方法。该方法是利用灵芝细胞的液体培养，通过在培养基中添加稀土元素镨、钕或镧，提高灵芝多糖的产量。所产灵芝多糖可用于免疫力调节、抗肿瘤、降血糖等药物的制备。
发明内容：
本发明开拓了灵芝液体发酵提高菌丝体多糖含量的新方向，调控各个发酵过程中的光照条件及培养基组分，改变灵芝菌丝体生长发育状态，以提高灵芝多糖的产量及品质。
为了达到以上目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法，灵芝在液体种子培养及摇瓶培养过程采用日光灯包覆不同彩色塑料薄膜的方式控制光照条件:
其中在液体种子培养阶段，采用日光灯包覆红膜及黄膜交替控制光照；
在摇瓶培养阶段采用日光灯包覆黄膜、绿膜与蓝膜交替控制光照。
优选的，所述灵芝菌种为赤灵芝(Ganoderma lucidum)、紫灵芝(Ganodermajaponcium)或者薄盖灵芝(Ganoderma applanatum)中的一种。
优选的，所述液体种子培养阶段，日光灯包覆红膜，其红光波长范围为620-780nm，包覆黄膜其波长范围为560-590nm；
所述在摇瓶培养阶段，日光灯包覆黄膜，其波长范围为560-590nm、包覆绿膜，其波长范围为460-550nm、包覆蓝膜，其波长范围为380-450nm。
优选的，所述液体种子培养阶段，培养过程一：光照条件：日光灯包覆红膜、光照强度：1000LUX、培养时间：3天；培养过程二：日光灯包覆黄膜、光照强度：800LUX、培养时间：1天；培养过程三：日光灯包覆红膜、光照强度：1000LUX、培养时间：2天；培养过程四：日光灯包覆黄膜、光照强度：1000LUX、培养时间：1天。
优选的，所述摇瓶培养阶段，培养过程一：光照条件：日光灯包覆黄膜、光照强度：1000LUX、培养时间：2天；培养过程二：日光灯包覆绿膜、光照强度：1000LUX、培养时间：1天；培养过程三：日光灯包覆蓝膜、光照强度：1000LUX、培养时间：2天；培养过程四：日光灯包覆黄膜、光照强度：1000LUX、培养时间：1天。
优选的，所述液体种子培养基配方为：蛋白胨1.7％，葡萄糖2.2％，KH2P040.15％，MgS040.07％，ZnSO40.01％。
优选的，所述摇瓶培养基配方为：蛋白胨1.6％，葡萄糖2.1％，KH2P040.12％，MgS040.05％，ZnSO40.01％。
优选的，所述液体种子培养基的pH为7.8-7.9。
优选的，所述摇瓶培养基的pH为7.9-8.0。
本发明的有益效果：
1.本发明过调控各个发酵过程中的光照条件及培养基组分，改变灵芝菌丝体生长发育状态，以提高灵芝多糖的产量及品质，开拓了液体发酵培养提高菌丝体多糖含量的新方向。
2.本发明方法简单，重复性好，经济效益高，具有较高的工业化应用前景。
具体实施方式：
下面对本发明的实施例做详细的说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件的实验方案，通常按照常规条件或者制造商所建议的条件实施。
菌种培养流程：
菌种→斜面培养→种子培养→摇瓶培养→收获。
种子培养的培养基配方为：
蛋白胨1.7％，葡萄糖2.2％，KH2P040.15％，MgS040.07％，ZnSO40.01％，培养基pH为7.8-7.9。
摇瓶培养的培养基配方为：
蛋白胨1.6％，葡萄糖2.1％，KH2P040.12％，MgS040.05％，ZnSO40.01％，培养基的pH为7.9-8.0。
培养实验一：
种子培养过程及药瓶培养过程为：
液体种子培养：将斜面灵芝菌种接种到液体种子培养基中，培养过程一：旋转速度：200r/min、培养温度：29℃、培养时间：3天；培养过程二：旋转速度：60r/min、培养温度：3℃、培养时间：1天；培养过程三：旋转速度：160r/min、培养温度：28℃、培养时间：2天；培养过程四：旋转速度：170r/min、培养温度：29℃、培养时间：1天。
摇瓶培养：将液体种子按照14％(v/v)接种到摇瓶培养基中，培养过程一：旋转速度：130r/min、培养温度：28℃、培养时间：2天；培养过程二：旋转速度：10r/min、培养温度：4℃、培养时间：1天；培养过程三：旋转速度：180r/min、培养温度：30℃、培养时间：2天；培养过程四：旋转速度：170r/min、培养温度：29℃、培养时间：1天。
液体种子培养：
培养过程一：光照条件：日光灯包覆红膜、光照强度：1000LUX；
培养过程二：日光灯包覆黄膜、光照强度：800LUX；
培养过程三：日光灯包覆红膜、光照强度：1000LUX；
培养过程四：日光灯包覆黄膜、光照强度：1000LUX。
摇瓶培养阶段：
培养过程一：光照条件：日光灯包覆黄膜、光照强度：1000LUX；
培养过程二：日光灯包覆绿膜、光照强度：1000LUX；
培养过程三：日光灯包覆蓝膜、光照强度：1000LUX；
培养过程四：日光灯包覆黄膜、光照强度：1000LUX。
上述液体种子培养阶段，日光灯包覆红膜，其红光波长范围为620-780nm，包覆黄膜其波长范围为560-590nm；
上述摇瓶培养阶段，日光灯包覆黄膜，其波长范围为560-590nm、包覆绿膜，其波长范围为460-550nm、包覆蓝膜，其波长范围为380-450nm。
实施例一：
实验菌种：泰山赤灵芝，购自某农科院食用菌研究室。
实施例二：
实验菌种：长白山紫灵芝，购自某农科院食用菌研究室。
实施例三：
实验菌种：海南吊罗山薄盖灵芝，购自某农科院食用菌研究室。
培养实验二：
种子培养过程及药瓶培养过程为：
液体种子培养：将斜面灵芝菌种接种到液体种子培养基中，培养过程一：旋转速度：200r/min、培养温度：30℃、培养时间：3天；培养过程二：旋转速度：50r/min、培养温度：4℃、培养时间：1天；培养过程三：旋转速度：160r/min、培养温度：29℃、培养时间：2天；培养过程四：旋转速度：170r/min、培养温度：29℃、培养时间：1天。
摇瓶培养：将液体种子按照12％(v/v)接种到摇瓶培养基中，培养过程一：旋转速度：130r/min、培养温度：28℃、培养时间：2天；培养过程二：旋转速度：0r/min、培养温度：4℃、培养时间：1天；培养过程三：旋转速度：180r/min、培养温度：30℃、培养时间：2天；培养过程三：旋转速度：170r/min、培养温度：29℃、培养时间：1天。
液体种子培养：
培养过程一：光照条件：日光灯包覆红膜、光照强度：1000LUX；
培养过程二：日光灯包覆黄膜、光照强度：800LUX；
培养过程三：日光灯包覆红膜、光照强度：1000LUX；
培养过程四：日光灯包覆黄膜、光照强度：1000LUX。
摇瓶培养阶段：
培养过程一：光照条件：日光灯包覆黄膜、光照强度：1000LUX；
培养过程二：日光灯包覆绿膜、光照强度：1000LUX；
培养过程三：日光灯包覆蓝膜、光照强度：1000LUX；
培养过程四：日光灯包覆黄膜、光照强度：1000LUX。
上述液体种子培养阶段，日光灯包覆红膜，其红光波长范围为620-780nm，包覆黄膜其波长范围为560-590nm；
上述摇瓶培养阶段，日光灯包覆黄膜，其波长范围为560-590nm、包覆绿膜，其波长范围为460-550nm、包覆蓝膜，其波长范围为380-450nm。
实施例四：
实验菌种：泰山赤灵芝，购自某农科院食用菌研究室。
实施例五：
实验菌种：长白山紫灵芝，购自某农科院食用菌研究室。
实施例六：
实验菌种：海南吊罗山薄盖灵芝，购自某农科院食用菌研究室。
将上述实施例一到六收获得到的菌体采用干重法测定：
取发酵液1000毫升，在离心机中离心处理(6000rpm/min，20min)，将分离得到的沉底与100目尼龙网中用蒸馏水洗涤多次，然后置于80℃条件下干燥至恒重。
统计上述实施例一至六收获得到的菌体的粗多糖含量，测定方法如下：
取发酵液50毫升，加50毫升的水，在沸水中提取1小时，冷却至室温，在离心机中离心处理(6000rpm/min，20min)，取上清液，加入5倍95％质量的酒精沉淀1小时，再在离心机中离心处理(3000rpm/min，15min)，用无水乙醚洗涤沉淀，将沉淀60℃下干燥至恒重，即为粗多糖。
结果分析：
表一：菌体干重及粗多糖含量
菌丝体干重(g/L) 粗多糖(g/L)
实施例一 8.36±0.42 1.745±0.21
实施例二 7.86±0.29 1.821±0.33
实施例三 7.12±0.37 1.805±0.40
实施例四 8.54±0.25 1.769±0.28
实施例五 7.88±0.33 1.574±0.26
实施例六 8.12±0.41 1.623±0.31
上述结果均以平均数±方差的方式表达。本发明实施例菌丝体干重及粗多糖含量较普通液体培养灵芝菌丝体干重及粗多糖含量均有极大的提高。
以上内容仅为本发明的较佳实施方式，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法，其特征在于：
灵芝在液体种子培养及摇瓶培养过程采用日光灯包覆不同彩色塑料薄膜的方式控制光照条件；
其中在液体种子培养阶段，采用日光灯包覆红膜及黄膜交替控制光照；
在摇瓶培养阶段采用日光灯包覆黄膜、绿膜与蓝膜交替控制光照。
2.根据权利要求1所述的一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法，其特征在于：所述灵芝菌种为赤灵芝、紫灵芝或者薄盖灵芝中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法，其特征在于：所述液体种子培养阶段，日光灯包覆红膜，其红光波长范围为620-780nm，包覆黄膜其波长范围为560-590nm；所述在摇瓶培养阶段，日光灯包覆黄膜，其波长范围为560-590nm、包覆绿膜，其波长范围为460-550nm、包覆蓝膜，其波长范围为380-450nm。
4.根据权利要求1所述的一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法，其特征在于：所述液体种子培养阶段，培养过程一：光照条件：日光灯包覆红膜、光照强度：1000LUX、培养时间：3天；培养过程二：日光灯包覆黄膜、光照强度：800LUX、培养时间：1天；培养过程三：日光灯包覆红膜、光照强度：1000LUX、培养时间：2天；培养过程四：日光灯包覆黄膜、光照强度：1000LUX、培养时间：1天。
5.根据权利要求1所述的一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法，其特征在于：所述摇瓶培养阶段，培养过程一：光照条件：日光灯包覆黄膜、光照强度：1000LUX、培养时间：2天；培养过程二：日光灯包覆绿膜、光照强度：1000LUX、培养时间：1天；培养过程三：日光灯包覆蓝膜、光照强度：1000LUX、培养时间：2天；培养过程四：日光灯包覆黄膜、光照强度：1000LUX、培养时间：1天。
6.根据权利要求1所述的一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法，其特征在于：所述液体种子培养基配方为：蛋白胨1.7％，葡萄糖2.2％，KH2P040.15％，MgS040.07％，ZnSO40.01％。
7.根据权利要求1所述的一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法，其特征在于：所述摇瓶培养基配方为：蛋白胨1.6％，葡萄糖2.1％，KH2P040.12％，MgS040.05％，ZnSO40.01％。
8.根据权利要求1所述的一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法，其特征在于：所述液体种子培养基的pH为7.8-7.9。
9.根据权利要求1所述的一种提高灵芝多糖产量的调光液体培养方法，其特征在于：所述摇瓶培养基的pH为7.9-8.0。
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