CN104878122A - 一种利用实时荧光pcr检测偏肺病毒的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明是一种利用实时荧光PCR检测偏肺病毒的方法和组合物。本发明的方法包括利用Trizol法提取受试样品的RNA，逆转录样本RNA至cDNA和利用实时定量PCR检测受试样品是否携带偏肺病毒的步骤。本发明将实时荧光PCR技术应用于偏肺病毒的诊断，使检测的灵敏度更高、特异性更好，提高了偏肺病毒的检出率。其可以应用于临床诊断受试者是否携带偏肺病毒和/或用于实验室对偏肺病毒的检测。本发明不仅使偏肺病毒的RNA提取以及偏肺病毒检测效果得到增强，同时还节约了成本。

Description

一种利用实时荧光PCR检测偏肺病毒的方法和组合物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地为基于实时定量PCR的技术，用于偏肺病毒的诊断方法。

背景技术

偏肺病毒属于副粘液病毒亚科，是偏肺病毒属的一类新成员。偏肺病毒是人类特别是婴幼儿呼吸道感染相关的病毒，特别是1岁以下的儿童，成为仅次于RSV的导致儿童生病的重要感染源。同时，呼吸道感染也是是世界范围内导致人类发病和死亡的主要原因之一。偏肺病毒主要可以引起人的上呼吸道感染和下呼吸道感染，主要的临床特征主要表现为咳嗽、喘息、流涕、头痛、发热等症状。由于感染的症状与其他流感疾病的症状无差异，因此难以根据临床表征将偏肺病毒感染者筛选出来。

关于偏肺病毒的诊断手段，目前主要包括有：传统的病毒分离培养、血清学诊断、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测、两步法实时定量PCR法等。在目前检测手段中，传统的病毒分离培养操作时间长，并且检测的生物安全风险较高。对于血清学检测，由于缺少合适的交叉反应抗原，使这一方法的应用受到了限制。同时，RT-PCR检测由于需要结合凝胶电泳进行检测，从而造成其实验操作麻烦以及实验所需时间较长。其中，实时荧光PCR的检测最为成熟。实时荧光 RT-PCR检测的优点是避免了样本间的污染并且节省了操作时间，但是其缺点是检测结果的Ct值偏大，对于低拷贝数的样本检测灵敏度不高，同时还需要额外增加步骤保留样本cDNA。两步法实时定量PCR的检测手段虽然在实验操作上较实时荧光RT-PCR复杂，但其提取RNA以及逆转录RNA效率高，同时还能提高检测的灵敏度。

偏肺病毒是单股负链RNA病毒，基因全长约13kb，其中偏肺病毒包括有两种亚型，分为A亚型和B亚型。偏肺病毒拥有8个基因和9个开放的阅读框，能编码9种不用的蛋白质，其中包括有编码核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合基因(F)，转录延长因子/RNA合成调节因子(M2)，小疏水表面蛋白(SH)，主要侵袭糖蛋白(G)，多聚合酶亚单位(L)等。其中，F、N、L基因是目前大部分用于检测的扩增基因，但同时也有选择G、M基因用于扩增检测的方法。由于病毒有两个基因型，因此选择合适的检测目的基因以及根据目的基因所设计的引物是直接影响偏肺病毒检出率的重要因素。

实时定量PCR是在DNA的扩增反应中，通过添加荧光化学物质以测定每次PCR循环后产物总量的方法。利用逆转录技术将提取的RNA在体外逆转录为cDNA序列。然后利用实时定量PCR技术，通过测定扩增过程中荧光信号的强弱，进而对PCR的过程进行检测，以达到定量测定的目的。目前比较常用的有SYBR GREEN法和TaqMan探针法。同时，由于在定量PCR的过程中，利用荧光信号便可直接检测所扩增目标序列的存在，因此也是实现快速检测目标序列 的方法之一。由于实时定量PCR技术能检测低拷贝数目的核苷酸，而且有着特异性高、精确度强、操作时间短以及重复性好等优点，已被广泛用于疾病检测领域。在现有的与本发明类似的两步法实时定量PCR技术检测偏肺病毒的检测方法(专利号：CN200910103609、专利号：CN200810027105)中，由于其缺少效率高的RNA提取法方法，同时提取的成本较高，以及缺少覆盖面广、特异型性高组合物，从而使其在临床诊断中未被广泛采用。

通过对偏肺病毒诊断方法的改进以及对诊断组合物的开发，可以实现对偏肺病毒的快速、灵敏的检测，不仅可以实现该病的患者得到及时准确的治疗，同时还可帮助监测偏肺病毒的流行趋势以及进行相关研究，并且还可以对偏肺病毒相关治疗效果进行检测。尽管目前对偏肺病毒的相关诊断有很多研究，但目前临床上对偏肺病毒的检测仍然处于瓶颈期，其中主要是缺少能检测偏肺病毒的特异性强和检出率高的组合物，以及简洁、效率高的检测操作方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种诊断受试者是否携带偏肺病毒的检测方法。

本发明的另一目的在于提供用于检测偏肺病毒的组合物。

本发明的第一个方面，在于提供了一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，其中包括有利用Trizol法提取受试样品的RNA，逆转录样本RNA至cDNA和利用实时定量PCR检测受试样品是否携带 偏肺病毒的步骤。其中，相对于对照样品中实时荧光PCR的测定结果，受试样品测定结果如果能计算出Ct值或检测曲线呈S型，即表明受试者携带有偏肺病毒。

在一个实施方案中，Trizol法提取偏肺病毒的步骤为利用生理盐水清洗两次咽试子并收集细胞，并利用Trizol试剂裂解细胞。然后利用氯仿(按照200ul/1mlTrizol的比例)去蛋白，吸出的上清中再等体积加入异丙醇沉淀RNA，最后用75％的乙醇(1ml75％乙醇/1mlTrizol的比例)清洗RNA。处理的RNA可保存在75％乙醇溶液中并贮存与-70℃或直接进行逆转录步骤。

在一个实施方案中，逆转录提取的样本RNA至cDNA使用了Invitrogen的M-MLV逆转录试剂盒，但也可使用其他方法或试剂盒进行逆转录。

在一个实施方案中，本发明提供了偏肺病毒融合基因(F)的特异性探针/检测引物作为诊断组合物，其中所述的诊断组合物用于测定从受试者中所提取的咽试子的逆转录产物。通过结合实时定量PCR，从而可以判断受试样品中是否含有偏肺病毒。其中，相对于对照样品中的实时定量PCR结果，受试样品中的实时定量PCR的结果如果能计算出Ct值或检测曲线呈S型，即表明受试者携带有偏肺病毒。

在一个实施方案中，当本发明的方法用于诊断受试者是否携带偏肺病毒时，所使用的对照样品包括有阳性对照样品以及阴性对照样品。阳性对照样品来自于阳性对照组，例如预先诊断为携带偏肺病毒 患者咽试子提取物的逆转录cDNA或偏肺病毒阳性患者的咽试子。阴性对照样品来自于阴性对照组，例如未被诊断携带偏肺病毒患者的咽试子或其咽试子提取物的逆转录cDNA，以及DEPC水、生理盐水。

本发明的第二方面，提供了一种用于检测偏肺病毒的诊断组合物，其中所述诊断组合物包含有用于检测偏肺病毒融合基因(F)的特异性引物/探针。引物的设计参考于GenBank中的序列，其中A亚型参考AF371337.2，B亚型参考AY304361.1。对于A亚型，本发明设计了一组上、下引物(hMPV-For1、hMPV-Rev1)。对于B亚型，本文设计了两组引物，包含有两个上游引物(hMPV-For2a、hMPV-For2b)，一个下游引物(hMPV-Rev2)。由于需要同时检测A亚型和B亚型，本发明设计了一种通用探针(hMPV-Uni)，其可用于平行检测偏肺病毒的A与B两种亚型。其中使用的通用探针的5’端荧光报告基因可选择FAM、、HEX、TET等，3’端淬灭基因可选择TAMRA、、MGB等。优选的，5’荧光基因为FAM，3’端淬灭基因为MGB。在进行检测的时候，将A亚型和B亚型的引物按相同的比例混合加入实时荧光PCR的扩增体系中，并同时加入通用探针，即可同时检测出偏肺病毒的两种亚型。

在一个实施方案中，等浓度添加偏肺病毒诊断组合物的引物(hMPV-For1、hMPV-Rev1、hMPV-For2a、hMPV-For2b、hMPV-Rev2)至实时定量PCR的检测体系中。在20μl检测体系中，每个引物的终浓度为0.9μM。同时，检测所用的通用探针(hMPV-Uni-Fam)在检测体系中的终浓度为0.2μM。另外，在20μl体系中加入5μl cDNA溶 液，余下体积需用ddH₂0补足。实时荧光PCR检测的程序设置为60℃30s，接着95℃10min，随后95℃15s，60℃1min进行45个循环，最后60℃30s。

在一个实施方案中，从获自受试者的咽试子样品中，利用Trizol法提取RNA，然后逆转录RNA至cDNA。通过利用偏肺病毒的诊断组合物并结合实时定量PCR的方法对cDNA进行检测，并比对受试样品与对照样品的检测结果。受试样品的检测结果若与阳性样品的检测结果类似，即受试样品测定结果如果能计算出Ct值或检测曲线呈S型，则表明受试者携带有偏肺病毒。

表1、偏肺病毒诊断组合物

*偏肺病毒的A与B亚型序列参考于GenBank，其中A亚型参考AF371337.2，B亚型参考AY304361.1。

在本发明中，“受试者”是急性呼吸道感染就诊于门诊及住院患者，为具有或怀疑携带偏肺病毒的患者。

在本发明中，“受试样品”是提取的受试者两侧腭弓和咽、扁桃体上的分泌物。受试样品需要经过RNA的提取，再经过逆转录步骤使RNA为cDNA以后，才能用于实时定量PCR的检测。

本发明改进了原来两步法实时定量PCR检测偏肺病毒方法中的RNA提取方法。通过利用Trizol法提取偏肺病毒的RNA，可以提高偏肺病毒RNA的提取效果，并进一步提高偏肺病毒的检测效果。同时，本发明还改进了原有方法中针对偏肺病毒不同亚型只设计一种引物的方法。本发明通过根据偏肺病毒不同亚型设计不同的引物，并在进行实时定量PCR检测的时候同时等比例加入五中引物，可以进一步提高偏肺病毒的检出率。

本发明的创新点主要为以下三个方面。第一，本发明选用了F 基因保守区段作为检测偏肺病毒的目的片段。与其他的实验方法所采用的N基因、G基因以及M基因等作为目的基因相比，F基因具有序列多样性低、保守性高的特点，因此更适合作为检测偏肺病毒的特异基因。第二，本发明所设计的用于检测偏肺病毒的实时荧光的引物，兼顾了偏肺病毒的两种亚型以及存在的变异的特性。在设计实时荧光检测的引物中，本发明分别对偏肺病毒A亚型以及B亚型设计了不同的两套引物，并同时针对B亚型设计了两个不同的上游引物，从而进一步可以提高本发明对偏肺病毒的检出率。第三，本发明采用了偏肺病毒的通用探针。通过与所设计的针对F基因保守序列的不同引物相配合，本发明可以同时平行检测出偏肺病毒的两种不同亚型，从而提高了检测的效率。

本发明的主要优点在于：通过结合实时定量PCR的方法，本发明提供了一种检测偏肺病毒的方法，特别是提供了一种高效提取偏肺病毒RNA方法以及检测灵敏度更广的方法，不仅使偏肺病毒的RNA的提取以及偏肺病毒检测效果得到增强，同时也节约了成本。其次，本发明通过利用偏肺病毒F基因的保守序列设计的检测偏肺病毒的引物和探针，可以使得检测的灵敏度以及特异性更好。另外，根据偏肺病毒两种亚型所设计的不同引物，并将其混合再进行实时定量PCR的检测，可以提高偏肺病毒的检出率。最后，本发明的实时定量PCR检测中针对不同的引物只使用了一种通用探针进行偏肺病毒的检测，可以提高了检测效率。

附图说明

图1显示一个阳性样本的扩增曲线，扩增曲线呈S型且能计算出Ct值为32，能够判定为阳性。

图2显示一个阴性对照的扩增曲线，扩增曲线不具有S型且不能计算出Ct值。

图3显示一个阳性对照的扩增曲线，扩增曲线呈S型且能计算出Ct值。

具体实施方式

下面通过结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1研究对象

本研究共使用了535例研究对象，其中分为了1岁以下婴幼儿组(54例)，1岁至15岁儿童组(481)。其中研究对象均为在北医三院就诊的呼吸道感染的病患，包括有在门诊就诊的病患和在住院部的病患。该研究符合病患知情的原则，志愿者已被告知使用他们的咽试子样品和临床数据。

实施例2咽试子获取和样本RNA提取

病患的标本来源于病患的咽试子样本。利用培养管内的消毒长 棉签擦拭病患的两侧腭弓和咽、扁桃体上的分泌物，然后将棉签插入试管中，塞紧保存。样本可以放在-20℃冰箱中进行短期保存。

所有样本中的RNA是利用Trizol法进行提取。首先，加入1ml生理盐水至每个咽试子样本中，然后用手对试管内部的棉签进行搓揉，以使棉签上的咽喉提取物尽量洗入生理盐水中。然后，将试管内的生理盐水倒入至1.5ml离心管中，以4℃，15,000rpm离心5min，去上清。同时，再加入1ml生理盐水至每个咽试子样本中，同样对棉签进行搓揉，再将生理盐水倒入与上次相对应的离心管中。然后再以4℃，15,000rpm离心5min，去上清。接着向每个离心管中加入500ul Trizol试剂(Invitrogen公司)，室温放置5min，然后以4℃，15,000rpm离心15min，再吸上清430μl至另一1.5ml离心管中。向离心管中加入100μl氯仿，剧烈震荡30s，冰上放置3min。然后以4℃，15,000rpm离心15min，再吸上清230μl于另一离心管中。向离心管中加入230ul异丙醇，轻柔摇匀30s，冰上放置5min，以4℃，15,000rpm离心10min，去上清。向离心管中加入500μl 75％乙醇(用DEPC水配制)。将离心管短暂离心后，可放入-70℃冰箱中进行保存，或也可直接将离心管以4℃，8,000rpm离心5min，去上清。待离心管干燥后，向其加入10ul DEPC水将提取的RNA溶解。

实施例3逆转录获得cDNA

cDNA是利用Invitrogen的M-MLV逆转录试剂盒逆转录而来。将10ul的总RNA模板与1ul Oligo(dT)(500μg/ml)和1ul Random  decamers，1μl dNTP(10mM)混合后，65℃加热5min，再立即放入冰上冷却1min。然后加入4μl 5×First-Strand Buffer和2μl DTT(0.1M)，混合后37℃保温2min。接着，加入1μl M-MLV逆转录酶(200unit)，混合均匀后25℃保温10min，然后37℃加热50min，最后70℃失活反应15min。合成后的cDNA保存在-70℃以备用。

实施例4实时定量PCR

利用ABI实时PCR系统(Applied Biosystems)进行PCR的扩增。扩增所用的引物为所设计的组合物。扩增体系为20μl，其中包括5μl cDNA与10μl 2×Universal PCR Master Mix，0.5μl hMPV-For1引物(36μM)，0.5μl hMPV-Rev1引物(36μM)，0.5μl hMPV-For2a引物(36μM)，0.5μl hMPV-For2b引物(36μM)，0.5μl hMPV-Rev2引物(36μM)，2.5μl(1.6μM)hMPV-Uni探针。PCR的反应程序为60℃30s，紧接着95℃10min，随后95℃15s，60℃1min进行45个循环，最后60℃30s。其中阳性对照以所筛选出的偏肺病毒样品作为cDNA，阴性对照以DEPC水代替cDNA。

实施例5数据处理

通过对被检测样品的结果进行对比，本方法可以检测出可能含有偏肺病毒的样品。利用实时荧光PCR的结果，当样品能在循环次数中计算得出Ct值或检测曲线呈S型，则认为该样品含有偏肺病毒，即表明该患者可能为偏肺病毒携带者。

实施例6结果

通过对535例样品进行实时定量PCR检测，本发明共检测出69个阳性样品，检出率为12.9％，与利用传统RT-PCR和实时荧光PCR检测的偏肺病毒发生率在4％-18％之间的事实相符。在所检测获得阳性样本中，除两个未计算出Ct值的样本以外，Ct值的范围为18.36到40.99，表明患者所感染偏肺病毒的病毒数不同，同时Ct值的均值为27.48，标准差为±7.03。在69个阳性样本中，呼吸道感染的有60例，其中明确检测为上呼吸道感染的有42例。其他病例中，肺炎的有3例，支气管炎的有2例，急性扁桃体炎的有1例，急性喉炎的有1例，急性扁桃体炎的有1例。

Claims (10)

1.一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，包括如下步骤：

利用Trizol法提取受试样品的RNA，逆转录样本RNA至cDNA和利用实时定量PCR检测受试样品是否携带偏肺病毒；

其中，相对于对照样品中实时荧光PCR的测定结果，受试样品测定结果如果能计算出Ct值或检测曲线呈S型，即表明受试者携带有偏肺病毒。

2.根据权利要求1所述的一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，所述利用Trizol法提取受试样品的RNA，逆转录样本RNA至cDNA和利用实时定量PCR检测受试样品是否携带偏肺病毒具体步骤包括：利用生理盐水清洗两次咽试子并收集细胞，并利用Trizol试剂裂解细胞；然后按照200ul/1mlTrizol的比例利用氯仿去蛋白，吸出的上清中再等体积加入异丙醇沉淀RNA，最后用75％的乙醇以1ml75％乙醇/1mlTrizol的比例清洗RNA；处理的RNA可保存在75％乙醇溶液中并贮存与‐70℃或直接进行逆转录步骤。

3.根据权利要求1所述的一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，所述逆转录提取的样本RNA至cDNA，是使用了Invitrogen的M‐MLV逆转录试剂盒。

4.根据权利要求1‐3中任一权利要求所述的一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，其中，偏肺病毒融合基因(F)的特异性探针/检测引物作为诊断组合物，用于测定从受试者中所提取的咽试子的逆转录产物。

5.根据权利要求4所述的一种检测受试者是否携带偏肺病毒的 方法，其中所述的诊断组合物用于测定从受试者中所提取的咽试子的逆转录产物，包括通过结合实时定量PCR，判断受试样品中是否含有偏肺病毒；相对于对照样品中的实时定量PCR结果，受试样品中的实时定量PCR的结果如果能计算出Ct值或检测曲线呈S型，即表明受试者携带有偏肺病毒。

6.根据权利要求5所述的一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，所述的对照样品包括有阳性对照样品以及阴性对照样品；阳性对照样品来自于阳性对照组；阴性对照样品来自于阴性对照组。

7.根据权利要求6所述的一种检测受试者是否携带偏肺病毒的方法，阳性对照样品来自于预先诊断为携带偏肺病毒患者咽试子提取物的逆转录cDNA或偏肺病毒阳性患者的咽试子；阴性对照样品来自于未被诊断携带偏肺病毒患者的咽试子或其咽试子提取物的逆转录cDNA，以及DEPC水、生理盐水；

等浓度添加偏肺病毒诊断组合物的引物hMPV‐For1、hMPV‐Rev1、hMPV‐For2a、hMPV‐For2b、hMPV‐Rev2至实时定量PCR的检测体系中；

在20μl检测体系中，每个引物的终浓度为0.9μM；同时，检测所用的通用探针在检测体系中的终浓度为0.2μM；另外，在20μl体系中加入5μl cDNA溶液，余下体积需用ddH₂0补足；

实时荧光PCR检测的程序设置为60℃30s，接着95℃10min，随后95℃15s，60℃1min进行45个循环，最后60℃30s；

从获自受试者的咽试子样品中，利用Trizol法提取RNA，然后 逆转录RNA至cDNA；通过利用偏肺病毒的诊断组合物并结合实时定量PCR的方法对cDNA进行检测，并比对受试样品与对照样品的检测结果。受试样品的检测结果若与阳性样品的检测结果类似，即受试样品测定结果如果能计算出Ct值或检测曲线呈S型，则表明受试者携带有偏肺病毒。

8.一种用于检测偏肺病毒的诊断组合物，其中所述诊断组合物包含有用于检测偏肺病毒融合基因(F)的特异性引物/探针；其中A亚型为一组上、下引物；B亚型为两组引物，包含有两个上游引物hMPV‐For2a、hMPV‐For2b，一个下游引物hMPV‐Rev。

9.根据权利要求8所述的一种用于检测偏肺病毒的诊断组合物，其中所述探针为通用探针，其中所述探针为通用探针，可用于平行检测偏肺病毒的A与B两种亚型；其中使用的通用探针的5’端荧光报告基因可选择FAM、HEX、TET；在进行检测的时候，将A亚型和B亚型的引物按相同的比例混合加入实时荧光PCR的扩增体系中，并同时加入通用探针，即可同时检测出偏肺病毒的两种亚型。

10.根据权利要求9所述的一种用于检测偏肺病毒的诊断组合物，其中：

5’荧光基因为FAM，3’端淬灭基因为MGB。