CN104862288B - 一种新型温度响应性无机焦磷酸酶偶联物的合成及其在增强聚合酶链式反应中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型温度响应性无机焦磷酸酶偶联物的合成及其在增强聚合酶链式反应中的应用，属于聚合物蛋白质偶联技术及其在生物学应用领域，提供一种增强聚合酶链式反应(PCR)效率的策略，利用聚合物‑蛋白质偶联技术，在无机焦磷酸酶(PPase)活性中心附近定位修饰上温度响应性聚合物聚N‑异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，增强蛋白质的热稳定性以适应PCR高温长时间循环的条件，利用自身催化分解焦磷酸的能力，达到增强PCR的效果。
Description
技术领域
本发明属于聚合物蛋白质偶联技术及其在生物学应用领域，具体涉及一种新型温度响应性的无机焦磷酸酶的合成，通过修饰有硫代吡啶基团的温度响应性聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)与定点突变含有巯基的无机焦磷酸酶(PPase)进行定位共价结合，获得偶联物并促进聚合酶链式反应(PCR)的效率增强。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一项在体外模拟DNA复制过程的生物学技术，它在现代分子生物学研究，生物基因工程以及临床医学检测等领域发挥着至关重要的作用。但是研究发现，在该反应的进行过程当中，会产生大量副产物焦磷酸根离子(P2O7 4-，PPi)，PPi的存在会阻碍反应向正方向进行，导致PCR效率的下降，因此清除PPi是提高PCR效率的关键。
通常，包括焦磷酸在内的多磷酸结构的物质水解非常缓慢，运用化学手段清除PPi需要在高浓度的酸性介质中，这显然与弱碱性的PCR反应条件存在很大的差异，而生物体内担负快速有效清除PPi的蛋白质是无机焦磷酸酶(PPase)，其能够将PPi催化分解成磷酸根(PO4 3-，Pi)，因此利用酶催化反应，这一专一而高效的生物学手段，可以有效促进PCR的效率。但PCR通常需要在60oC以上的高温环境下进行1-3h，这就给PPase在PCR中的应用带来了挑战。虽然可以在自然界，通过某些耐高温的嗜热菌中提取出具有耐高温性质的PPase，但是获得，筛选，提取这类嗜热微生物非常困难，对其培养和表达需要特殊环境要求，即便是已经商品化的耐热型酶，例如从嗜热脂肪芽孢杆菌中提取的PPase，其酶活力也远低于通常用大肠杆菌提取的PPase。大肠杆菌作为常用的工程菌，从中提取的PPase酶活力超过800units/mg，显示其高活性的特点，但是其最适反应温度只有45-50oC左右，不仅无法达到PCR反应温度的要求，而且该蛋白质在高温条件下也容易变性失活，这就需要对大肠杆菌的PPase进行改性以提高其最适反应温度以及耐热性，对于促进PCR效率具有很大的潜力。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供一种增强聚合酶链式反应(PCR)效率的策略，利用聚合物-蛋白质偶联技术，在无机焦磷酸酶(PPase)活性中心附近定位修饰上温度响应性聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，增强蛋白质的热稳定性以适应PCR高温长时间循环的条件，利用自身催化分解焦磷酸的能力，达到增强PCR的效果。
为了实现上述目的，本发明的技术方案：一种新型温度响应性无机焦磷酸酶偶联物（PNI-PPase）的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)定点突变构建无机焦磷酸酶突变体：通过将无机焦磷酸酶活性中心附近引入巯基，得到无机焦磷酸酶突变体；
(2)制备温度响应性聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺：控制N-异丙基丙烯酰胺单体与链转移剂的投料比，聚合得到不同分子量的聚N-异丙基丙烯酰胺聚合物；
(3)制备硫代吡啶基团的聚合物：在所述聚合物末端修饰上硫代吡啶基团；
(4)制备聚N-异丙基丙烯酰胺-无机焦磷酸酶偶联物（PNI-PPase）：控制修饰有硫代吡啶基团的聚合物与无机焦磷酸酶突变体的比例，通过硫代吡啶与无机焦磷酸酶突变体活性中心附近的巯基进行反应得到偶联物（PNI-PPase）。
进一步，步骤（1）中的巯基是通过定点突变技术引入的，即将无机焦磷酸酶活性中心附近引入半胱氨酸巯基，从而使得无机焦磷酸酶活性中心附近引入巯基。
进一步，步骤（2）中的聚合反应为可逆加成断裂链转移聚合反应。
进一步，步骤（3）中，修饰上硫代吡啶基团的聚合物是向步骤（2）中的聚N-异丙基丙烯酰胺聚合物内加入乙醇胺和二硫代二吡啶后得到的。
进一步，获得偶联物（PNI-PPase），并测定其在聚合酶链式反应仪循环不同次数下的活性变化，包括以下步骤：
(1)将偶联物（PNI-PPase）放置于聚合酶链式反应仪中循环20-100次；
(2)以焦磷酸钠(Na4P2O7)为底物，测定偶联物在不同循环次下的活性变化情况。
本发明的第二种技术方案为：一种将偶联物（PNI-PPase）应用于聚合酶链式反应的方法，其特征在于：将偶联物（PNI-PPase）加入聚合酶链式反应体系中，以增强促进聚合酶链式反应的效率。
进一步，将偶联物（PNI-PPase）加入到聚合酶链式反应体系中，用于促进聚合酶链式反应的效率，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在聚合酶链式反应体系中加入偶联物（PNI-PPase），在体系中循环若干次；
(2)扩增后的聚合酶链式反应用琼脂糖凝胶电泳进行表征。
本发明的第三种技术方案为：一种偶联物（PNI-PPase）在不同温度下的活性测定以及不同时间下的热稳定性测定，包括以下步骤：
(1)测定偶联物（PNI-PPase）在25-90oC的比活值：选用焦磷酸钠(Na4P2O7)作为底物，测定偶联物（PNI-PPase）一定时间内产生的磷酸根含量，计算出相应温度下的比活值；
(2)测定偶联物（PNI-PPase）在60oC左右温度下的热稳定性情况：在60oC下分别热处理不同时间，测定偶联物（PNI-PPase）的活性变化情况。
进一步，还包括一种筛选后并应用于聚合酶链式反应的方法，包括以下步骤，选取所述测定后热稳定性表现最好的偶联物（PNI-PPase），将其加入聚合酶链式反应体系中，并在所述聚合酶链式反应体系中循环若干次。
一种新型温度响应性无机焦磷酸酶偶联物的合成及其在增强聚合酶链式反应中的应用，包括以下步骤：
(1)调节NIPAM与链转移剂(CTA)的比例制备出不同分子量的聚合物PNIPAM，并修饰上硫代吡啶基团，与PPase活性中心附近的巯基进行共价结合制备出PNI-PPase偶联物。
(2)分别将所得偶联物进行25-90oC的活性测试以及60oC下10-180min的热稳定性测试。
(3)将热稳定性表现最好的偶联物加入到PCR反应体系中，通过20次循环后，研究PCR扩增效率情况。
(4)将热稳定性表现最好的偶联物放置于PCR仪中循环热处理20-100次后，对其活性进行测试。
本发明原理：通过在PPase活性中心定位共价修饰上温度响应性聚合物PNIPAM，通过PNIPAM在高温下对活性中心结构的保护和稳定作用，增强蛋白质在高温下的耐热性，以适应PCR的长时间的高温环境，使其发挥自身能够催化分解PPi的能力，从而达到对PCR的增强效果。
由于上述技术方案的应用，与现有技术相比，本发明具有以下突出特点：
本发明所述技术方案中，采用了酶这一专一高效的催化剂，来分解PPi，传统用高浓度酸性介质分解PPi与PCR碱性条件存在很大差异。
本发明所述技术方案中，采用了聚合物-蛋白质偶联技术，有效提高蛋白质的最适反应温度以及耐热性。与从嗜热微生物提取的耐热性蛋白相比，具有更高的酶活力，且工艺方法简单，工艺过程易于控制。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1中为聚合物PNIPAM的1H NMR谱图及结构式；
图2中为聚合物Pydl-PNIPAM的1H NMR谱图及结构式；
图3中为各偶联物和未修饰的PPase在热处理180 min后的比活值；
图4中为琼脂糖凝胶电泳。
具体实施方式
以下实例提供一种新型温度响应性无机焦磷酸酶偶联物的合成方法，包括突变体表达，聚合物合成和后修饰以及偶联物的制备。同时对偶联物的最适反应温度以及60oC热稳定性进行测试，以及将偶联物加入到PCR体系中考察其增强作用。
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但不限制本发明。
实施例一，结果如图1和2所示。
(1)突变体(K148C)的表达及提取：用定点突变的方法，在蛋白质活性中心附近引入含有巯基的半胱氨酸。
(2)制备聚合物PNIPAM：调节NIPAM与CTA调料比在65oC下反应24 h，之后透析冻干得到不同分子量的聚合物。可逆加成断裂链转移聚合反应(RAFT)
(3)制备带有硫代吡啶的聚合物：加入乙醇胺和二硫代二吡啶，室温反应4 h，透析冻干得到修饰好的聚合物Pydl-PNIPAM。
(4)制备PNI-PPase偶联物：在10mM Tris-HCl的缓冲溶液(pH=8.0)进行结合，PNIPAM/PPase摩尔比为50/1，反应过夜得到偶联物PNI-PPase。
实施例二，结果如图3所示，为对偶联物在不同温度下的活性测试以及60oC下保温不同时间后的活性测试。
(1)偶联物在不同温度下活性的测定：将偶联物在25-90oC下热处理10 min，之后与底物焦磷酸钠(Na4P2O7)在相应温度下结合10 min，测定产物Pi含量，计算比活值(kat/kg)。
(2)偶联物在不同时间下热稳定性的测定：将偶联物在60oC下分别热处理10-180min，之后测定活性，计算比活值以及相对活性(以热处理10 min时的比活值为100%)。
实施例三，结果如图4所示，为偶联物加入到PCR体系中的增强效果以及在PCR仪中热处理不同循环次数后的活性测试。
(1)PCR增强效果测试：在PCR体系中分别加入PPase、PNIPAM、PNI-PPase，以普通的PCR作为对照，测定循环20次后的扩增情况。
(2)偶联物在PCR仪循环不同次数下的活性变化情况：将偶联物放置于PCR仪中循环20-100次后，测定偶联物的活性，计算比活值(kat/kg)，其以焦磷酸钠(Na4P2O7)为底物。
以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定技术性范围。
Claims (5)
1.一种新型温度响应性无机焦磷酸酶偶联物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)定点突变构建无机焦磷酸酶突变体：通过将无机焦磷酸酶第148位赖氨酸引入半胱氨酸巯基，得到无机焦磷酸酶突变体；
(2)制备温度响应性聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺：控制N-异丙基丙烯酰胺单体与链转移剂的投料比，聚合得到不同分子量的聚N-异丙基丙烯酰胺聚合物；
(3)制备硫代吡啶基团的聚合物：向步骤(2)中的聚N-异丙基丙烯酰胺聚合物中加入乙醇胺和二硫代二吡啶，得到末端修饰上硫代吡啶基团的聚合物；
(4)制备聚N-异丙基丙烯酰胺-无机焦磷酸酶偶联物：控制修饰有硫代吡啶基团的聚合物与无机焦磷酸酶突变体的摩尔比为50:1，通过硫代吡啶与无机焦磷酸酶突变体第148位半胱氨酸巯基进行反应得到偶联物PNI-PPase。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：步骤(2)中的聚合反应为可逆加成断裂链转移聚合反应。
3.根据权利要求1所述的合成方法，获得偶联物PNI-PPase，并测定其在聚合酶链式反应仪循环不同次数下的活性变化，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将偶联物PNI-PPase放置于聚合酶链式反应仪中循环20-100次；
(2)以焦磷酸钠Na4P2O7为底物，测定偶联物在不同循环次下的活性变化情况。
4.一种将权利要求1所述偶联物应用于聚合酶链式反应的方法，其特征在于：将偶联物PNI-PPase加入聚合酶链式反应体系中，以增强促进聚合酶链式反应的效率。
5.根据权利要求4所述的方法，将偶联物PNI-PPase加入到聚合酶链式反应体系中，用于促进聚合酶链式反应的效率，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在聚合酶链式反应体系中加入偶联物PNI-PPase，在体系中循环若干次；
(2)扩增后的聚合酶链式反应用琼脂糖凝胶电泳进行表征。
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