CN104232618B

CN104232618B - 检测小分子配体靶蛋白用rca产物及其检测方法

Info

Publication number: CN104232618B
Application number: CN201410460134.1A
Authority: CN
Inventors: 李根喜; 赵婧; 胡随随; 陈稀娴; 王乔
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2014-03-06
Filing date: 2014-09-11
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2034-09-11
Also published as: CN104232618A

Abstract

本发明涉及一种检测小分子配体靶蛋白用RCA产物及其检测方法。该RCA产物以小分子修饰的寡聚核苷酸链作为探针分子，该核酸探针分子的序列为5’‑AAATTGAGCTGCAGAATGGGATCGGTACACTGCG‑NH‑folate‑3’。利用了小分子与靶蛋白的高亲和性高特异性结合产生的末端保护效果，保证了检测的高度特异性，同时借助级联信号放大技术，提高了检测的灵敏性。通过紫外‑可见光谱技术捕捉G‑催化产生的颜色变化，本发明方法简单、快速、无需信号标记；灵敏度高，可以在1 ng/mL到500 ng/mL范围内线性检测叶酸受体蛋白，检测限为0.46ng/mL；特异性强，可以有效地区分靶蛋白与其他对照蛋白。

Description

检测小分子配体靶蛋白用RCA产物及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测小分子配体靶蛋白用RCA产物及其检测方法。

发明背景

蛋白质与小分子配体的相互作用，因其在化学、生物学和临床医学等领域的广泛需要和重要作用，已成为科研工作者共同关注的焦点。研究蛋白质与小分子相互作用不仅有助于揭示小分子物质的作用机理并改善相关蛋白质的检测方法，而且对药物代谢、药物开发以及临床药理研究等具有重要的意义。

近年来，基于末端保护原理以小分子修饰的寡聚核酸作为探针分子研究小分子与蛋白质相互作用的检测分析方法开始引起了广泛的关注。由于小分子与靶蛋白之间的高度亲和性和特异性的相互作用关系，靶蛋白分子可以固定在核酸探针分子的末端造成明显的位阻作用从而阻碍核酸外切酶对核酸探针的消化作用，达到末端保护的效果。同时，寡聚核苷酸不可以结合信号放大技术促进检测灵敏性的提升，实现高灵敏高特异性检测的目的。滚环核酸扩增技术（rolling circle amplification，RCA）是近年来发展迅速且备受瞩目的一种恒温核酸扩增方法，不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以有效实现对靶核酸的信号放大；DNAzyme是具有催化活性的寡聚核酸分子，通过酶催化产生的信号放大效果，同样可以达到提升生物分析灵敏性的目的。因此，利用RCA合成具有一系列DNAzyme序列的长链核酸，并催化底物产生信号，可以产生级联信号放大的效果，有效保障了高度灵敏检测分析的需要。本发明巧妙地将末端保护原理和级联信号放大技术相结合，利用紫外-可见分光光技术作为检测手段，实现了对小分子与蛋白质相互作用高灵敏高特异性分析检测的目的。

目前，研究小分子与蛋白质相互作用的检测技术主要有质谱、亲和层析、动力学毛细管电泳、荧光共振能量转移和酶互补片段免疫分析等。但是这些检测技术有的需要昂贵的仪器，操作复杂，有的耗时费力，灵敏度低，均难以满足日常快速分析的要求。紫外-可见分光光谱法由于其测量范围广、应用领域宽、操作简便快速且仪器成本相对较低的优势，成为了蛋白质与小分子相互作用研究中具有重要地位的分析技术之一。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术中存在的问题，提供一种检测小分子配体靶蛋白用RCA产物。

本发明的目的之二在于提供用该RCA产物的检测小分子配体靶蛋白的方法。

本发明第一次用紫外-可见光谱技术实现对蛋白质与小分子配体相互作用的特异性和灵敏性的检测。为实现以上目的，本发明所采用的机理如下：选用叶酸作为代表性的小分子，以叶酸修饰的寡核酸链作为检测的探针链。Exo I ( Exonuclease I)是一种沿3’到5’方向定向水解单链DNA的酶，修饰了小分子的单链DNA可以被Exo I从3’末端逐步水解。当靶蛋白叶酸受体存在的条件下，叶酸受体蛋白与核酸探针末端的叶酸小分子结合产生明显的位阻效应，从而产生末端保护效果，阻碍了Exo I从3’末端对核酸探针的水解消化。在切刻内切酶存在的条件下，核酸探针分子末端结合的叶酸受体随着多余核酸序列的切除，末端保护作用消除。去保护的核酸探针链中含有两段序列分别与成环核酸链的3’ 和5’末端序列互补，因此，以探针链作为杂交模板通过DNA连接酶将成环核酸链的3’ 和5’末端连接起来形成了环状DNA。在DNA聚合酶催化作用下，以探针DNA作为引物，以环状DNA作为模板发生滚环核酸扩增反应，产生一条具有一系列重复的特定DNAzyme序列的长链DNA产物。在血红素（hemin）存在的条件下，RCA产物中的DNAzyme序列均会和hemin结合形成hemin/G-四聚体复合物，该复合物具有类似过氧化氢酶的作用，可以在过氧化氢存在的条件下，催化ABTS^2-氧化为ABTS^.-。紫外-可见光谱技术对催化过程中产生的颜色变化进行监测，就可以实现对小分子配体和蛋白质相互作用的检测。与之相对应的，当体系中不存在靶蛋白的时候，缺乏保护的核酸探针被Exo I水解为单核苷酸片段，所以随后的级联信号放大反应由于缺少环状链合成的模板以及引物被终止，无法产生比色法检测的信号。因此，在这个检测体系中，结合配体与受体的特异性以及DNA滚环扩增和DNAzyme催化结合的级联信号放大的高灵敏度的特点，高灵敏高特异性分析小分子与蛋白质相互作用成为可能。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种检测小分子配体靶蛋白用RCA产物，其特征在于RCA产物采用如下方法制备得到：

a.将小分子配体标记的探针probe与待测样品混合于1×NEBuffer2反应缓冲液中，室温下培育0.5～1.5小时；其中小分子配体标记的探针probe的浓度为10 µM，待测样品的浓度为：1 ng/mL～500 ng/mL；所述的探针probe的序列为：

5’-AAATTGAGCTGCAGAATGGGATCGGTACACTGCG-NH-folate-3’；

所述的反应缓冲液为10 mM Tris-HCl，50 mM NaCl， 10 mM MgCl₂；

b. 在步骤a所配制的溶液中加入Exo I原液至浓度为15U/mL，37°C条件下培育0.5h后，升温至80°C反应20 min以终止酶切反应，冷却到室温；

c. 在步骤b所得溶液中，加入切克链和切刻内切酶 NB. BtsI至浓度分别为10 µM和5 U/mL，所述的切克链的序列为：5’-CGCAGTGTACCGA-3’，在37°C条件下培育0.5 h后升温至80°C热失活20 min以终止切刻内切酶的反应，自然冷却到室温；

d. 在步骤c所得溶液加入滚环链至浓度为10 µM，加入T4 DNA ligase至浓度为100 U/mL和ATP 至浓度为mM；所述的滚环链的序列为：

5’-P-TCTGCAGCTCAATTCCCCACCCTCCCCACCCTCATTTTTTCCCCACCCTCCCCACCCTCATACCGATCCCAT-3’；16°C孵育0.5 h，升温至65°C热失活20 min，使连接酶失活；

e. 在步骤d所得溶液中加入dNTPs 至浓度为400µM，加入BSA至浓度为500µg/ mL和phi29DNA聚合酶至浓度为8U/mL，在37°C下聚合反应0.5h，然后将反应后的溶液升温至80°C热失活20 min，终止反应得到检测小分子配体靶蛋白用RCA产物。

上述的小分子为叶酸。

一种检测小分子配体靶蛋白的方法，采用上述的检测小分子配体靶蛋白用RCA产物进行检测，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 将RCA扩增产物与2×40 KT 缓冲液按1:1~1:1.5的体积比混合成混合液，再加入hemin至浓度为5 μM，在室温下孵育1 h；所述的缓冲液为：100 mM MES，200 mM Tris，80 mM KCl ，0.1% Triton X-100 ，2% DMSO，pH 6.2；

b. 在步骤a所得混合液中加入50 mM ABTS²⁻水溶液和1 mM H₂O₂ 水溶液，并立即对混合液在414nm波长处，进行总时间为300s的紫外动力学检测；所述的混合液、ABTS²⁻水溶液和H₂O₂ 水溶液的体积比为：48:1:1~45:2:2。

本发明利用小分子和蛋白质高特异高亲和性结合产生的末端保护效果，借助结合滚环扩增以及DNAzyme催化产生的级联信号放大技术的高度灵敏性，实现了对小分子和蛋白质相互作用非常灵敏的检测。本发明以叶酸作为代表研究了其与叶酸受体蛋白之间的相互作用，理论上可以推广对其他类型的小分子与靶蛋白相互作用进行检测。由于叶酸受体蛋白本身是一种肿瘤标志物，该方法还可以用于肿瘤标志物的检测，对肿瘤的临床监测提供技术支持，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明的方法原理图。

图2为在有无叶酸受体蛋白存在的情况下，修饰有叶酸分子的核苷酸链经核酸外切酶I切割以及RCA反应之后，在414nm波长处产生的吸光值随时间变化图。内嵌图为有无叶酸受体蛋白存在条件下经核酸外切酶I和RCA反应后的琼脂糖电泳图。

图3为不同浓度的叶酸受体蛋白存在情况下，修饰有叶酸分子的核苷酸链经核酸外切酶I切割以及RCA反应之后，催化ABTS^2-氧化在414nm波长处产生的吸光值随时间变化图。

图4为叶酸受体蛋白浓度和吸光度变化值（ΔA）之间的关系图。其中内嵌图为蛋白质浓度在1 ng/mL到100 ng/mL范围内与吸光度变化值之间的线性关系图。

图5为不同种类的蛋白与叶酸修饰探针结合条件下获得的在414nm波长处吸光值随时间变化图。

具体实施方式

实施例一：叶酸-叶酸受体相互作用检测的级联信号放大反应流程

步骤一，在1×NEBuffer2反应缓冲液中（10mM Tris-HCl，50mM NaCl， 10 mMMgCl₂）加入100 nM叶酸标记的探针probe与500 ng/mL、300 ng/mL、100 ng/mL、80 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL、0.46ng/mL和0 ng/mL的待测叶酸结合蛋白样品，室温下培育1h ；

步骤二，然后在上一步的溶液中加入0.3 U/µL Exo I原液，37°C下培育0.5 h后，升温至80°C热失活20 min以终止酶切反应；

步骤三，等溶液冷却到室温后再加入100 nM N-DNA链，0.02 U/µL NB. BtsI， 37°C下培育0.5 h，将反应后的溶液升温至80°C热失活20 min以终止切刻酶的反应；

步骤四，等溶液冷却到室温后再加入100 nM的Cir-DNA链，2 U/µL T4 DNA ligase和1 mM ATP，16°C孵育30 min，升温至65°C热失活20 min，使连接酶失活；

步骤五，在上述溶液中加入400µM dNTPs，500µg/ mL BSA和0.2 U/µL phi29DNA聚合酶使体系的终体积为50ul。反应体系在37°C下聚合反应0.5h，然后将反应后的溶液升温至80°C热失活20 min，终止反应，得到RCA的产物。

如图1所示当目标蛋白不存在时，叶酸标记的核酸探针链被Exo I水解成单核苷酸，滚环扩增在无模板存在下无法发生，因而无法合成能够形成G-四链体的长链并实现比色法的检测。当叶酸结合蛋白存在时，叶酸标记的探针链与叶酸受体高度亲和性特异性结合，从而保护探针链不被Exo I水解。通过切刻内切酶切割去保护之后，成环链以去保护的探针链作为杂交模板连接成环，并以其为引物，在加入dNTPs和phi29 DNA聚合酶的条件下，引发RCA反应，生成大量与环形DNA模板互补的重复的DNAzyme 碱基序列。

实施例二：紫外-可见吸收光谱分析叶酸-叶酸受体相互作用

步骤一，将扩增产物与2×40 KT 缓冲液（100mM MES ，200mM Tris，80mM KCl ，0.1% Triton X-100 ，2% DMSO，pH 6.2 ）按1:1比例混合，在该体系中加入100 nM hemin溶液，在室温下孵育1 h；

步骤二，在上述反应液中加入0.5 mM ABTS²⁻溶液和1mM H₂O₂ 溶液，并立即对混合液在414nm波长处，300s内进行紫外动力学检测。

根据图1所示，我们的设计延伸出来的长链含有G-四链体结构的DNAzyme，在钾离子和hemin存在的条件下自发形成多个G-四链体-hemin复合物。该复合物具有类似过氧化氢酶的活性，可以在过氧化氢存在条件下，催化ABTS^2-氧化，产生颜色变化。如图2所示，当有500 ng/mL叶酸受体蛋白存在时，由于核酸探针末端因为结合被保护不被Eox I消化，经RCA反应产生重复的DNAzyme，可以催化ABTS^2-氧化产生颜色变化，因此吸光值随着时间变化有明显的上升趋势，这与未经Eox I处理的核酸探针扩增后的结果相类似，很好证明了叶酸-叶酸受体相互作用对核酸探针链的末端保护作用。与之相对应的，在没有叶酸受体蛋白存在时，由于核酸探针链被Exo I水解无法发生后续的级联反应，吸光值并没有随着时间推移产生明显变化。

实施例三：琼脂糖凝胶电泳分析叶酸-叶酸受体相互作用

步骤一，用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子；

步骤二，取1×TAE 电泳缓冲液100mL 于三角烧瓶中，称取1 g 琼脂糖粉放入后在微波炉内加热熔化。冷却至约60℃，倒入电泳槽中。待琼脂糖凝胶凝固后向电泳槽中倒入1×TAE 溶液，其量以没过胶面2 mm 为宜，小心移去梳子；

步骤三，在实例1步骤五得到的RCA的样品溶液中加入0.2 体积的上样缓冲液，混匀后加入样品孔内。接上电极，以 5 V/cm 的电压进行电泳。当指示染料迁移至所需位置时，切断电源，取出凝胶；

步骤四，在 SYBR Green I核酸染料中染色30 min，最后用Biorad GelDoc XR 凝胶成像系统拍照记录。

如图2的内前图所示，存在500 ng/mL叶酸受体蛋白以及核酸探针未被Eox I处理的条件下，均可以得到明显的扩增条带，而无叶酸受体蛋白存在条件下，经过Eox I处理处理后几乎不能看见扩增条带。该结果很好验证了末端保护效果以及RCA的核酸扩增效果，并再次验证了此发明的实施机理。

实施例四：不同浓度叶酸受体蛋白的检测

将叶酸修饰的核酸探针与不同浓度的叶酸受体蛋白 (500 ng/mL、300 ng/mL、100ng/mL、80 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL以及1 ng/mL)反应，经过Exo I处理以及级联信号放大反应，用紫外-可见分光光谱法检测。

如图3所示，反应产物溶液在414 nm波长处的吸光值随时间的推移不断增加，同时随叶酸受体蛋白的浓度升高而增加幅度提升。图4为300s时获得的吸光度增加值与叶酸受体蛋白浓度之间的关系图。图4插图表示在1 ng/mL到100 ng/mL 的叶酸受体蛋白浓度范围内，吸光度增加值与蛋白浓度成线性关系。根据3倍信噪比可得该方法的叶酸受体蛋白的检测限为0.46ng/mL。

实施例五：生物传感器特异性研究

为了验证本发明检测叶酸结合蛋白的特异性，我们用了不同的蛋白如牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）按照实施例一的操作过程处理来验证该生物传感器的特异性。如图5所示，即使BSA和OVA蛋白的浓度（1 mg/mL）是目标蛋白浓度的（500 ng/mL）的2000倍，仍然不能引起溶液吸光值明显的变化。此对照反应说明了叶酸与叶酸受体蛋白结合引起的末端保护作用有高度的特异性，保证了生物传感器检测的高度选择性。

以上实验结果表明，本发明方法能检测到浓度低至0.46ng/mL的叶酸结合蛋白，实现了叶酸受体蛋白的灵敏检测，并可有效地区分其他蛋白分子。这种简单、便捷、灵敏和高选择性的检测手段，为今后的小分子-蛋白质相互作用以及肿瘤标志物的检测提供了一个新的思路，也有望在将来应用到临床检测中以满足不同的检测需求。

Claims

1.一种检测小分子配体靶蛋白的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将RCA扩增产物与2×40KT缓冲液按1:1～1:1.5的体积比混合成混合液，再加入hemin至浓度为5μM，在室温下孵育1h；所述的缓冲液为：100mM MES，200mM Tris，80mM KCl，0.1％Triton X-100，2％DMSO，pH 6.2；

b.在步骤a所得混合液中加入50mM ABTS^2-水溶液和1mM H₂O₂水溶液，并立即对混合液在414nm波长处，进行总时间为300s的紫外动力学检测；所述的混合液、ABTS^2-水溶液和H₂O₂水溶液的体积比为：48:1:1～45:2:2；所述的RCA产物采用如下方法制备得到：

b-1.将小分子配体标记的探针probe与待测样品混合于1×NEBuffer2反应缓冲液中，室温下培育0.5～1.5小时；其中小分子配体标记的探针probe的浓度为10μM，待测样品的浓度为：1ng/mL～500ng/mL；所述的探针probe的序列为：

5’-AAATTGAGCTGCAGAATGGGATCGGTACACTGCG-NH-folate-3’；

所述的反应缓冲液为10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl₂；

b-2.在步骤b-1所配制的溶液中加入Exo I原液至浓度为15U/mL，37℃条件下培育0.5h后，升温至80℃反应20min以终止酶切反应，冷却到室温；

b-3.在步骤b-2所得溶液中，加入切克链和切刻内切酶NB.BtsI至浓度分别为10μM和5U/mL，所述的切克链的序列为：5’-CGCAGTGTACCGA-3’，在37℃条件下培育0.5h后升温至80℃热失活20min以终止切刻内切酶的反应，自然冷却到室温；

b-4.在步骤b-3所得溶液加入滚环链至浓度为10μM，加入T4DNA ligase至浓度为100U/mL和ATP至浓度为mM；所述的滚环链的序列为：

5’-P-TCTGCAGCTCAATTCCCCACCCTCCCCACCCTCATTTTTTCCCCACCCTCCCCACCCTCATACCGATCCCAT-3’；16℃孵育0.5h，升温至65℃热失活20min，使连接酶失活；

b-5.在步骤b-4所得溶液中加入dNTPs至浓度为400μM，加入BSA至浓度为500μg/mL和phi29DNA聚合酶至浓度为8U/mL，在37℃下聚合反应0.5h，然后将反应后的溶液升温至80℃热失活20min，终止反应得到检测小分子配体靶蛋白用RCA产物；所述的小分子为叶酸。