CN104849391A - 一种提取样品中奎尼酸的方法、试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析技术领域，涉及提取样品中奎尼酸的方法，包括用乙酸铵水溶液浸润样品的步骤。还涉及提取样品中奎尼酸的试剂盒，包括乙酸铵水溶液和水相滤膜。所述试剂盒用于提取烟草或烟草制品中的奎尼酸，或者用于烟草或烟草制品的质量控制。

Description

一种提取样品中奎尼酸的方法、试剂盒及其用途

技术领域

本发明属于分析技术领域，涉及一种提取样品中奎尼酸的方法、试剂盒及其用途。

背景技术

奎尼酸(quinic acid，QA)是植物进行有氧呼吸过程中，经莽草酸途径形成的一种环状、多羟基及有光学活性的天然酚酸类化合物，又名1,3,4,5-四羟基环己烷-1-羧酸。奎尼酸的分子式为C₆H₇(OH)₄COOH，结构式如式Ⅰ所示。

奎尼酸广泛存在于各类植物中，例如烟草、金鸡纳树皮、胡萝卜叶、苹果、梨和咖啡等，而且，少数真菌和细菌中也存在奎尼酸。奎尼酸及其衍生物常被作为食品抗氧化剂使用；奎尼酸的咖啡酰类衍生物在抗病毒、治疗心血管疾病等方面得到较多关注和应用。因此，奎尼酸是提取价值极高的精细化工产品和医药中间体。

此外，奎尼酸在烟草中的含量较高，在0.05％-1％之间。奎尼酸对人体具有刺激性，且是有害成分酚类化合物的前体物，因此奎尼酸会对烟草感官品质产生不良影响，且会损害吸烟者的健康，亟需控制奎尼酸在烟草中的含量。

通常采用液相色谱法分析奎尼酸的含量，该法采用二极管阵列检测器。但该方法的检测时间较长，不利于快速检测。

目前尚无快速提取样品尤其是烟草及烟草制品中奎尼酸的方法。

发明内容

本发明人得到了一种快速提取样品中奎尼酸的方法，尤其适用于对烟草制品进行提取。该方法快速简单、选择性好、重现性好。发明人惊奇地发现以乙酸铵水溶液提取样品中的奎尼酸，前处理步骤简单、快速。此外，发明人还采用液相色谱-质谱联用法对奎尼酸进行快速分析检测，灵敏度高。

本发明第一方面涉及一种提取样品中奎尼酸的方法，包括如下步骤：用乙酸铵水溶液浸润样品，得到提取液。

所述浸润指乙酸铵水溶液与样品发生接触时，液体附着在样品表面或渗透到样品内部的现象。具体地，浸润时，乙酸铵水溶液液面至少为样品高度的1/3或至少为样品高度的1/2，优选，乙酸铵水溶液完全浸没样品。

本发明第一方面任一项的方法中，所述样品为烟草或烟草制品。

发明人发现，提取溶剂的选择对奎尼酸分析有显著影响，乙酸铵水溶液能将样品中的奎尼酸快速提取出来，提取率高且方法简单。而采用其他的磷酸钠缓冲溶液(NaH₂PO₄-Na₂HPO₄)、磷酸钾缓冲溶液(K₂HPO₄-KH₂PO₄)等无法对样品中的奎尼酸进行有效的提取。

本发明第一方面任一项的方法中，所述乙酸铵水溶液的浓度为0.09-0.15mol/L，具体为0.1-0.15mol/L或0.12-0.15mol/L，优选为0.1mol/L。

乙酸铵水溶液的浓度为0.09-0.15mol/L，可基本完全提取出样品中的奎尼酸。

本发明第一方面任一项的方法中，向每克样品中添加乙酸铵水溶液的量为250-1000mL，具体为250-500mL，更具体为250mL、300mL、500mL、750mL或1000mL，优选为500mL。

发明人发现，乙酸铵水溶液添加量过大时，信号微弱，容易受基线噪音的影响；添加量过小时，对于奎尼酸含量高的样品，容易出现信号值过饱和、测定不准确的问题。将乙酸铵水溶液添加量控制在250-1000mL/g，尤其是500mL/g，可以保有正常信号值，使测量准确，同时合适的乙酸铵水溶液添加量能够使奎尼酸被均匀提取出来。

本发明第一方面任一项的方法中，所述浸润在超声下进行；具体地，超声功率为最大功率的40％；更具体地，浸润时间≥10min，进一步具体地，浸润时间≥30min、≥40min或≥50min，优选为30min。

本发明第一方面任一项的方法中，浸润温度为30-60℃，具体为30℃、40℃、50℃或60℃，优选40℃。

本发明第一方面任一项的方法中，还包括将提取液进行过滤的步骤；具体地，以水相滤膜过滤提取液；更具体地，所述水相滤膜的孔径为0.22μm。

本发明第一方面任一项的方法中，还包括采用液相色谱-质谱分析提取液的步骤。

根据本发明任一的方法，液相色谱条件为如下(1)-(6)中的任意一项或者多项：

(1)色谱柱为菲罗门C₁₈液相色谱柱；

(2)进样量为5μL；

(3)流动相为0.1％醋酸水溶液；

(4)流速为0.8mL/min；

(5)柱温为40℃；

(6)采用等度洗脱程序，洗脱时间5min。

发明人发现采用菲罗门C₁₈液相色谱柱分析提取液，得到的色谱峰型较好、响应值较高；色谱峰响应值随着进样量增加而增加，但发明人发现进样量过高时，奎尼酸色谱峰出现裂缝，影响了检测的准确性；以0.1％醋酸水溶液作流动相，色谱峰值较好、响应值较高。

根据本发明任一的方法，质谱条件为如下(1)-(7)中的任意一项或者多项：

(1)扫描方式为负离子扫描；

(2)定量离子对191/93，定性离子对191/85；

(3)碰撞能为-20V；

(4)离子源为电喷雾电离源；

(5)检测方式为多反应检测；

(6)电喷雾电压为-4500V；

(7)离子源温度为550℃。

以负离子方式扫描，碰撞能为-20V，选择定量离子对191/93，定性离子对191/85进行检测，准确度高、灵敏度高、回收率高、重复性好。选择其他碰撞能和定量离子对检测时准确度较低。

本发明第二方面涉及一种提取样品中奎尼酸的试剂盒，包括乙酸铵水溶液和水相滤膜。

本发明第二方面任一项的试剂盒，包括如下(1)-(5)中的任意一项或者多项：

(1)乙酸铵水溶液的浓度为0.09-0.15mol/L，具体为0.1-0.15mol/L或0.12-0.15mol/L，优选为0.1mol/L；

(2)乙酸铵水溶液的量至少为250mL，具体为250-1000mL，更具体为250-500mL，优选为500mL；

(3)所述水相滤膜的孔径为0.22μm；

(4)所述试剂盒为定量分析试剂盒；

(5)所述样品为烟草或烟草制品。

本发明第三方面涉及所述试剂盒在提取样品中奎尼酸，或者在控制样品质量中的用途；具体地，所述样品为烟草或烟草制品。

发明的有益效果

(1)本发明以乙酸铵水溶液浸润样品，即能从样品特别是烟草或烟草制品中提取奎尼酸，方法简单，无需使用有毒性的有机溶剂。

(2)本发明采用液相色谱-质谱联用法分析样品中的奎尼酸，快速准确、灵敏度高、操作简单。

(3)使用本发明方法分析样品中奎尼酸的回收率高、重复性好。在烟草或烟草制品的样品分析中几乎不存在杂峰，目标物线性相关性较好，将标准溶液稀释一定倍数，以信噪比S/N＝3计算出奎尼酸的检出限为0.11mg/g，以信噪比S/N＝10计算出奎尼酸的定量限为0.35mg/g，平均回收率为93.8％～94.8％，相对标准偏差RSD<5％(n＝6)。

附图说明

图1：本发明实施例1中分析方法的流程图。

图2：本发明实施例1中标准溶液的色谱图。

图3：本发明实施例1中提取液的色谱图。

图4：本发明实施例1中奎尼酸的质谱图。

图5：本发明实施例1中奎尼酸的标准曲线图。

图6：本发明实施例2中不同提取溶剂与色谱峰面积的关系图。

图7：本发明实施例3中添加量为25mL乙酸铵水溶液时的色谱图；

图8：本发明实施例3中添加量为100mL乙酸铵水溶液时的色谱图；

图9：本发明实施例4中不同提取时间与测得的奎尼酸含量的关系图。

图10：本发明实施例7中纯水作流动相的色谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：对烟草制品中奎尼酸含量的分析

分析方法如图1所示：

(1)配制标准溶液：称取0.1g奎尼酸，精确至0.0001g，用0.1mol/L乙酸铵水溶液溶解后转移至100mL棕色容量瓶中定容，配制成1mg/mL标准储备液；分别移取0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL和5mL的标准储备液至100mL容量瓶中，用0.1mol/L乙酸铵水溶液定容，得到奎尼酸浓度分别为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL和50μg/mL的标准溶液，避光4℃保存，取用时提前放置于常温下，达到常温后方可使用。每周做一次标线。

(2)制备样品的提取液：称取0.1g左右烟丝，置于150mL磨口三角瓶中，准确加入50mL、0.1mol/L的乙酸铵水溶液，超声提取30min，超声功率为40％，经0.22μm水相滤膜过滤后得到提取液。

(3)采用LC-MS/MS方法分别对提取液、标准溶液进行分析。

色谱分析条件：采用菲罗门C₁₈液相色谱柱，柱温为40℃；进样量5μL；流动相为0.1％醋酸水溶液，流速为0.8ml/min；采用等度洗脱程序，洗脱时间总共5min。

标准溶液的色谱分析结果如图2所示，提取液的色谱分析结果如图3所示。

质谱分析条件：离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：-4500V；离子源温度：550℃；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：50psi；去簇电压(DP)：-40V；碰撞能(CE)：-20V；离子对选择：定量离子对191/93，定性离子对191/85。提取液的质谱图如图4所示。

(4)计算结果：

以标准溶液中奎尼酸的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线如图5所示，具体数据见表1。

表1

将提取液色谱图中奎尼酸的色谱峰面积，代入以上标准曲线，得到提取液中的奎尼酸含量，按照下式计算出烟丝中的奎尼酸含量。

m＝1000×(A×S)/n

式中：

m—烟丝中的奎尼酸含量(mg/g)；

A—提取液中的奎尼酸含量(μg/mL)；

S—提取液体积(mL)；

n—称取烟丝的质量(g)。

本实施例烟丝的奎尼酸含量为5.2mg/g。

由表1和图4可知，所采用的色谱条件在烟草制品实际样品分析中几乎不存在杂峰，目标物具有较好的线性相关性，将混合标准溶液稀释一定倍数，以信噪比S/N＝3计算出奎尼酸的检出限为0.11mg/g。

实施例2：不同提取溶剂及不同浓度的比较

本实施例分别用纯水、磷酸钠缓冲溶液(NaH₂PO₄-Na₂HPO₄)、磷酸钾缓冲溶液(K₂HPO₄-KH₂PO₄)以及0.03mol/L、0.09mol/L、0.12mol/L、0.15mol/L的乙酸铵水溶液对烟草制品进行提取，其他条件参考实施例1。

磷酸钠缓冲溶液、磷酸钾缓冲溶液作为提取溶剂提取烟草制品没有检测到色谱峰。其他提取溶剂色谱分析的峰面积如图6所示。

由图6可知，与乙酸铵水溶液相比，纯水提取烟草制品的奎尼酸提取率低。当乙酸铵水溶液浓度≥0.1mol/L时，奎尼酸的提取率基本达到稳定，说明0.1mol/L乙酸铵水溶液可基本将烟草制品的奎尼酸完全提取。

实施例3：乙酸铵水溶液不同添加量的比较

本实施例分别向烟草制品中加入25ml、50ml、75ml和100ml的0.1mol/L乙酸铵水溶液，其他参考实施例1，结果见表2。

表2

由表2可知，对于不同的乙酸铵水溶液添加量，结果无明显差异。如图7-8所示，当添加量较大时，如图8的100mL添加量，信号值较小，易受基线噪音影响，而添加量较小时，如图7的25mL添加量，易出现信号值过饱和，影响测定结果。为了兼顾提取的完全性和检测的准确性，同时保证取样的均匀性和减少试剂用量，实验选择添加量为50mL。

实施例4：不同提取时间的比较

本实施例分别以10min、20min、30min、40min和50min作为提取时间，各自测得的奎尼酸含量如图9所示。当超声时间≥30min，测得的奎尼酸含量基本稳定，奎尼酸的提取率最高。为避免过长时间超声导致样品的温度显著升高，同时为了使不同样品中的奎尼酸都能被完全提取出来，提取时间采用30min。

实施例5：不同质谱条件的比较

本实施例将质谱碰撞能(CE)设定为-15V，定量离子对为191/127，其他参考实施例1。得到的提取液色谱峰面积仅为实施例1提取液色谱峰面积的81％。

实施例6：不同色谱柱的比较

本实施例分别用Agilent公司生产的色谱柱ZORBAX EclipseC18(100mm×2.1mm，1.8μm)、ZORBAX Eclipse XDB-C8(150mm×4.6mm，5m)、ZORBAX SB-C3(150mm×2.1mm，5μm)、ZORBAXSB-C3(100mm×3.0mm，1.8μm)、ZORBAX XDB-Phenyl(150mm×4.6mm，3.5μm)、ZORBAX 300-SCX(150mm×2.1mm，5μm)、热电公司生产的的色谱柱APS-2Hypersil(100mm×2.1mm，5μm)和菲罗门Luna 5u C18色谱柱(150.0mm×3.9mm,5μm)进行分析测定，其他参考实施例1，结果表明，菲罗门Luna 5u C18色谱柱(150.0mm×3.9mm,5μm)的色谱峰型最好，响应值最高。

实施例7：不同流动相的比较

本实施例以纯水作为流动相进行分析，其他参考实施例1，得到色谱图如图10所示。

将图10与图2-3比较可知，以纯水作流动相时，奎尼酸的峰强度较低，而采用0.1％醋酸作为流动相时，色谱峰型较好，响应值较高。

实施例8：不同进样量的比较

本实施例分别以1μL、2μL、5μL和10μL进样，其他参考实施例1。

结果表明，色谱峰响应值会随着进样量的增加而增加，当达到10μL的进样量时，奎尼酸色谱峰出现裂峰。因此选择5μL进样。

实施例9：重复性和加标回收率的考察

分别向样品中加入1mg/g、5mg/g和10mg/g三种不同浓度的标准溶液，进行加标回收率试验，每个样品分别测定6次，分析方法参考实施例1。根据分析结果计算烟草制品中奎尼酸的加标回收率，结果如表3所示。

表3烟草制品中奎尼酸的回收率和重复性(n＝6)

由表3可以看出，在3个加标水平上，利用此方法分析检测烟草制品中奎尼酸的回收率在93.8％-94.8％之间，样品测试结果的相对标准偏差小于5％，说明本法的回收率较高，重复性较好。

实施例10：不同烟草制品奎尼酸含量的测定

采用实施例1的分析方法测定不同产地、不同类型烟叶中的奎尼酸含量，结果见表4。

表4不同产地、不同类型烟叶的奎尼酸含量

样品	奎尼酸含量(mg/g)
		国内烤烟1	5.20
国内烤烟2	6.68
		国内烤烟3	1.08
国内烤烟4	1.07
		国内烤烟5	3.79
国内烤烟6	1.87
		国外烟叶1	8.31
国外烟叶2	4.97
		国外烟叶3	3.68
白肋烟1	0.74
		白肋烟2	1.05
白肋烟3	1.32
		香料烟1	4.77
香料烟2	5.31

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种提取样品中奎尼酸的方法，包括如下步骤：

用乙酸铵水溶液浸润样品，得到提取液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品为烟草或烟草制品。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述乙酸铵水溶液浓度为0.09-0.15mol/L，具体为0.1-0.15mol/L或0.12-0.15mol/L，优选为0.1mol/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，向每克样品中添加乙酸铵水溶液的量为250-1000mL，具体为250-500mL，优选为500mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，浸润时间≥10min，具体地，浸润时间≥30min，优选为30min。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述浸润在超声下进行；更具体地，浸润温度为30-60℃，优选为40℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括将提取液进行过滤的步骤；具体地，以水相滤膜过滤提取液；更具体地，所述水相滤膜的孔径为0.22μm。

8.一种提取样品中奎尼酸的试剂盒，包括乙酸铵水溶液和水相滤膜。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于如下(1)-(5)中的任意一项或者多项：

(1)乙酸铵水溶液的浓度为0.09-0.15mol/L，具体为0.1-0.15mol/L或0.12-0.15mol/L，优选为0.1mol/L；

(2)乙酸铵水溶液的量至少为250mL，具体为250-1000mL，更具体为250-500mL，优选为500mL；

(3)所述水相滤膜的孔径为0.22μm；

(4)所述试剂盒为定量分析试剂盒；

(5)所述样品为烟草或烟草制品。

10.权利要求8或9所述试剂盒在提取样品中的奎尼酸，或者在控制样品质量中的用途；具体地，所述样品为烟草或烟草制品。