CN104844806A - 一种用于核素标记的靶向化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于核素标记的靶向化合物及其制备方法和用途，该配合物的结构通式如下：或其中R₁为核素螯合基团，R₂为靶向基团，D_n是以炔丙胺为初始反应物、通过反复的迈克尔加成反应和酰胺化反应形成的分子骨架，其外围基团为氨基，n代表不同代数且其数值为大于等于0的整数，m＝2ⁿ。本发明的用于核素标记的靶向化合物的靶向基团与核素形成的单体及多聚体对肿瘤组织具有高靶向性和亲和力，通过仪器扫描能够得到高质量的显像结果，起到有效监测肿瘤或炎症疾病的作用。

Description

一种用于核素标记的靶向化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医学影像技术领域，具体涉及一种用于核素标记的靶向化合物及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤已经成为威胁着人类健康和生命的严重疾病，早发现、早诊断及早治疗是治疗与控制肿瘤的有效措施，但需要辅助一定的诊断手段。其中之一就包括分子影像诊断。分子影像学被誉为21世纪的医学影像学，是最具发展潜力的医学科学前沿领域之一。然其优越性的体现需要靶向性好、特异性强的显像靶向化合物，才能更好地诊断和治疗疾病。核医学技术是一种非侵入技术，合成特异性强的肿瘤显像剂，对恶性肿瘤的临床诊断将起到重要作用。

以小分子物质叶酸为例，在近年来的科学研究中，基于叶酸受体的靶向技术发展迅速。它利用叶酸受体(FR)在某些肿瘤部位的过度表达而在正常组织低水平表达的特性，以实现叶酸偶联物的靶向输送。FR在生长旺盛的组织，特别是多种上皮系肿瘤如卵巢癌、肾癌、子宫癌、睾癌、脑瘤、结肠癌、肺腺癌中高水平表达。研究表明，以叶酸受体作为肿瘤检测和治疗的靶点具有多方面的优点，增强了抗肿瘤的疗效，对正常组织的损害相对减少，此外还有助于克服肿瘤细胞的耐药性，且叶酸具有无毒、免疫原性弱、稳定，可修饰性强等特点。在过去很长的一段时间里，一系列用于PET及SPECT显像的叶酸靶向分子探针应运而生。然而，只有¹¹¹In-DTPA-folate和^99mTc-EC20两种探针实现了临床。正如下表中所显示的那样，对于^mTc(CO)₃-DTPA-folate，其在肝脏及肌肉中有明显的摄取，从而导致了瘤/肝及瘤/肉比值不甚理想；^99mTc-DTPA-folate在荷KB肿瘤小鼠上进行了叶酸靶向实验，实验证明在4h肿瘤部位有很高的放射性摄取，但是其稳定性需要建立在高浓度DTPA-folate上。正如所描述的那样，多数的小分子显像探针的设计思路为一个靶向分子连接一个显像基团，但对于一些比活度要求高或是需要局部组织高浓度的受体类探针而言，一个分子中只含有一个显像基团往往不能满足需求。故在一个分子上连接多个核素，同时保障其对靶向部分的高亲和力，对于提高图像质量具有重要作用。

CN101925367A公开了一种治疗性标记的萘并二蒽酮或菲并[1,10,9,8-opqra]苝-7,14-二酮化合物,该化合物包含具有不稳定核的化学元素或同位素，在其衰变成稳定态期间可发射辐射,这种辐射足以破坏临近的细胞或组织以用于靶向性放射治疗，从而提高接受坏死诱导抗肿瘤治疗的温血动物的治愈可能性。

CN102284069A公开了一种荧光和放射性核索双标记的靶向显像剂的制备方法与应用，所述化合物是111In-DTPA-Bz-NH-SA-K(IR-783-S-Ph-CO)-c(CGRRAGGSC)NH2,称之为白介素11受体α链双标显像剂，由荧光显像剂IR-783-S-Ph-COOH、放射性核素铟-111和循环多肽三部分构成。循环多肽(1)是一种理想的造影剂的载体,能够靶向得定位到IL-11R-α链。

CN101035565A公开了一种FDG替代物，它们由二成分系统组成,所述系统一方面包含与叠氮化物、炔或膦相连的结构单元如葡萄糖，而另一方面包含与叠氮化物、炔或膦相连的可检测标记物，所述可检测标记物是施陶丁格连接反应或[3+2]环加成反应中与葡萄糖相连的基团的对应部分。

CN102600489A公开了一种含iRGD序列的多肽放射性药物，所述多肽(peptide)的序列中含有或或者该多肽经偶联放射性金属核素或者正电子核素标记而成，其具有分子靶向整合素α_vβ₃受体、Neuropilin-l受体和细胞转导三重功能，其作为诊断药物会大大提高靶/非靶比。

WO2003/097105A1公开了一种可以被双特异性抗体或抗体片段结合的靶向构建体，所述抗体或抗体片段有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂。靶向构建体含有载体部分，所述载体部分包含或携带至少一个可被所述双特异性抗体或抗体片段的至少一个臂识别的表位。

WO2006/038185A1公开了一种用于靶向医学显像或治疗的试剂盒，其包括：至少一个寻靶探针，其包括一级寻靶部分和二级靶标；和至少一个另外的探针，其选自：包括二级寻靶部分和标记的显像探针；或包括二级寻靶部分和药物活性化合物的治疗探针，其特征在于，所述寻靶探针或所述显像或治疗探针中的任一个包括至少一个叠氮基，分别作为二级靶标和二级寻靶部分，而另一个探针包括至少一个膦基团，所述膦和所述叠氮基是施陶丁格连接用的反应配偶子。

“放射性核素标记多肽在肿瘤应用研究进展”，张丽等，肿瘤学杂志，2010年06期综述了用不同的放射性核素对RGD肽进行标记的方法，综述了对RGD结构的改进修饰中以及存在的问题，同时就不同放射性核素标记RGD肽的应用现状与研究进展作一综述。

在现有技术中，靶向化合物的亲和力与选择性一直是研究的重点，但结果仍然不能令人满意。对于一般的探针而言，往往存在结构单一(一般为靶向基团与双功能螯合剂通过某种化学键结合)、合成过程繁琐且产率不高(往往需要保护和脱保护等过程，切纯化过程复杂)等问题。

为了解决现有技术中存在的这些问题，本发明人经过深入研究和大量实验，在此提出靶向基团多聚体化合物的概念。即对于小分子靶向探针来说，通过形成多聚体可有效提高配体与受体的亲和力与选择性，最终提高探针在靶组织中的摄取率，并因此获得高质量的显像结果。为了形成多聚体结构，需要选用特殊规格的骨架与靶向基团进行有效组装。本发明以炔丙胺为初始反应物，通过反复的Michael加成及酰胺化反应可得到不同代数、三维结构规整、高度支化、外围基团为氨基的分子骨架。本发明即选用该分子骨架作为骨架，将靶向分子与其外部氨基进行连接，另一端通过炔基发生Click反应连接双功能螯合基团，设计并合成了基于单体及多聚体概念的单靶向、双靶向、四靶向、多靶向型分子探针，用作潜在的肿瘤显像剂。此外，通过PEG(聚乙二醇)结构的引入，使得靶向分子与双功能连接剂之间的距离增长，此项修饰可在一定程度上降低核素对亲和力的影响，从而改变药代动力学，增加靶/非靶比。这样的设计方式在现有技术中尚未见报导，同时现有技术中就这样的设计方式也未给出设计思路启示或教导。

针对靶向分子单体及多聚体探针的研究能够有效增强分子探针对肿瘤组织的亲和力和结合力，目前还没有人较为系统地提出或是研究这种靶向分子多聚体的概念。由于靶向基团和双功能螯合基团之间的分子骨架具有高度可修饰性、可改造性，在分子探针的设计上预留的空间大，此种多聚体概念能够很容易地适用于多种靶向基团分子探针的设计，可操作性强。该类型配合物的研制，对于寻找靶向基团单体及多聚物亲和性规律具有重要意义，具有应用及借鉴价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一类用于核素标记的靶向化合物。

本发明的另一目的在于提供上述用于核素标记的靶向化合物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述用于核素标记的靶向化合物的应用

本发明的具体技术方案如下：

一种用于核素标记的靶向化合物，其结构通式为如下：

或

其中R₁为核素螯合基团，R₂为靶向基团，D_n为以炔丙胺为核、外围基团为氨基的分子骨架，n不同代数且其数值为大于等于0的整数，m＝2ⁿ。n优选为0，优选为1，更优选为2或3。所述R₂可以彼此独立地相同或不同。

在本发明的一个优选实施方案中，所述R₁为HYNIC、NOTA、DOTA或DTPA。其结构如下：

在本发明的一个优选实施方案中，所述核素为^99mTc、¹¹¹In、¹⁸F、¹⁷⁷Ru、¹⁵⁷Gd、⁶⁴Cu和/或^67/68Ga。

在本发明的一个优选实施方案中，所述R₂为衍生自叶酸、表皮生长因子、RGD或乳糖酸的靶向基团。

一种上述用于核素标记的靶向化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成R₂-NHS或R₂-PEG-NHS溶液；

(2)将R₂或R₂-PEG连接至所述的分子骨架上：将所述分子骨架的DMSO溶液滴加到上述R₂-NHS溶液或R₂-PEG-NHS溶液中，反应完全后用乙醚析出沉淀，干燥沉淀后，即得连接有靶向基团的分子骨架；

(3)合成R₁-NHS：将核素螯合物(HYNIC、NOTA、DOTA或DTPA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)(或EDC)混合反应过夜，过滤即得；

(4)将3-叠氮丙胺加入到R₁-NHS中，反应完成后浓缩得到固体，用HPLC纯化或用酸乙酯稀释，加热回流，热过滤得到淡黄色固体，真空干燥即成；

(5)将连接有靶向基团的D_n-(R₂)_m或D_n-(PEG-R₂)_m搅拌溶解于t-BuOH/H₂O混合液中，再加入等摩尔量的步骤(4)所得的R₁-N₃、催化剂CuSO₄·5H₂O及抗坏血酸钠进行反应，整个反应体系处于氮气保护中，反应完全后用碱调节直到反应液变澄清后过滤，滤液用酸调节产生大量沉淀，收集沉淀，真空干燥得所述用于核素标记的靶向化合物。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：将靶向物质(叶酸、表皮生长因子、RGD或乳糖酸)溶解于溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及二环己基碳二亚胺(DCC)，避光反应完全后过滤，即得R₂-NHS溶液。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)包括如下步骤：

a、将靶向物质(叶酸、表皮生长因子、RGD或乳糖酸)溶解于溶剂中，加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及二环己基碳二亚胺(DCC)，避光反应完全后过滤，得R₂-NHS溶液；

b、将不同分子量的PEG溶于溶剂中，滴加上述R₂-NHS溶液，反应完全后用乙醚析出沉淀收集沉淀并干燥，得R₂-PEG-NH₂溶液；

c、将过量的丁二酸酐及催化量的4-二甲氨基吡啶加入到上述R₂-PEG-NH₂溶液中，室温搅拌反应过夜后将反应液过滤，用乙醚析出沉淀并干燥，得R₂-PEG-COOH；

d、将上述R₂-PEG-COOH溶解于溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及二环己基碳二亚胺(DCC)，室温搅拌反应过夜后将反应液过滤得到R₂-PEG-NHS溶液。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的分子骨架的制备反应式如下所示：

所述分子骨架的端部的氨基可以与R₂或R₂-PEG连接，所述分子骨架的端部的炔基可与化合物分子的其它部分连接。

一种上述用于核素标记的靶向化合物作为肿瘤及炎症性相关疾病显像剂的应用。

本发明的突出的有益效果是：

1、本发明的制备方法将配位结构及靶向基团通过click反应相连接，反应高效，纯化简单，利于大规模生产。这样的结构设计在现有技术中没有记载，也没有给出相应的技术启示或教导，是本领域技术人员不容易想到的。

2、本发明的用于核素标记的靶向化合物选择的配位基团具有标记能力强、标记时间短、标记产率高等特点，无须后续纯化即可使用，更加有利于标记物的商业化应用与临床推广。

3、本发明的用于核素标记的靶向化合物的靶向基团(如叶酸)与核素(如^99mTc)形成的单体及多聚体对肿瘤组织具有高靶向性和亲和力，通过仪器扫描能够得到高质量的显像结果，起到有效监测肿瘤或炎症疾病的作用。

4、本发明的用于核素标记的靶向化合物在靶向基团以及配位结构之间引入PEG链，可以增加靶向基团到配位结构之间的距离，避免相互之间的影响，同时也增加配合物的水溶性，改善标记配合物的药代动力学性质，加快示踪剂在非靶组织中的清除速度，增加靶/非靶比值，使得显像更加清晰，通过提高显像质量达到更好的诊断效果。这样的效果是先前所没预料到的。

5、本发明的制备方法制备了一系列的靶向基团多聚体，通过增加靶向基团的数量，提高每一个靶向基团与受体结合的几率，进一步增强配体与受体之间的亲和力，提高标记配合物的肿瘤摄取，达到更好的诊断效果。

6、本发明的用于核素标记的靶向化合物的制备思路扩展性强，靶向基团和配位基团均可任意替换为其他常用靶向分子和配体，从而获得不同靶向功能的可用于不同核素标记的分子靶向化合物。

附图说明

图1为本发明实施例6中^99mTc标记叶酸靶向单体化合物的HPLC分析图，其中(a)图为叶酸靶向单体HYNIC-D₀-FA₁的HPLC分析图；(b)图为放射性标记的叶酸靶向单体^99mTc-HYNIC-D₀-FA₁的HPLC分析图；(c)图为放射性标记的叶酸靶向单体^99mTc-HYNIC-D₀-FA₁在生理盐水中室温下放置6小时的HPLC分析图；

图2为本发明实施例6中^99mTc标记的叶酸靶向单体化合物^99mTc-HYNIC-D₀-FA₁在荷KB瘤裸鼠内不同时间SPECT/CT显像图，其中，(a)图为叶酸抑制组，注射^99mTc-HYNIC-D₀-FA₁前10min注射100μg叶酸；(b)图为只注射^99mTc-HYNIC-D₀-FA₁；(c)图为PMX抑制组，在注射^99mTc-HYNIC-D₀-FA₁前1h注射400ug PMX；

图3为本发明实施例6中^99mTc标记的叶酸靶向单体化合物(PEG修饰)^99mTc-HYNIC-D₀-PEG-FA₁在荷KB瘤裸鼠的SPECT/CT显像图，其中(a)图为叶酸抑制组，在注射放射性之前10min注射100μg叶酸进行抑制；(b)图为正常组，只注射放射性标记物(500μCi/只)；(c)图为PMX实验组，在注射放射性前1h注射400μg PMX；

图4为本发明实施例6中^99mTc标记的叶酸靶向单体化合物及多聚体靶向化合物(含PEG修饰)的细胞结合实验结果图；

图5为本发明实施例6中^99mTc标记得叶酸靶向多聚体靶向化合物(含PEG修饰)在荷KB瘤裸鼠2h的SPECT/CT显像图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1——叶酸靶向单体化合物的合成

叶酸靶向单体化合物的制备方法，反应式如下：

1)D₀-FA₁为例

将叶酸溶解于适量二甲基亚砜中，加一定量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及二环己基碳二亚胺(DCC)，避光反应完全后过滤。将一定量炔丙胺(D₀)滴加到上述FA-NHS滤液中，加少量N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，反应完全后用乙醚析出沉淀，收集沉淀并干燥，得D₀-FA₁。

2)azido HYNIC的制备

将6-氯-尼古丁酸加到适量80％的水合肼中，高温加热使之完全反应，浓缩得到淡黄色固体。将固体溶解在水中，调节pH约为弱酸性后出现沉淀，过滤分离，所得固体用95％乙醇和乙醚洗涤，真空干燥。将干燥后的产物溶于一定量的DMF中，加入对应摩尔量N,N-二甲基苯甲醛，搅拌6-10h，再加入适量NHS和DCC，反应过夜。过滤得到含有HYNIC-NHS的滤液。将3-叠氮丙胺加入到HYNIC-NHS的滤液中，同时加入少量DIPEA(缚氢剂，使反应体系呈碱性)，反应完全后浓缩得到固体，再用酸乙酯稀释，加热回流，热过滤得到淡黄色固体，真空干燥得azido HYNIC。

3)叶酸靶向单体化合物HYNIC-D₀-FA₁的制备

将D₀-FA₁搅拌溶解于t-BuOH/H₂O混合液中，加入等摩尔量的azido HYNIC。注入催化量CuSO₄·5H₂O及抗坏血酸钠。反应完全后用碱调节直到反应液变澄清后过滤。滤液用酸调节产生大量沉淀，收集沉淀。真空干燥得叶酸单体HYNIC-D₀-FA₁。

实施例2——PEG修饰的叶酸靶向单体化合物的合成

PEG修饰的叶酸靶向单体化合物的制备方法，反应式如下：

1)FA-PEG-NH₂的合成

将叶酸溶解于适量二甲基亚砜中，加一定量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及二环己基碳二亚胺(DCC)，避光反应完全后过滤。将2,2'-(乙烯二氧)双(乙胺)溶于DMSO中，加入适量DIPEA，滴加溶有FA-NHS的DMSO溶液，反应完全后用二氯甲烷析出沉淀收集沉淀并干燥，得FA-PEG-NH₂。

2)FA-PEG-COOH的合成

将过量的丁二酸酐及催化量的4-二甲氨基吡啶加入到FA-PEG-NH₂的DMSO溶液中，室温搅拌反应过夜后将反应液过滤，用乙醚析出沉淀并干燥，得FA-PEG-COOH。

3)D₀-PEG-FA₁的制备

将FA-PEG-COOH溶解于适量DMSO中，加入适量N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及二环己基碳二亚胺(DCC)，室温搅拌反应过夜后将反应液过滤得到含有FA-PEG-NHS的滤液。将炔丙胺(D₀)滴加到上述FA-PEG-NHS滤液中，加入DIPEA，室温下反应两天。反应液用乙醚沉淀并干燥，得黄色粉末状固体。

4)HYNIC-D₀-PEG-FA₁的制备

将D₀-PEG-FA₁搅拌溶解于t-BuOH/H₂O混合液中,搅拌中加入等摩尔量azidoHYNIC(合成步骤参见实施例1)。注入催化量CuSO₄·5H₂O及抗坏血酸钠。结束反应后，用碱调节直到溶液变澄清后过滤。滤液用酸调节得沉淀，离心并干燥得PEG修饰的叶酸靶向单体化合物HYNIC-D₀-PEG-FA₁。

实施例3——叶酸靶向多聚体化合物的合成

叶酸靶向多聚体化合物的制备方法，反应式如下：

1)分子骨架D_n的合成：

I)D_0.5的合成

在冰水浴中，将100mL丙烯酸甲酯的甲醇溶液加入到三口烧瓶中，氮气保护下滴加溶有炔丙胺(D₀)的甲醇溶液50mL。在冰浴中反应1h之后再室温反应3d，旋转蒸发除去溶剂无水甲醇及过量的丙烯酸甲酯，得到D_0.5为黄色液体。

II)D₁的合成

在冰水浴中，将D_0.5溶于甲醇，在氮气保护下缓慢滴加到含有乙二胺的甲醇溶液中。滴加完后在冰浴中继续反应1h，后在室温下搅拌3d，旋转蒸发除去溶剂甲醇及多余的乙二胺，得淡黄色液体D₁。

III)D_n的合成

D_n(n>1)树状分子的合成可参考D_0.5及D₁的制备过程。

2)D_n-FA_m的制备

将溶有D_n的DMSO溶液滴加到制备好的FA-NHS(合成步骤参见实施例1)滤液中，加入适量N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下反应2d。将反应液缓慢滴加到大量冰冷的乙醚及丙酮混合液中，产生大量黄色沉淀，过滤，并用二氯甲烷及乙醚洗涤，真空干燥箱中干燥，得黄色粉末状固体。

3)叶酸靶向多聚体化合物HYNIC-D_n-FA_m的制备

将D_n-FA_m搅拌溶解于t-BuOH/H₂O混合溶液中,搅拌中加入等摩尔量azido HYNIC(合成步骤参见实施例1)，整个反应体系处于氮气保护中。用针注入催化量的CuSO₄·5H₂O及抗坏血酸钠。反应在室温或加热条件下避光进行1h。反应完成之后用碱调节直到溶液变澄清，过滤，将滤液用酸调节直到产生沉淀，离心并用乙醚洗涤沉淀3次，真空干燥得淡黄色固体。

实施例4——PEG修饰的叶酸靶向多聚体化合物的合成

PEG修饰的叶酸靶向多聚体化合物的制备方法，反应式如下：

1)FA-PEG-NHS的制备

制备方法同实施例2中的1)～4)步骤。

2)不对称分子骨架D_n的合成

制备方法同实施例3中步骤1)。

3)D_n-PEG-FA_m的制备

将溶有D_n的DMSO溶液滴加到制备好的FA-PEG-NHS滤液中，加入适量N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下反应两天。将反应液缓慢滴加到大量冰冷的乙醚及丙酮混合液中，产生大量黄色沉淀，过滤，并用二氯甲烷及乙醚洗涤，真空干燥箱中干燥，得黄色粉末状固体。

5)叶酸靶向多聚体化合物HYNIC-D_n-PEG-FA_m的制备

将D_n-PEG-FA_m搅拌溶解于t-BuOH/H₂O混合溶液中，搅拌中加入等摩尔量azidoHYNIC(合成步骤参见实施例1)。注入催化量CuSO₄·5H₂O及抗坏血酸钠。反应完成之后用碱调节直到溶液变澄清，过滤，将滤液用酸调节直到产生沉淀，离心并用乙醚洗涤沉淀3次，真空干燥得淡黄色固体。

实施例5：

1、^99mTc冻干药盒的制备

1)配制含一定量配体、TPPTS、tricine、氯化亚锡、甘露醇的溶液。

2)将上述混合液冻干后压盖密封保存，得冻干药盒。

2、^99mTc标记的叶酸靶向单体化合物及多聚体靶向化合物(含PEG修饰)的制备

A湿法标记方案：

1)配制含一定量配体、TPPTS、tricine、及氯化亚锡的溶液。

2)加入新鲜淋洗的^99mTcO₄ ^-溶液，密闭80-100℃反应30min，冷却；

3)反应液可直接使用，也可经Sep-Pak C18色谱柱分离纯化：依次以10mL水及10mL无水乙醇活化柱子，用空气吹干，将反应液注入到柱子中，以缓冲液或水冲洗色谱柱除去未反应的^99mTcO₄ ^-离子，再以20％-80％的乙醇溶液淋洗柱子，收集淋洗液并浓缩，再用缓冲液或生理盐水稀释，即得^99mTc标记注射液。

B干法标记方案：

1)取冻干药盒1支，加入新淋洗的^99mTcO₄ ^-，密闭80-100℃反应30min，冷却；

2)反应液可直接使用，也可经Sep-Pak C18色谱柱分离纯化：依次以10mL水及10mL无水乙醇活化柱子，用空气吹干，将反应液注入到柱子中，以缓冲液或水冲洗色谱柱除去未反应的^99mTcO₄ ^-离子，再以20％-80％的乙醇溶液淋洗柱子，收集淋洗液并浓缩，再用缓冲液或生理盐水稀释，即得^99mTc标记化合物注射液。

上述合成步骤中的所使用的其它化学物质为市售商品。

实施例6

以下对按上述实施例中方法所制备的单体、多聚体靶向化合物及其^99mTc标记的靶向化合物的性能测定描述：

1.HPLC分析鉴定

HPLC体系如下：反相C18分析柱(4.6×250mm)，淋洗梯度：A:90％NH₄HCO₃(0.05mol/L pH 7.0)/10％CH₃OH,B:100％CH₃OH.0-10min,B:5-50％；10-20min,B:50-50％；20-30min,B:50-5％，流速为1mL/min。

结果可参见图1。

2.脂水分布系数测定

^99mTc标记的叶酸靶向单体化合物及多聚体靶向化合物(含PEG修饰)的脂水分布系数(log P)测定通过以下步骤完成：

将100μL稀释后的放射性注射液加入到含有0.9mL PBS(0.05mol/L,pH＝7.4)和1ml正辛醇混合液的离心管中，涡旋震荡2min之后，6000rpm离心5min，从PBS相及正辛醇相中各取100μL液体并通过γ-counter放射性计数。实验重复三次取平均值。脂水分布系数(log P)的计算公式为：

P＝(I_a-I)/(I_b-I)

其中I_a代表油相中测定的放射性计数、I_b代表水相中测定的放射性计数、I代表背景计数。

通过计算，最终测定各放射性标记的配合物的脂水分布系数。

由实验结果可知，单体及多聚体都呈现水溶性性质。总体比较而言，有PEG修饰的标记化合物的水溶性要比没有PEG修饰的好一些，证明PEG结构的引入确实可以增加溶解性。

结果可参见下表2：

3.细胞结合实验

实验所选取的细胞为KB细胞(取自人的鼻咽癌细胞株)，细胞摄取实验步骤为：

(1)将标记液加入到处理好的乏叶酸培养基中，使放射性量稀释为大约1～3μCi/mL。

(2)将已经形成贴壁细胞的24孔板取出，吸走培养基，再向每个孔中加入约0.5mL的乏叶酸培养基，随后吸出以洗去死去或是脱落的细胞。

(3)依次向每孔加入100μL含标记化合物的培养基，再补充约200μL乏叶酸培养基，加盖后放置于培养箱中培养。抑制组提前加入10uL叶酸(1mg/mL)进行抑制。

(4)到达每个实验时间点时，及时将孔中的培养基吸出，加入约0.5mL PBS(含0.2％BSA)洗两次，再加入0.5mL pH值为4.0的stripping buffer洗1次，收集stripping buffer洗液于试管中；最后再用0.5mL 1M NaOH将细胞洗脱，用移液器吸头轻刮板孔底部，使细胞完全脱离，吸取孔板内所有NaOH溶液和细胞于小试管中。测量计数。

(5)取3份100μL含有标记物的binding medium作为total added activity，在计数器上进行计数。

从实验结果可知，向KB细胞中加入标记化合物之后，随着时间的延长，细胞总结合和内化值都在不断的增加。通过抑制组数据曲线可以看出叶酸竞争性地结合了KB细胞内的叶酸受体；以上数据可以看出各个标记化合物和叶酸受体是靶向性结合的。通过单体和多聚体之间的对比可以发现，随着时间的延长，单体与细胞的结合率相对于多聚体来说更高一些。例如在2h及4h，各个标记化合物与细胞的结合率大小为：单体>二聚体>四聚体。通过有无加PEG修饰的组别对比可以发现，加入PEG修饰的标记化合物比未加PEG修饰的标记化合物在结合律上更具优势。这可能缘于PEG的加入改善了其水溶性并且增加了其生物相容性。PEG链在一定程度上也拉长了靶向基团和放射性核素之间的距离，避免相互影响。

结果详见图4。

4.^99mTc标记配合物在荷瘤裸鼠体内的生物分布

实验选用18-20g的裸鼠，每只裸鼠前肢腋下注射约5×10⁶量的KB细胞液。在实验的前一周应改用乏叶酸的食物进行喂食。每只小鼠通过尾静脉注射的注射剂量为10μCi/100μL，取血和心、肝、肺、肾等主要脏器，称重并计数。在叶酸抑制实验中，在注射放射性标记物之前10min注射100μg叶酸进行抑制，并在相应时间点将小鼠处死，取主要脏器称重计数。

^99mTc-HYNIC-D₀-FA₁生物分布实验结果表明，其在2h及4h时间点的肾脏摄取为所有器官中最高。对于肿瘤而言，肿瘤对放射性标记物的摄取也维持在一个较高的值，在2h时达到最高值9.67±1.19％ID/g。并且，其在肿瘤中有很好的滞留，在4h仍然可以达到8.14±0.45％ID/g，显示出良好的肿瘤靶向效果。令人可喜的是，在其他非靶器官中的放射性积累很低，表明^99mTc-HYNIC-D₀-FA₁具有优良的生物分布性能。在叶酸抑制实验中，2h肾脏的摄取值降低到7.73±0.52％ID/g，降低了88％；肿瘤的摄取值降低到了0.74±0.12％ID/g，降低了92％，可见，叶酸的加入对放射性标记物在肿瘤和肾中的摄取造成了明显的抑制。为降低放射性标记物在肾中的摄取，避免对肾脏造成不必要的辐射伤害，实验中采用叶酸拮抗剂PMX对放射性标记物在肾脏中的摄取进行抑制。实验结果表明，PMX的加入使得肾中的放射性摄取降到35.13±4.14％ID/g，相比而言降低了47％。而肿瘤的摄取值基本不受影响，仍然可以达到9.48±1.79％ID/g。

^99mTc-HYNIC-D₀-PEG-FA₁的肿瘤和肾摄取相比于^99mTc-HYNIC-D₀-FA₁有大幅度的升高，在2h瘤和肾的摄取值分别达到16.30±2.01％ID/g和101.98±4.69％ID/g；在4h分别达到了14.90±0.62％ID/g和98.30±3.87％ID/g，体现了靶向化合物良好的肿瘤靶向能力和滞留效果。在其他非靶器官中的放射性积累很低，得到了相对较好的瘤与背景比值，表明^99mTc-HYNIC-D₀-PEG-FA₁具有优良的生物分布性能。在叶酸抑制实验中，2h肾脏的摄取值降低到11.50±1.73％ID/g，降低了89％；肿瘤的摄取值降低到了0.77±0.19％ID/g，降低了95％，可见，叶酸的加入对放射性标记物在肿瘤和肾中的摄取造成了明显的抑制。在引入PEG基团之后，瘤/肝、瘤/肾、瘤/肉比值都有一定程度的提高，证明修饰思路是可行的。

通过对比发现PEG修饰的单体、二聚体、四聚体在肿瘤中2h的摄取值分别为：16.30±2.01％ID/g、10.20±1.22％ID/g、8.36±1.38％ID/g；在4h的摄取值分别为：14.90±0.62％ID/g、11.02±0.92％ID/g、9.22±1.32％ID/g。虽然三种靶向化合物都具有良好的生物分布性能，且注入过量叶酸之后抑制效果明显，但从实验结果对比可以看出，单体靶向化合物在肿瘤中的摄取最高。单体、二聚体、四聚体在肾脏中2h的摄取值分别为：101.98±4.69％ID/g、87.27±5.66％ID/g、95.29±6.23％ID/g；在4h的摄取值分别为：98.30±3.87％ID/g、92.94±4.53％ID/g、98.01±6.97％ID/g。即在两个时间点上肾脏对单体、二聚体、四聚体的摄取值差别不大。^99mTc-HYNIC-D₀-PEG-FA₁在2h及4h瘤/肾比值可达到0.16及0.15，瘤/肉比值可达到31.2和49.7，瘤/血比值可达12.1和18.9。

结果详见下表3、表5、表6。

5.肿瘤模型鼠MicroSPECT显像

实验动物模型的建立可参考生物分布实验。每只小鼠通过尾静脉注射的注射计量约为18MBq(250μL，～7nmol)。在注射放射性标记物之后的不同时间点进行成像。

对于^99mTc-HYNIC-D₀-FA₁而言，SPECT/显像图可以很好地反应叶酸靶向的单体靶向化合物在荷KB瘤裸鼠上的分布情况。除了肿瘤和肾脏部位有较高的放射性摄取外，其他脏器部位均无明显摄取。由于代谢的原因，在膀胱部位有一定的放射性滞留。在2h及4h两个显像时间点上，肿瘤和肾脏对放射性示踪剂的摄取没有发生太大的变化，说明示踪剂在这两个部位的滞留效果良好。提前注射叶酸进行抑制后，肾脏和肿瘤的放射性量受到明显的抑制。为降低标记物在肾中的摄取，采用PMX进行了肾脏保护实验研究，提前1h注射PMX可使得肾脏的摄取值降低，而肿瘤的摄取值并没有受到影响反而略有增加，结果是瘤/肾值的升高。

对于^99mTc-HYNIC-D₀-PEG-FA₁而言，除了肿瘤和肾脏部位有较高的放射性摄取外，其他脏器部位均无明显摄取，呈现良好的瘤与背景对比度。与未用PEG修饰的HYNIC-D₀-FA₁相比，肿瘤和肾脏的摄取明显增强，并且从2h-10h都有十分明显的滞留。提前注射叶酸后，肾脏和肿瘤的放射性量受到明显的抑制。瘤/肾比在2h-10h都维持在0.7左右，最高时为4h的0.78。提前1h注射PMX，肾的摄取得到抑制而肿瘤的摄取可以保持，使得肿瘤/肾值有很大的提高，特别是4h达到1.03。由此推测，PEG结构的引入确实在一定程度上改善了化合物的生物性能。

对于叶酸二聚体及四聚体靶向化合物(含PEG修饰)，在2h时间点，各个标记化合物在肿瘤与肾脏中都有较高的摄取。相对于背景有较高的对比值。在其他的非靶器官中都没有观察到明显的放射性滞留，能够获得较高的靶与非靶比值。在显像图中，各个标记化合物的显像效果差别不大。

结果详见图2、图3、表4、图5。

上述所涉及的表格如下：

表1  不对称骨架分子信息

表2  叶酸单体及多聚体化合物(含PEG修饰)脂水分布系数

表3  ^99mTc标记的叶酸靶向单体化合物(^99mTc-HYNIC-D₀-FA₁)在荷KB瘤裸鼠体内的生物分布结果(％ID/g,mean±SD,n＝5)

表4  通过在SPECT/CT显像图选择ROI确定的^99mTc-HYNIC-D₀-PEG-FA₁在荷KB瘤裸鼠的瘤/肾值

表5  ^99mTc标记的叶酸靶向多聚体化合物(PEG修饰)^99mTc-HYNIC-D_n-PEG-FA_m在荷KB瘤裸鼠的生物分布结果

表6  为^99mTc标记的叶酸靶向多聚体化合物(PEG修饰)^99mTc-HYNIC-D_n-PEG-FA_m在荷KB瘤裸鼠的靶/非靶值

在过去很长的一段时间里，一系列用于PET及SPECT显像的叶酸靶向分子靶向化合物应运而生。然而，只有¹¹¹In-DTPA-folate和^99mTc-EC20两种靶向化合物实现了临床。与其他的核素相比，^99mTc具有诸多的优势，所以多种^99mTc标记的叶酸靶向分子靶向化合物被合成并进行了体内外的评价。相比于其他核素标记的叶酸靶向靶向化合物，本发明中的单体及多聚体均具有综合优势：HYNIC用于放射性标记是一种更为理想的手段(标记时HYNIC的量往往更少，同时标记效率更高)；更为简单的合成途径(Click反应)；在靶向分子靶向化合物的研究中引入了多聚体概念，实现创新的同时得到了良好的生物评价效果；冻干药盒化简化了标记及纯化过程，更有利于临床推广。

本发明所使用的核素除^99mTc外，还可能为¹¹¹In、¹⁸F、¹⁷⁷Ru、¹⁵⁷Gd、⁶⁴Cu和/或^67/68Ga等；所用的靶向基团除叶酸外，还可能为RGD、表皮生长因子或是乳糖酸等具有靶向功能的分子结构；所用的螯合剂除HYNIC外，还可能为NOTA、DOTA以及DTPA等双功能螯合结构。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种用于核素标记的靶向化合物，其特征在于：其结构通式为如下：

其中R₁为核素螯合基团，R₂为靶向基团，D_n是以炔丙胺为初始反应物、通过反复的迈克尔加成反应和酰胺化反应形成的分子骨架，其外围基团为氨基，n代表不同代数且其数值为大于等于0的整数，m＝2ⁿ。

2.如权利要求1所述的一种用于核素标记的靶向化合物，其特征在于：所述R₁为HYNIC、NOTA、DOTA或DTPA。

3.如权利要求1所述的一种用于核素标记的靶向化合物，其特征在于：所述核素为^99mTc、¹¹¹In、¹⁸F、¹⁷⁷Ru、¹⁵⁷Gd、⁶⁴Cu和/或^67/68Ga。

4.如权利要求1所述的一种用于核素标记的靶向化合物，其特征在于：所述R₂为衍生自叶酸、表皮生长因子、RGD或乳糖酸的靶向基团。

5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的用于核素标记的靶向化合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)制备R₂-NHS或R₂-PEG-NHS溶液；

(2)将R₂或R₂-PEG连接至所述分子骨架：将所述分子骨架溶于DMSO中，滴加到上述R₂-NHS溶液或R₂-PEG-NHS溶液中，反应完全后用乙醚析出沉淀，干燥沉淀后，即得连接有靶向基团的D_n-(R₂)_m或D_n-(PEG-R₂)_m；

(3)合成R₁-NHS：将核素螯合物、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺混合反应过夜，过滤即得；

(4)将R₁-N₃的制备：将3-叠氮丙胺加入到步骤(3)所得的滤液中，反应完成后浓缩得到固体，用HPLC纯化或用酸乙酯稀释，加热回流，热过滤得到淡黄色固体，真空干燥即成；

(5)将连接有靶向基团的D_n-(R₂)_m或D_n-(PEG-R₂)_m搅拌溶解于t-BuOH/H₂O混合液中，再加入等摩尔量的步骤(4)所得的R₁-N₃、催化剂CuSO₄·5H₂O及抗坏血酸钠进行反应，整个反应体系处于氮气保护中，反应完全后用碱调节直到反应液变澄清后过滤，滤液用酸调节产生大量沉淀，收集沉淀，真空干燥得所述用于核素标记的靶向化合物。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)为：将靶向物质溶解于溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺及二环己基碳二亚胺，避光反应完全后过滤，即得R₂-NHS溶液。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)包括如下步骤：

a、将靶向物质溶解于溶剂中，加N-羟基琥珀酰亚胺及二环己基碳二亚胺，避光反应完全后过滤，得R₂-NHS溶液；

b、将不同分子量的PEG溶于溶剂中，滴加上述R₂-NHS溶液，反应完全后用乙醚析出沉淀收集沉淀并干燥，得R₂-PEG-NH₂溶液；

c、将过量的丁二酸酐及催化量的4-二甲氨基吡啶加入到上述R₂-PEG-NH₂溶液中，室温搅拌反应过夜后将反应液过滤，用乙醚析出沉淀并干燥，得R₂-PEG-COOH；

d、将上述R₂-PEG-COOH溶解于溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺及二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应过夜后将反应液过滤得到R₂-PEG-NHS溶液。

8.如权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：所述分子骨架的制备反应式如下所示：

9.一种权利要求1至4中任一权利要求所述的用于核素标记的靶向化合物作为肿瘤及炎症性相关疾病显像剂的应用。