CN104844711A - 一种多聚体荧光蛋白复合物及其应用 - Google Patents
一种多聚体荧光蛋白复合物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104844711A CN104844711A CN201410054047.6A CN201410054047A CN104844711A CN 104844711 A CN104844711 A CN 104844711A CN 201410054047 A CN201410054047 A CN 201410054047A CN 104844711 A CN104844711 A CN 104844711A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fluorescin
- monomer
- fragment
- transpeptidase
- albumen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 28
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 title abstract 6
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 title abstract 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 6
- MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N fluorescin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 100
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 62
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 50
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 108090000279 Peptidyltransferases Proteins 0.000 claims description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 12
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 11
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 108700011146 GPA 7 Proteins 0.000 claims description 8
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 7
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- AMAICRYCMCVAHT-UHFFFAOYSA-K calcium;sodium;trichloride Chemical compound [Na+].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Ca+2] AMAICRYCMCVAHT-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 108090000250 sortase A Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000251 Sortase B Proteins 0.000 claims description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 claims description 2
- 108090000824 sortase C Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract description 10
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- POVNCJSPYFCWJR-USZUGGBUSA-N (4s)-4-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-[(2s)-2-[[2-[(2s)-2-[[(2s)-1-[[(2s,3r)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-methylpropyl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1- Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 POVNCJSPYFCWJR-USZUGGBUSA-N 0.000 description 4
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 3
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000006867 Discosoma Species 0.000 description 2
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 2
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PVGBHEUCHKGFQP-UHFFFAOYSA-N sodium;n-[5-amino-2-(4-aminophenyl)sulfonylphenyl]sulfonylacetamide Chemical compound [Na+].CC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 PVGBHEUCHKGFQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Abstract
本发明公开了一种多聚体荧光蛋白复合物及其应用。该多聚体荧光蛋白复合物，由多聚体荧光蛋白和目的蛋白连接而成；所述多聚体荧光蛋白由若干个荧光蛋白单体组成；所述目的蛋白是能够与靶标蛋白相互作用的蛋白。蛋白复合物保留了单区抗体的抗原识别特异性，并能染色表达该抗原的细胞。单区抗体和DsRed能在体外被耦合连接，连接产物在没有其他标记试剂的情况下，能直接用于一步染色，在FACS及其他领域有较强的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种多聚体荧光蛋白复合物及其应用。
背景技术
单区抗体来自于骆驼的重链抗体(Hamers-Casterman,Atarhouch et al.1993)。重链抗体缺失重链第一恒定域和轻链，其单链的稳定性是由于可变域第二框架区4个氨基酸的取代(Muyldermans,Atarhouch et al.1994;Vu,Ghahroudi et al.1997)。单区抗体也可来自于常规抗体的可变域(Chen,Zhu et al.2008)。
Discosoma红色荧光蛋白，与从VICTORIA水母的绿色荧光蛋白(GFP)同源，是一个来自珊瑚Discosoma的红色荧光蛋白(Matz,Fradkov et al.1999)。红色荧光蛋白(DsRed)的晶体结构表明，其以四聚体形式存在(Yarbrough,Wachter et al.2001)。由于野生性DsRed有成熟缓慢等主要缺点(Baird,Zacharias et al.2000)，研究人员将DsRed的突变，突变体克服了缓慢成熟的缺点并提高了溶解度(Bevis and Glick2002;Yanushevich,Staroverov et al.2002)。除了在558nm最佳激发处激发，DsRed的也可通过共焦显微镜和流式细胞仪中标准的488nm激光所激发(Hawley,Telford et al.2001)。作为融合伴侣，DsRed通过基因手段与各种蛋白质连接，用于免疫检测试领域(Peipp,Saul et al.2004;Huang,Chen et al.2006)。而且由于它的四聚体的形式，该融合蛋白它会自动多聚化。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备多聚体荧光蛋白复合物的方法。
本发明所提供的制备多聚体荧光蛋白复合物的方法，为如下（1）或（2）：
（1）包括如下步骤：
Ⅰ、制备A片段，A片段为N端连接有2-7个甘氨酸的、可形成多聚体的荧光蛋白单体；
Ⅱ、制备B片段，B片段为C端连接有转肽酶的识别序列的、具有识别功能的蛋白；
Ⅲ、使A片段和B片段在转肽酶的作用下进行连接，得到所述荧光蛋白单体与所述具有识别功能的蛋白的复合物；
所述荧光蛋白单体与具有识别功能的蛋白的复合物为如下中的至少一种：由所述荧光蛋白单体组成的多聚体，该多聚体中有1个、2个、……、n个荧光蛋白单体均分别与一个所述具有识别功能的蛋白形成融合蛋白；所述n小于等于构成所述多聚体的荧光蛋白单体的数目；
（2）包括如下步骤：
Ⅰ、制备A片段，A片段为C端连接有转肽酶的识别序列的、可形成多聚体的荧光蛋白单体；
Ⅱ、制备B片段，B片段为N端连接有2-7个甘氨酸的、具有识别功能的蛋白；
Ⅲ、使A片段和B片段在转肽酶的作用下进行连接，得到所述荧光蛋白单体与所述具有识别功能的蛋白的复合物；
所述荧光蛋白单体与具有识别功能的蛋白的复合物为如下中的至少一种：由所述荧光蛋白单体组成的多聚体，该多聚体中有1个、2个、……、n个荧光蛋白单体均分别与一个所述具有识别功能的蛋白形成融合蛋白；所述n小于等于构成所述多聚体的荧光蛋白单体的数目。
上述方法中，所述使A片段和B片段在转肽酶的作用下进行连接的方法为：制备含有A片段、B片段和转肽酶的反应体系，将整个反应体系进行孵育。
上述方法中，所述孵育的温度为37℃，所述孵育的时间为2-3小时；
上述方法中，所述含有A片段、B片段和转肽酶的反应体系由所述A片段、所述B片段、所述转肽酶、氯化钠、氯化钙和Tris-HCl缓冲液组成，各种物质在反应体系中的浓度为：A片段1-50μM、具体为5μM，B片段10-500μM、具体为50μM，转肽酶1-50μM、具体为10μM，氯化钠1-500mM、具体为100mM，氯化钙1-100mM、具体为10mM。
上述方法中，所述反应体系的pH值为6.0-8.5、具体为7.5；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10-500mM、具体为300mM。
上述方法中，所述转肽酶的识别序列为LPETG；所述2-7个甘氨酸为3个甘氨酸；所述转肽酶为Sortase A，Sortase B或Sortase C，具体为编码基因序列为SEQ ID No.1所示的蛋白。
上述方法中，所述方法（1）中，所述融合蛋白从N端至C端的序列为：具有识别功能的蛋白-LPETGGG-可形成多聚体的荧光蛋白单体；所述方法（2）中，所述融合蛋白从N端至C端的序列为：可形成多聚体的荧光蛋白单体-LPETGGG-具有识别功能的蛋白。
上述方法中，制备A片段或制备B片段均可通过原核表达系统或真核表达系统实现，原核表达系统具体可为大肠杆菌原核表达系统，真核表达系统具体可为昆虫表达系统、哺乳动物细胞表达系统及酵母表达系统。
本发明中一个优选的方式为如下：
所述方法（1）中，所述A片段按照如下方法制备：将从N端至C端序列为转肽酶-LPETGGG的融合蛋白的编码基因插入带有His标签的重组表达质粒中，得到重组表达载体p-His-转肽酶-LPETGGG；将荧光蛋白单体的编码基因插在重组表达载体p-His-转肽酶-LPETGGG中LPETGGG的下游，得到重组表达载体p-His-转肽酶-LPETGGG-荧光蛋白单体；将重组表达载体p-His-转肽酶-LPETGGG-荧光蛋白单体导入大肠杆菌中，进行原核表达，纯化，得到从N端至C端序列为His-转肽酶-LPETGGG-荧光蛋白单体的融合蛋白；将从N端至C端序列为His-转肽酶-LPETGGG-荧光蛋白单体的融合蛋白用Tris-HCl缓冲液和氯化钙的混合溶液室温孵育，使得His-转肽酶-LPETGGG-荧光蛋白单体的融合蛋白断裂为序列为His-转肽酶-LPET的融合蛋白和序列为GGG-荧光蛋白单体的融合蛋白；用His标记蛋白纯化柱进行纯化，收集不带有His标签的物质，即得到从N端至C端序列为GGG-荧光蛋白单体的融合蛋白；Tris-HCl缓冲液和氯化钙的混合溶液中氯化钙的浓度为10mM；
所述方法（1）中，所述B片段按照如下方法制备：将从N端至C端序列为具有识别功能的蛋白-LPETG的融合蛋白的编码基因插入带有His标签的重组表达质粒中，得到重组表达载体p-具有识别功能的蛋白-LPETG-His；将p-具有识别功能的蛋白-LPETG-His导入大肠杆菌中，进行原核表达，纯化，得到从N端至C端序列为具有识别功能的蛋白-LPETG-His标签的融合蛋白；
所述方法（1）的步骤Ⅲ中，整个反应体系孵育完毕后，还包括如下步骤：用His标记蛋白纯化柱进行纯化，收集不带有His标签的物质，即为所述复合物和所述荧光蛋白单体的混合物；再进行蛋白凝胶电泳纯化，即得所述复合物。
上述方法中，所述可形成多聚体的荧光蛋白单体为GFP、DsRed或AzmGreen；所述具有识别功能的蛋白为完整抗体、单链抗体、单区抗体或抗体的Fc片段、受体、受体的配基或MHC复合物；
上述方法中，所述单区抗体具体为GPA7或EG2。
上述方法中，每个红色荧光蛋白DsRed单体的编码基因序列如SEQ ID No.5所示；
上述方法中，所述GPA7的编码基因序列如SEQ ID No.3中第1-375位核苷酸所示；
上述方法中，所述EG2的编码基因序列如SEQ ID No.4中第1-384位核苷酸所示；
由上述任一所述的方法得到的多聚体荧光蛋白复合物也属于本发明的保护范围。
由上述任一所述的方法得到的多聚体荧光蛋白复合物在用流式细胞仪分选表面呈现靶标蛋白的细胞中的应用也属于本发明的保护范围；所述靶标蛋白能与所述多聚体荧光蛋白复合物中的具有识别功能的蛋白相互作用；
由上述任一所述的方法得到的多聚体荧光蛋白复合物在作为流式细胞仪分析中的兼具标记和分选功能的试剂中的应用也属于本发明的保护范围。
实验证明，在SrtA的催化下，羧基端带有LPETG的单区抗体能位点特异性的和氨基端带有3个甘氨酸的DsRed耦合连接形成蛋白复合物。蛋白复合物保留了单区抗体的抗原识别特异性，并能染色表达该抗原的细胞。单区抗体和DsRed能在体外被耦合连接，连接产物在没有其他标记试剂的情况下，能直接用于一步染色，在FACS及其他领域有较强的应用价值。
利用多聚荧光蛋白的多聚性,将目的蛋白多聚化,提高目的蛋白对靶标蛋白的相应相互作用物(如单区抗体对抗原,配体对受体)的亲和力。利用靶标蛋白对目的蛋白的专一性和荧光蛋白能被检测的特点，快速一步地检测带有靶标蛋白的物质。
本发明还可用于不易表达的蛋白，将其分为两个片段在各自适应的条件下（不同的表达系统，表达条件）表达，形成有活性的蛋白后再通过SrtA偶联。本发明的偶联条件温和，不会对反应物活性产生影响。
附图说明
图1为制备融合蛋白过程中使用的各种蛋白的表达。A.sortase A(上)，SrtA-LPETGGG-DsRed（下）的示意图。B.GPA7-LPETG(左)和EG2-LPETG(右)的示意图。N和C分别表示氨基端和羧基端。Myc和His分别表示c-myc标记标签和多组氨酸纯化标签。C.纯化后蛋白的SDS-PAGE分析。SrtA（左）,GPA7-LPETG（中）,EG2-LPETG（右）。D.GGG-DsRed的SDS-PAGE分析。道1的样品上样前未煮，道2的样品上样前被煮过。
图2为SrtA催化的体外连接。
图3为使用SDS-PAGE分析反应。A.使用SrtA将GPA7-LPETG和G3-DsRed在体外偶联B.使用SrtA将EG2-GGGS-LPETG和G3-DsRed在体外偶联。在A和B中,上,样品被煮过;中,样品没有被煮过;下,样品没有被煮过，胶直接在紫外下拍照，没有被染色。每列下的数字表示取样的时间。
图4为蛋白复合物的纯化。A,蛋白复合物GPA7-DsRed；B,蛋白复合物EG2-GGGS-DsRed。上:蛋白复合物的示意图;中:产物的色谱图.下:纯化后产物的SDS-PAGE分析.在A和B中未煮的样品在左边煮过的样品在右边。道1表示反应前的反应混合物，道2表示反应后纯化前的混合物，道3表示纯化后的样品。
图5为纯化产物的功能分析。A.蛋白复合物GP100-DsRed识别HLA-A2/gp100多肽复合物。左图为带有多肽gp100215E(IMDQVPESV)的T2细胞，右图为带有多肽MART-127L(ELAGIGILTV)的T2细胞。B.蛋白复合物EG2-GGGS-DsRed识别表皮生长因子（EGFR）。虚线表示蛋白复合物EG2-LPETG-DsRed,实线表示蛋白复合物GP100-DsRed，阴影表示作为阴性对照的G3-DsRed。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、蛋白复合物的制备
一、各种蛋白及其编码基因的序列
SortaseA的编码基因：SEQ ID No.1。
SortaseA-LPETGGG的编码基因：SEQ ID No.2。
DsRed的编码基因：SEQ ID No.5。
GPA7-LPETG的编码基因：SEQ ID No.3。
EG2-GGGS-LPETG的编码基因：SEQ ID No.4。
二、表达载体及重组菌的构建
（1）His-SortaseA的表达载体构建：
将SortaseA的编码基因（SEQ ID No.1）通过NdeI和XhoI酶切位点，连接入质粒pET28中，得到重组表达载体pET28-His-SortaseA。（质粒pET28本身就有His标签序列，表达出His-SortaseA融合蛋白，SortaseA的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示）。
（2）His-SortaseA-LPETGGG-DsRed的表达载体构建：
将SortaseA-LPETGGG的编码基因（SEQ ID No.2）通过NdeI和BamHI酶切位点，插入pET28中，得到重组表达载体pET28-His-SortaseA-LPETGGG；将DsRed的编码基因（SEQ ID No.5）通过BamHI和XhoI酶切位点，插入pET28-His-SortaseA-LPETGGG中，得到重组表达载体pET28-His-SortaseA-LPETGGG-DsRed。（质粒pET28本身就有His标签序列，表达出His-SortaseA-LPETGGG-DsRed融合蛋白）
（3）GPA7-LPETG-myc-His的表达载体构建：
质粒pVT2在文献“Zhu,X.,L.Wang,et al.(2010)."COMBODY:one-domainantibody multimer with improved avidity."Immunol Cell Biol88(6):667-675.”中公开过，公众可从南通表源生物技术有限公司或中国科学院微生物研究所得到。
将GPA7-LPETG的编码基因（SEQ ID No.3）通过BbsI和BamHI插入质粒pVT-2中，得到重组表达载体pVT-GPA7-LPETG-myc-His。（质粒pVT-2本身含有“myc-His”标签序列，表达出GPA7-LPETG-myc-His融合蛋白）
（4）EG2-GGGS-LPETG-His的表达载体构建：
将EG2-GGGS-LPETG的编码基因（SEQ ID No.4）通过NdeI和XhoI插入质粒pET30a(+)中，得到重组表达载体pET-EG2-GGGS-LPETG-His。（质粒pET30a(+)本身含有His标签，表达出EG2-GGGS-LPETG-His融合蛋白）
将pET28-His-SortaseA、pET28-His-SortaseA-LPETGGG-DsRed和pET-EG2-GGGS-LPETG-His分别转入大肠杆菌BL21，得到重组菌。
将pVT-GPA7-LPETG-myc-His转入大肠杆菌TG1，得到重组菌。
三、用重组菌表达和纯化各种蛋白
（1）表达方法：将重组菌株分别接种到含抗生素的LB中，37℃、220rpm培养。当其OD600为0.6时，加入IPTG（终浓度1mM）诱导。重组BL21菌株37℃过夜培养，重组TG1菌株24℃培养22小时。6000rpm收菌。
（2）His-SortaseA、EG2-GGGS-LPETG-His、GPA7-LPETG-myc-His的纯化方法如下：
用结合缓冲液（pH为7.4、氯化钠浓度为500mM的PBS）重悬菌体，加入5mg的溶菌酶室温30分钟破菌。用超声破碎仪进一步破碎细菌。待菌液不再粘稠时转移至离心管，12000rpm离心20分钟，将上清转移到新的离心管，14000rpm离心20分钟。用孔径为22微米的滤器过滤离心后的上清。按操作指示使用偶联镍的亲和层析柱(GEHealthcare Bio-Sciences AB,Uppsala,Sweden)纯化上清中含有的目的蛋白，然后再用SuperdexTM200尺寸排阻色谱在AKTA purifier2000系统(GE healthcareBio-Science AB)中进一步纯化蛋白。
（3）纯化His-SortaseA-LPETGGG-DsRed获得G3-DsRed蛋白的方法如下：
用结合缓冲液（pH为7.4、氯化钠浓度为500mM的PBS）重悬含有His-SortaseA-LPETGGG-DsRed的菌体，加入5mg的溶菌酶室温30分钟破菌。用超声破碎仪进一步破碎细菌。待菌液不再粘稠时转移至离心管，12000rpm离心20分钟，将上清转移到新的离心管，14000rpm离心20分钟。用孔径为22微米的滤器过滤离心后的上清。将离心过滤后的上清通过偶联镍的亲和层析柱(GE HealthcareBio-Sciences AB,Uppsala,Sweden)，然后用PB缓冲液洗去杂蛋白。向层析柱中加入Tris-HCl缓冲液，另加入氯化钙，终浓度10mM，室温放置1小时，His-SortaseA-LPETGGG-DsRed断裂为His-SortaseA-LPET和G3-DsRed。使用Tris-HCl缓冲液将断裂的G3-DsRed洗下。再使用SuperdexTM200尺寸排阻色谱在AKTA purifier2000系统(GE healthcare Bio-Science AB)中进一步纯化蛋白，因为在反应混合物中只有G3-DsRed没有带有多组氨酸纯化标签，所以洗脱下来的都是G3-DsRed，得到G3-DsRed蛋白。
煮过的样品和未煮过的样品分别在不同的SDS-PAGE凝胶上上样。
各种蛋白的表达纯化结果如图1C和D所示。结果表明，成功得到蛋白His-SortaseA、EG2-GGGS-LPETG-His、GPA7-LPETG-myc-His和G3-DsRed。
图1C都带有标签,图1D因为DsRed来自His-SrtA-LPETGGG-DsRed,标签随着His-SrtA-LPET的切除而去掉。
“煮过”与“未煮过”：是指蛋白样品加入G250后,一部分放到沸腾的水浴锅中煮5分钟,另一部份不煮,分别上样.煮过的样品DsRed多聚体解聚,变为单体,未煮的样品DsRed仍为多聚状态,这在图一中体现出来。
四、融合复合物的制备
（一）制备
实验组：
反应体系：由荧光蛋白单体G3-DsRed、GPA7-LPETG-myc-His或EG2-GGGS-LPETG-His、His-SortaseA(srtA把EG2-GGGS-LPETG-His切开，形成的EG2-GGGS-LPET与G3-DsRed连接)、氯化钠、氯化钙和Tris-HCl缓冲液组成；各种物质在体系中的浓度为：G3-DsRed5μM、GPA7-LPETG或EG2-GGGS-LPETG50μM、SortaseA10μM、氯化钠100mM、氯化钙10mM；所述体系的pH值为7.5；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为300mM。
反应条件：37℃进行2h或3h（GPA7-LPETG时需要3h；EG2-GGGS-LPETG时需要2h）。用SDS-PAGE上样缓冲液混合来停止反应。
对照组：除了不加一种或几种物质外（具体请见图2），其余均与实验组相同。
（二）纯化
在AKTA purifier2000系统中依次连接HisTrapTM的HP1毫升柱（GE healthcareBio-Science1AB）和SuperdexTM200尺寸排阻层析柱。将步骤（一）中每组反应产物注入到AKTA purifier2000系统。注入的样品首先通过HisTrapTM的HP1毫升柱，然后通过SuperdexTM200尺寸排阻层析柱。最高峰的洗脱液被收集，浓缩，得到纯化样品。因为在反应混合物中只有产物和G3-DsRed没有带有多组氨酸纯化标签，所以洗脱下来的都是产物和G3-DsRed。
反应前样品、反应后纯化前样品和纯化后样品一起跑蛋白凝胶。煮过的样品和未煮过的样品分别在不同的SDS-PAGE凝胶上上样。在凝胶中所有的蛋白质用考马斯亮蓝250染色。“煮过”与“未煮过”：是指蛋白样品加入G250后,一部分放到沸腾的水浴锅中煮5分钟,另一部份不煮,分别上样.煮过的样品DsRed多聚体解聚,变为单体,未煮的样品DsRed仍为多聚状态,这在图一中体现出来。
结果如图2所示。在G3-DsRed不存在的情况下将GPA7-LPETG和SortaseA混合,一条新的带在稍高于35KDa的地方出现，它对应的是酰基酶中间物。当所有的底物被混合时，两条新的带出现，其中一条是酰基酶中间物，另一条在35KDa到45KDa之间其大小与GPA7-LPETG和DsRed单体形成的共轭连接产物大小相当。在样品没有被煮过的情况下，当所有底物和酶被混合时除了形成酰基酶中间物外还会形成多条新带，这表明一个或多个GPA7-LPETG连接到DsRed四聚体上。SDS-PAGE的结果展示了通过SortaseA能将GPA7-LPETG和G3-DsRed成功的偶联在一起。同样的，另一个不同的单区抗体EG2-GGGS-LPETG通过SortaseA成功的共轭偶联到G3-DsRed上。
（三）去不同反应时间点的产物进行纯化和检测
进一步展示用SortaseA在体外成功的将GPA7-LPETG或EG2-GGGS-LPETG和G3-DsRed共轭偶联，不同时间点的反应混合物被取出检测。因为DsRed和DsRed耦合物都能自发光，所以未染色的胶能直接在紫外下检测。结果如图3所示，在SortaseA的存在下GPA7-LPETG或EG2-GGGS-LPETG能够与G3-DsRed耦合。同时结果反应了G3-DsRed四聚体与1、2、3或4个GPA7-LPETG或EG2-GGGS-LPETG耦合而形成不完整的或完整的四聚单区抗体-DsRed耦合物。
图4底部显示，与反应前反应混合物、反应后纯化前混合物相比，纯化后反应物中的酰基酶中间物，SortaseA和单区抗体GPA7-LPETG或EG2-GGGS-LPETG都被除去。
以上结果表明，本发明制备得到的蛋白复合物如下：
G3-DsRed与GPA7-LPETG形成的蛋白复合物为如下四种四聚体的混合物：
（1）四聚体1，为由G3-DsRed形成的四聚体，其中每个G3-DsRed均分别与一个GPA7-LPETG形成融合蛋白，每个融合蛋白从N端到C端的序列为GPA7-LPETGGG-DsRed；
（2）四聚体2，为由G3-DsRed形成的四聚体，其中三个G3-DsRed均分别与一个GPA7-LPETG形成融合蛋白，每个融合蛋白从N端到C端的序列为GPA7-LPETGGG-DsRed；
（3）四聚体3，为由G3-DsRed形成的四聚体，其中两个G3-DsRed均分别与一个GPA7-LPETG形成融合蛋白，每个融合蛋白从N端到C端的序列为GPA7-LPETGGG-DsRed；
（4）四聚体4，为由G3-DsRed形成的四聚体，其中一个G3-DsRed均与一个GPA7-LPETG形成融合蛋白，融合蛋白从N端到C端的序列为GPA7-LPETGGG-DsRed。
G3-DsRed与EG2-GGGS-LPETG形成的蛋白复合物为如下四种四聚体的混合物：
（1）四聚体1，为由G3-DsRed形成的四聚体，其中每个G3-DsRed均分别与一个EG2-GGGS-LPETG形成融合蛋白，每个融合蛋白从N端到C端的序列为EG2-GGGS-LPETGGG-DsRed；
（2）四聚体2，为由G3-DsRed形成的四聚体，其中三个G3-DsRed均分别与一个EG2-GGGS-LPETG形成融合蛋白，每个融合蛋白从N端到C端的序列为EG2-GGGS-LPETGGG-DsRed；
（3）四聚体3，为由G3-DsRed形成的四聚体，其中两个G3-DsRed均分别与一个EG2-GGGS-LPETG形成融合蛋白，每个融合蛋白从N端到C端的序列为EG2-GGGS-LPETGGG-DsRed；
（4）四聚体4，为由G3-DsRed形成的四聚体，其中一个G3-DsRed均与一个EG2-GGGS-LPETG形成融合蛋白，融合蛋白从N端到C端的序列为EG2-GGGS-LPETGGG-DsRed。
实施例2、蛋白复合物的应用
T细胞受体样的单区抗体GPA7特异性识别多肽gp100215E(IMDQVPESV)与人白细胞抗原HLA-A2的复合物。单区抗体EG2识别表皮生长因子受体（EGFR）的胞外段。
多肽gp100215E(IMDQVPESV)和多肽MART-127L(ELAGIGILTV)由SBS Genetech Co,Beijing,China.合成。RPMI1640培养基购自Hyclone Laboratories,Logan,UT,USA。
HLA-A2+TAP-缺陷T2细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基37℃培养。1×106个T2细胞在培养基中分别与20μM多肽gp100215E(IMDQVPESV)或多肽MART-127L(ELAGIGILTV)混和4小时。
A431细胞和293T细胞分别用含有10%胎牛血清的DMEM培养基37℃培养。
结合多肽的T2细胞、A431细胞、293T细胞被PBS洗涤和重悬。每种细胞均与10μg的纯化产物共孵育30分钟。然后细胞被PBS洗涤，重悬，并用Guava EasyCyte流式细胞仪(Guava Technologies,Hayward,CA,USA)分析。所有数据都用FlowJo software(Tree Star,Ashland,OR,USA)分析。以未反应的G3-DsRed作为阴性对照。
结果如图5所示。图5A左显示，GPA7与DsRed形成的蛋白复合物能识别带有gp100215E(IMDQVPESV)多肽的T2细胞，而阴性对照G3-DsRed不能。EG2与DsRed形成的蛋白复合物也不能识别带有gp100215E(IMDQVPESV)多肽的T2细胞。图5A右显示，无论是GPA7与DsRed形成的蛋白复合物还是EG2与DsRed形成的蛋白复合物，都和阴性对照G3-DsRed一样，不能识别带有多肽MART-127L(ELAGIGILTV)的T2细胞。图5B左显示，EG2与DsRed形成的蛋白复合物能够识别表面表达EGFR的A431细胞，而GPA7与DsRed形成的蛋白复合物和阴性对照G3-DsRed都不能。图5B右显示，对于293T细胞，无论是EG2与DsRed形成的蛋白复合物还是GPA7与DsRed形成的蛋白复合物，都和阴性对照G3-DsRed一样，都不能识别。
实验证明，在SrtA的催化下，羧基端带有LPETG的单区抗体能位点特异性的和氨基端带有3个甘氨酸的DsRed耦合连接形成蛋白复合物。蛋白复合物保留了单区抗体的抗原识别特异性，并能染色表达该抗原的细胞。单区抗体和DsRed能在体外被耦合连接，连接产物在没有其他标记试剂的情况下，能直接用于一步染色，在FACS及其他领域有较强的应用价值。
Claims (10)
1.一种制备多聚体荧光蛋白复合物的方法，为如下（1）或（2）：
（1）包括如下步骤：
Ⅰ、制备A片段，A片段为N端连接有2-7个甘氨酸的、可形成多聚体的荧光蛋白单体；
Ⅱ、制备B片段，B片段为C端连接有转肽酶的识别序列的、具有识别功能的蛋白；
Ⅲ、使A片段和B片段在转肽酶的作用下进行连接，得到所述荧光蛋白单体与所述具有识别功能的蛋白的复合物；
所述荧光蛋白单体与具有识别功能的蛋白的复合物为如下中的至少一种：由所述荧光蛋白单体组成的多聚体，该多聚体中有1个、2个、……、n个荧光蛋白单体均分别与一个所述具有识别功能的蛋白形成融合蛋白；所述n小于等于构成所述多聚体的荧光蛋白单体的数目；
（2）包括如下步骤：
Ⅰ、制备A片段，A片段为C端连接有转肽酶的识别序列的、可形成多聚体的荧光蛋白单体；
Ⅱ、制备B片段，B片段为N端连接有2-7个甘氨酸的、具有识别功能的蛋白；
Ⅲ、使A片段和B片段在转肽酶的作用下进行连接，得到所述荧光蛋白单体与所述具有识别功能的蛋白的复合物；
所述荧光蛋白单体与具有识别功能的蛋白的复合物为如下中的至少一种：由所述荧光蛋白单体组成的多聚体，该多聚体中有1个、2个、……、n个荧光蛋白单体均分别与一个所述具有识别功能的蛋白形成融合蛋白；所述n小于等于构成所述多聚体的荧光蛋白单体的数目。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述使A片段和B片段在转肽酶的作用下进行连接的方法为：制备含有A片段、B片段和转肽酶的反应体系，将整个反应体系进行孵育。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含有A片段、B片段和转肽酶的反应体系由所述A片段、所述B片段、所述转肽酶、氯化钠、氯化钙和Tris-HCl缓冲液组成。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述转肽酶的识别序列为LPETG；所述转肽酶为Sortase A，Sortase B或Sortase C，具体为编码基因序列为SEQ ID No.1所示的蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法（1）中，所述融合蛋白从N端至C端的序列为：具有识别功能的蛋白-LPETGGG-可形成多聚体的荧光蛋白单体；所述方法（2）中，所述融合蛋白从N端至C端的序列为：可形成多聚体的荧光蛋白单体-LPETGGG-具有识别功能的蛋白。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：
所述方法（1）中，所述A片段按照如下方法制备：将从N端至C端序列为转肽酶-LPETGGG的融合蛋白的编码基因插入带有His标签的重组表达质粒中，得到重组表达载体p-His-转肽酶-LPETGGG；将荧光蛋白单体的编码基因插在重组表达载体p-His-转肽酶-LPETGGG中LPETGGG的下游，得到重组表达载体p-His-转肽酶-LPETGGG-荧光蛋白单体；将重组表达载体p-His-转肽酶-LPETGGG-荧光蛋白单体导入大肠杆菌中，进行原核表达，纯化，得到从N端至C端序列为His-转肽酶-LPETGGG-荧光蛋白单体的融合蛋白；将从N端至C端序列为His-转肽酶-LPETGGG-荧光蛋白单体的融合蛋白用Tris-HCl缓冲液和氯化钙的混合溶液室温孵育，使得His-转肽酶-LPETGGG-荧光蛋白单体的融合蛋白断裂为序列为His-转肽酶-LPET的融合蛋白和序列为GGG-荧光蛋白单体的融合蛋白；用His标记蛋白纯化柱进行纯化，收集不带有His标签的物质，即得到从N端至C端序列为GGG-荧光蛋白单体的融合蛋白；
所述方法（1）中，所述B片段按照如下方法制备：将从N端至C端序列为具有识别功能的蛋白-LPETG的融合蛋白的编码基因插入带有His标签的重组表达质粒中，得到重组表达载体p-具有识别功能的蛋白-LPETG-His；将p-具有识别功能的蛋白-LPETG-His导入大肠杆菌中，进行原核表达，纯化，得到从N端至C端序列为具有识别功能的蛋白-LPETG-His标签的融合蛋白；
所述方法（1）的步骤Ⅲ中，整个反应体系孵育完毕后，还包括如下步骤：用His标记蛋白纯化柱进行纯化，收集不带有His标签的物质，即为所述复合物和所述荧光蛋白单体的混合物；再进行蛋白凝胶电泳纯化，即得所述复合物。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述可形成多聚体的荧光蛋白单体为GFP、DsRed或AzmGreen；所述具有识别功能的蛋白为完整抗体、单链抗体、单区抗体或抗体的Fc片段、受体、受体的配基或MHC复合物；
所述单区抗体具体为GPA7或EG2。
8.由权利要求1-7任一所述的方法得到的多聚体荧光蛋白复合物。
9.权利要求8所述的多聚体荧光蛋白复合物在用流式细胞仪分选表面呈现靶标蛋白的细胞中的应用；所述靶标蛋白能与所述多聚体荧光蛋白复合物中的具有识别功能的蛋白相互作用；
10.权利要求8所述的多聚体荧光蛋白复合物在作为流式细胞仪分析中的兼具标记和分选功能的试剂中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410054047.6A CN104844711B (zh) | 2014-02-18 | 2014-02-18 | 一种多聚体荧光蛋白复合物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410054047.6A CN104844711B (zh) | 2014-02-18 | 2014-02-18 | 一种多聚体荧光蛋白复合物及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104844711A true CN104844711A (zh) | 2015-08-19 |
| CN104844711B CN104844711B (zh) | 2018-07-06 |
Family
ID=53844735
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410054047.6A Active CN104844711B (zh) | 2014-02-18 | 2014-02-18 | 一种多聚体荧光蛋白复合物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104844711B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013003555A1 (en) * | 2011-06-28 | 2013-01-03 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Using sortases to install click chemistry handles for protein ligation |
| CN103298935A (zh) * | 2007-08-15 | 2013-09-11 | 阿穆尼克斯公司 | 用于改善生物活性多肽性能的组合物和方法 |
| WO2014001325A1 (en) * | 2012-06-27 | 2014-01-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof |
-
2014
- 2014-02-18 CN CN201410054047.6A patent/CN104844711B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103298935A (zh) * | 2007-08-15 | 2013-09-11 | 阿穆尼克斯公司 | 用于改善生物活性多肽性能的组合物和方法 |
| WO2013003555A1 (en) * | 2011-06-28 | 2013-01-03 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Using sortases to install click chemistry handles for protein ligation |
| WO2014001325A1 (en) * | 2012-06-27 | 2014-01-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DAVID A ET AL: "Protein-Protein Fusion Catalyzed by Sortase A", 《PLOS ONE》 * |
| LILYAN CHAN: "Covalent Attachment of Proteins to Solid Supports and Surfaces via Sortase-Mediated Ligation", 《PLOS ONE》 * |
| MARTIN D. WITTE: "reparation of unnatural N-to-N and C-to-C protein fusions", 《PNAS》 * |
| PEI XIONG LIEW: "Functional Characterization and Localization of a Bacillus subtilis Sortase and Its Substrate and Use of This Sortase System To Covalently Anchor a Heterologous Protein to the B. subtilis Cell Wall for Surface Display", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104844711B (zh) | 2018-07-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Esposito et al. | Optimizing high-yield production of SARS-CoV-2 soluble spike trimers for serology assays | |
| US10584152B2 (en) | Binding proteins based on di-ubiquitin muteins and methods for generation | |
| Wuethrich et al. | Site-specific chemoenzymatic labeling of aerolysin enables the identification of new aerolysin receptors | |
| NO2007013I1 (no) | Abatacept Fusjonsprotein som produsert ved rekombinant DNA teknologi i kinesisk hamster ovarie celler Et fusjonsprot som bestar av den ekstracellulaere domenen av humant CTLA-4 koblet til en modifisert Fc del av humant immunoglobulin G1 | |
| Toughiri et al. | Comparing domain interactions within antibody Fabs with kappa and lambda light chains | |
| Al-Homsi et al. | Construction of pRSET-sfGFP plasmid for fusion-protein expression, purification and detection | |
| CN105018552B (zh) | 一种大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法 | |
| CN105543234A (zh) | 一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素ssd609的方法 | |
| CN102295702A (zh) | 一种针对t细胞受体可变区特异性单抗的制备方法 | |
| Nguyen et al. | Prokaryotic expression of chimeric GFP-hFc protein as a potential immune-based tool | |
| CN103772501A (zh) | Vegf抗体及其制备方法和用途 | |
| CN104844711A (zh) | 一种多聚体荧光蛋白复合物及其应用 | |
| Sørensen et al. | Identification of protein-protein interfaces implicated in CD80-CD28 costimulatory signaling | |
| Aliprandi et al. | The availability of a recombinant anti-SNAP antibody in VHH format amplifies the application flexibility of SNAP-tagged proteins | |
| AU2008255631B2 (en) | Fluorescent protein particles | |
| US20220411472A1 (en) | Self-assembling circular tandem repeat proteins with increased stability | |
| JP6425327B2 (ja) | タンパク質−磁性粒子複合体及びその製造方法 | |
| JP6744670B2 (ja) | タグ付抗体 | |
| WO2015190262A1 (ja) | タグ付抗体 | |
| CN102827292B (zh) | 一种融合蛋白TgMEP及其制备方法和应用 | |
| JP6574033B2 (ja) | Ｗｎｔ蛋白質の製造方法および保存方法 | |
| CN103848888B (zh) | 一种人补体C1q/TNFα相关蛋白‑2（hCTRP2）的抗原肽及其抗体 | |
| JP2018515126A (ja) | 抗原提示タンパク質と関連する方法及び組成物 | |
| CN109293739B (zh) | 一种a3超家族通用肿瘤抗原多肽及其应用 | |
| CN105296478A (zh) | 一种多标签抗原及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240325 Address after: No. 18 Xingtai Road, Gangzha Development Zone, Nantong City, Jiangsu Province, 226005 Patentee after: NANTONG BIAOYUAN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Country or region after: China Address before: No. 18 Xingtai Road, Gangzha Development Zone, Nantong City, Jiangsu Province, 226000 Patentee before: NANTONG BIAOYUAN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Country or region before: China Patentee before: ZHONGKE MICROORGANISM IMMUNE AGENTS ENGINEERING CENTER |
|
| TR01 | Transfer of patent right |