CN104844650B - 季鏻盐修饰树枝状分子的制备及应用 - Google Patents
季鏻盐修饰树枝状分子的制备及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104844650B CN104844650B CN201510288076.3A CN201510288076A CN104844650B CN 104844650 B CN104844650 B CN 104844650B CN 201510288076 A CN201510288076 A CN 201510288076A CN 104844650 B CN104844650 B CN 104844650B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- quaternary alkylphosphonium
- added
- dendrimer
- hours
- alkylphosphonium salt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明属于生物材料技术领域,具体涉及季鏻盐修饰树枝状分子的制备及应用。本发明提供了一种季鏻盐及其制备方法,季鏻盐的结构如式Ⅰ或Ⅱ所示:本发明还提供了采用所述季鏻盐修饰树枝状分子的方法。本发明的季鏻盐能对树枝状分子进行修饰。修饰后的树枝状分子可用作转基因载体,可有效包裹DNA,高效传递到细胞核中,且生物兼容性很好。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域,具体涉及季鏻盐修饰树枝状分子的制备及应用。
背景技术
基因治疗作为一种极富潜力的用于替代传统化学疗法的方法,为先天遗传性疾病和严重后天获得性疾病的治疗提供了一条富有前景的新途径,是现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术。如何使治疗基因进入特定细胞并得到高效表达,显然是基因治疗的重点问题。由于自由的寡核苷酸或是DNA在血液中受血清核酸酶的作用会迅速被降解,因此,基因治疗研究的很大一部分精力,被投入到设计、合成能够将治疗基因高效率传输到胞(核)内并进行表达的基因载体上。基因载体的作用包括:一、包裹DNA使其免于在血液中被降解;二、可与DNA自组装对其压缩形成合适大小和表面电位的纳米级复合物颗粒,从而可以顺利的进入细胞;三、一些特殊结构可促进复合物从内涵体中释放、载体与DNA的解离、以及细胞核的定位等。人们最初研究的基因载体主要是一些病毒载体,如逆转录病毒、腺病毒及单纯疱疹病毒等。虽然这些载体显示了很好的转染效率,但是普遍存在制备困难、目的基因插入长度受限以及潜在的免疫反应和生物安全等问题。而非病毒载体大多制作简单,免疫反应低,不与宿主基因组整合,可重复应用,克隆能力不受限,其独具的优点正吸引越来越多的研究注意。非病毒载体主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物,人们通过对其结构的目的性修饰,从而克服基因传递中可能遇到的胞外和胞内阻碍。虽然人们已经发展了多种阳离子脂质体或聚合物非病毒基因载体,但就目前而言,一个很大的困难在于对载体/DNA复合物的胞内传输机理以及载体结构-活性关系的认识仍然缺乏。大多数的合成载体和病毒载体的效率相比,表现出了数量级的劣势。因此,设计合成新型的具有高转染率和低毒性的基因载体,探寻其构效关系并对结构进行调节优化,以期得到满意的基因载体仍具有特殊重要的意义。
树枝状分子作为一种重要的具有多种化学生物学特性的分子,在很多方面都得到大量的应用。作为一类重要的基因载体,研究人员对聚酰胺胺树枝装分子(PAMAM)等树枝型载体进行了大量的研究,但树枝型载体因其复杂多变的结构仍留给从事有机合成的科研人员极大的开发空间。
上述基于树枝状分子的含季鏻盐非病毒基因载体的研究,可望获得具有创新性的系列研究成果。高转染效率和低毒性的新型非病毒基因载体将为探讨某些生命过程及其调控作用提供新途径和新方法,可为直接研究基因治疗的过程及其传输机制提供有效的信息和手段。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种树枝状分子作为转基因载体使用。
本发明首先提供了一种季鏻盐,其结构如式Ⅰ或Ⅱ所示:
其中n=1、2或3;其中,R为CH3(CH2)xCH2或HOCH2(CH2)yCH2;x=2、3、4、5、6、7或8,y=2、3、4、5、6、7或8。
优选的,所述的R为CH3(CH2)2CH2或HOCH2(CH2)2CH2。
本发明还提供了磷原子连接在烷基链上的季鏻盐的制备方法,即式Ⅰ所示的结构化合物,其特征在于:包括如下步骤:
将烷基膦化物与等摩尔量的溴代烷基酸加入到反应瓶中,加入乙腈或DMF后,在氮气或氩气保护下,加热至80℃~120℃,反应10~48小时;反应结束后,旋蒸除去溶剂,加入过量乙醚析出目标产物,反复沉淀多次后,收集目标产物,真空干燥;具体反应如下列方程所示:
n=1、2或3
CH3(CH2)xCH2,HOCH2(CH2)yCH2
X=2、3、4、5、6、7或8;
Y=2、3、4、5、6、7或8
本发明还提供了磷原子连接在苯环上的季鏻盐的制备方法,即式II所示的结构,其特征在于:包括如下步骤:
将烷基膦化物与等摩尔量的对溴苯甲酸,反应物摩尔量1~3%的无水溴化镍加入到反应瓶中,通入Ar气保护,加热温度到120℃~170℃,搅拌10~48小时,停止反应后加入氯仿,过滤掉副产物,用44%HBr溶液洗涤有机相3次,直至体系呈淡黄色;分液出去水相,有机相用无水硫酸钠干燥,加入过量环己烷沉淀,丙酮重结晶后60℃真空干燥;具体反应如下列方程所示:
CH3(CH2)xCH2,HOCH2(CH2)yCH2
X=2、3、4、5、6、7或8;
Y=2、3、4、5、6、7或8
本发明还提供了季鏻盐修饰树枝状分子的方法,包括如下步骤:将季鏻盐、N-羟基琥珀酸亚胺NHS与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl三者等摩尔量混合,加入DMSO作为溶剂,反应24小时;反应结束后,将反应体系加入到树枝状分子的水溶液中,反应48小时后,用截留分子量为14000的透析袋透析,冻干后得产品;季鏻盐与树枝状分子的摩尔比例为10︰1~60︰1。
具体的,所述的树枝状分子为4代、5代L-赖氨酸树枝状分子,或4代、5代聚酰胺胺树枝状分子。
具体的,季鏻盐与树枝状分子的摩尔比例为12︰1~60︰1。
本发明还提到了所季鏻盐修饰得到的树枝状分子在制备转基因载体中的用途。
本发明的有益效果:本发明提供了一大类新的季鏻盐,能对树枝状分子进行修饰。修饰后的树枝状分子可用作转基因载体,可有效包裹DNA,高效传递到细胞核中,且生物兼容性很好。
附图说明
图1、三辛基对羧基苯基溴化季鏻盐核磁图。
图2、三丁基(5-戊酸基)溴化季鏻盐质谱图。
图3、三苯基(对羧基苯基)溴化季鏻以摩尔比12︰1修饰4代PAMAM(聚酰胺-胺型树枝状高分子)树枝状分子的凝胶渗透色谱分子量图谱。
图4、三苯基(对羧基苯基)溴化季鏻以摩尔比23︰1修饰4代PAMAM树枝状分子的GPC图谱。
图5、4代的聚酰胺胺树枝状分子修饰三苯基(对羧基苯基)季鏻盐的目标产物结构。
图6、不同修饰比例的树枝状载体对Hela细胞的转染效果图,SuperFect与Lipo2000作为对照;纵坐标为流式细胞仪测得的转染细胞呈阳性的比例;G4,G4-TPP12,G4-TPP23与G5-TPP35表示在最佳N/P比12︰1,28︰1,24︰1与16︰1时的转染效果。
图7、不同修饰比例的树枝状载体对COS-7细胞的转染效果图,SuperFect与Lipo2000作为对照;纵坐标为流式细胞仪测得的转染细胞呈阳性的比例;G4,G4-TPP12,G4-TPP23与G5-TPP35表示在最佳N/P比12︰1,32︰1,28︰1与12︰1时的转染效果。
具体实施方式
实施例1制备如下结构式的季鏻盐
三丁基膦(3.70g,18.30mmol)与对溴苯甲酸(3.74g,18.61mmol)加入到100mL烧瓶中,再加入溴化镍(0.02g,0.01mmol)。在加热之前,用氩气拍空气30分钟,反应加热至170℃,反应13.5小时。反应结束后,加入氯仿100mL,过滤除去副产物。反应体系用44%的HBr洗涤3次,有机相用无水硫酸钠干燥,加入100ml环己烷,产品用丙酮重结晶,真空干燥过夜。产率为72%。m/z(+快原子轰击FAB,100%M+)323.22。
实施例2制备如下结构式的季鏻盐
三戊基膦(2.44g,10mmol)与对溴苯甲酸(2.00g,10mmol)加入到100mL烧瓶中,再加入溴化镍(0.02g,0.01mmol)。在加热之前,用氩气拍空气30分钟,反应加热至150℃,反应12小时。反应结束后,加入氯仿100mL,过滤除去副产物。反应体系用44%的HBr洗涤3次,有机相用无水硫酸钠干燥,加入100ml环己烷,产品用丙酮重结晶,真空干燥过夜。产率为70%。m/z(+FAB,100%M+)365.41。
实施例3制备如下结构式的季鏻盐
三己基膦(2.86g,10mmol)与对溴苯甲酸(2.00g,10mmol)加入到100mL烧瓶中,再加入溴化镍(0.21g,0.92mmol)。在加热之前,用氩气拍空气30分钟,反应加热至170℃,反应13.5小时。反应结束后,加入氯仿100mL,过滤除去副产物。反应体系用44%的HBr洗涤3次,有机相用无水硫酸钠干燥,加入100ml环己烷,产品用丙酮重结晶,真空干燥过夜。产率为70%。m/z(+FAB,100%M+)407.30。
实施例4制备如下结构式的季鏻盐
三庚基膦(3.28g,10mmol)与对溴苯甲酸(2.22g,11.1mmol)加入到100ml烧瓶中,再加入溴化镍(0.20g,1.0mmol)。在加热之前,用氩气拍空气30分钟,反应加热至150℃,反应12小时。反应结束后,加入氯仿100mL,过滤除去副产物。反应体系用44%的HBr洗涤3次,有机相用无水硫酸钠干燥,加入600ml环己烷,产品用丙酮重结晶,真空干燥过夜。产率为80%。m/z(+FAB,100%M+)449.52。
实施例5制备如下结构式的季鏻盐
三辛基膦(39.7g,107.2mmol)与对溴苯甲酸(21.2g,105.6mmol)加入到100ml烧瓶中,再加入溴化镍(2.00g,9.15mmol)。在加热之前,用氩气拍空气30分钟,反应加热至170℃,反应13.5小时。反应结束后,加入氯仿100mL,过滤除去副产物。反应体系用44%的HBr洗涤3次,有机相用无水硫酸钠干燥,加入600ml环己烷,产品用丙酮重结晶,真空干燥过夜。产率为70%。通过核磁辨明结构,核磁图谱如图1所示。m/z(+FAB,100%M+)491.52。
实施例6制备如下结构式的季鏻盐
三壬基膦(44.2g,106.1mmol)与对溴苯甲酸(21.2g,105.6mmol)加入到100ml烧瓶中,再加入溴化镍(2.00g,9.15mmol)。在加热之前,用氩气拍空气30分钟,反应加热至170℃,反应13.5小时。反应结束后,加入氯仿100mL,过滤除去副产物。反应体系用44%的HBr洗涤3次,有机相用无水硫酸钠干燥,加入600ml环己烷,产品用丙酮重结晶,真空干燥过夜。产率为65%。m/z(+FAB,100%M+)533.49。
实施例7制备如下结构式的季鏻盐
三癸基膦(50.0g,107.2mmol)与对溴苯甲酸(22.2g,107.0mmol)加入到100ml烧瓶中,再加入溴化镍(2.00g,9.15mmol)。在加热之前,用氩气拍空气30分钟,反应加热至170℃,反应13.5小时。反应结束后,加入氯仿100mL,过滤除去副产物。反应体系用44%的HBr洗涤3次,有机相用无水硫酸钠干燥,加入600ml环己烷,产品用丙酮重结晶,真空干燥过夜。产率为82%。m/z(+FAB,100%M+)575.63。
实施例8制备如下结构式的季鏻盐
三苯基膦(4.81g,18.32mmol)与对溴苯甲酸(3.74g,18.61mmol)加入到100mL烧瓶中,再加入溴化镍(0.21g,0.94mmol)。在加热之前,用氩气拍空气30分钟,反应加热至160℃,反应15.5小时。反应结束后,加入氯仿50mL,过滤除去副产物。反应体系用44%的HBr洗涤3次,有机相用无水硫酸钠干燥,加入600mL环己烷沉淀出粗产品,以氯仿/甲醇(V/V)=90/10的溶液为洗脱剂,用硅胶柱纯化产品,产品真空干燥过夜,产率为20%。通过核磁辨明结构:1HNMR(400MHz,25℃)in CD3OD:δ(ppm)8.566-9.056(m,14H),9.257-9.549(m,3H),9.558-9.880(m,2H),m/z(ES+,100%M+)383.1198。
实施例9制备如下结构式的季鏻盐
溴代丙酸(3.02g,20mmol)与三丁基膦(2.02g,10mmol)加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为60%。m/z(+FAB,100%M+)275.20。
实施例10制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.02g,0.02mol)与三戊基膦(2.44g,0.01mol)加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为65%。m/z(+FAB,100%M+)317.26。
实施例11制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.02g,0.02mol)与三己基膦(2.85g,0.01mol)加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为80%。m/z(+FAB,100%M+)359.31。
实施例12制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.02g,0.02mol)与三庚基膦(3.31g,0.01mol)加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为82%。m/z(+FAB,100%M+)401.52。
实施例13制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.00g,0.02mol)与三辛基膦(3.72g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为75%。m/z(+FAB,100%M+)443.40。
实施例14制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.02g,0.02mol)与三壬基膦(4.12g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为80%。m/z(+FAB,100%M+)485.40。
实施例15制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.02g,0.02mol)与三癸基膦(4.52g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为90%。m/z(+FAB,100%M+)527.50。
实施例16制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三丁基膦(2.02g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为60%。经质谱图鉴定,如图2(ES-图)所示,m/z(电喷雾ES-,100%M-)463.0795。
实施例17制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三戊基膦(2.44g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为50%。m/z(+FAB,100%M+)345.30。
实施例18制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三己基膦(2.85g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为90%。m/z(+FAB,100%M+)387.39。
实施例19制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三庚基膦(3.31g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为90%。m/z(+FAB,100%M+)429.50。
实施例20制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三辛基膦(3.72g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为80%。m/z(+FAB,100%M+)471.43。
实施例21制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三壬基膦(4.02g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为80%。m/z(+FAB,100%M+)513.50。
实施例22制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三癸基膦(4.52g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为77.5%。m/z(+FAB,100%M+)555.50。
实施例23制备如下结构式的季鏻盐
溴代庚酸(4.20g,0.02mol)与三丁基膦(2.02g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为70%。m/z(+FAB,100%M+)321.27。
实施例24制备如下结构式的季鏻盐
溴代庚酸(4.20g,0.02mol)与三戊基膦(2.44g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为90%。m/z(+FAB,100%M+)373.40。
实施例25制备如下结构式的季鏻盐
溴代庚酸(4.20g,0.02mol)与三己基膦(2.85g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为70%。m/z(+FAB,100%M+)415.51。
实施例26制备如下结构式的季鏻盐
溴代庚酸(4.22g,0.02mol)与三庚基膦(3.31g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为69%。m/z(+FAB,100%M+)457.40。
实施例27制备如下结构式的季鏻盐
溴代庚酸(4.20g,0.02mol)与三辛基膦(3.72g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为92%。m/z(+FAB,100%M+)499.50。
实施例28制备如下结构式的季鏻盐
溴代庚酸(4.20g,0.02mol)与三壬基膦(4.12g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为75%。m/z(+FAB,100%M+)541.50。
实施例29制备如下结构式的季鏻盐
溴代庚酸(4.17g,0.02mol)与三癸基膦(4.52g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为80%。m/z(+FAB,100%M+)583.60。
实施例30制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三羟基丁基膦(3.02g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为60%。m/z(+FAB,100%M+)351.23。
实施例31制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三羟基戊基膦(5.82g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为60%。m/z(+FAB,100%M+)393.40。
实施例32制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三羟基己基膦(6.72g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为80%。m/z(+FAB,100%M+)435.35。
实施例33制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三羟基庚基膦(7.52g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为90%。m/z(+FAB,100%M+)477.40。
实施例34制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三羟基辛基膦(8.36g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为71%。m/z(+FAB,100%M+)519.50。
实施例35制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三羟基壬基膦(9.22g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为83%。m/z(+FAB,100%M+)561.50。
实施例36制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(3.62g,0.02mol)与三羟基癸基膦(10.01g,0.01mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为92%。m/z(+FAB,100%M+)603.51。
实施例37制备如下结构式的季鏻盐
溴代戊酸(5.01g,0.03mol)与三苯基膦(2.62g,0.01mol)加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应48小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为50%。经质谱验证产物结构,m/z(+FAB,100%M+)363.31。
实施例38制备如下结构式的季鏻盐
溴代庚酸(6.24g,0.03mol)与三苯基膦(2.62g,0.01mol)加入到100mL烧瓶中,加入乙腈50mL,加热至80℃反应24小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的油状沉淀,真空干燥的产品,产率为77%。经质谱验证产物结构,m/z(+FAB,100%M+)391.25。
实施例39制备如下结构式的季鏻盐
对羧基苯基二苯基膦(10.0g,32.6mmol)与1-溴代丁烷(36.4mL,0.339mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加热至110℃反应18小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的产品,真空干燥的产品,产率为90%。1H NMR(400MHz,25℃,CD3OD):δ(ppm)0.934(t,3H),1.502-1.698(m,4H),3.385-3.490(m,2H),7.691-7.946(m,12H),8.258-8.327(m,2H).m/z(+FAB,100%M+)363.15.
实施例40制备如下结构式的季鏻盐
对羧基苯基二苯基膦(10.0g,32.6mmol)与1-溴代己烷(36.6mL,0.339mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加热至110℃反应18小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的产品,真空干燥的产品,产率为90%。m/z(+FAB,100%M+)391.20.
实施例41制备如下结构式的季鏻盐
对羧基苯基二苯基膦(10.0g,32.6mmol)与1-溴代庚烷(37.6mL,0.339mol)等摩尔比例加入到100mL烧瓶中,加热至110℃反应18小时,反应结束后,旋干溶剂。将反应体系导入环己烷中,收集析出的产品,真空干燥的产品,产率为90%。m/z(+FAB,100%M+)419.31.
实施例42对树枝状分子进行修饰
将三丁基(4-羧基丁基)溴化鏻盐(18.1mg,0.1mmol)与等比例的NHS与EDC·HCl加入到烧瓶中,加入DMSO作为溶剂,反应24小时。反应结束后,将反应体系按照(1︰12)比例加入到4代PAMAM树枝状分子的水溶液中,反应48小时后,用截留分子量为14000的透析袋透析,冻干后得产品。产率70%。分子质量通过GPC分析,结果如图3所示。
实施例43对树枝状分子进行修饰
将三苯基(对羧基苯基)溴化鏻盐(38.3mg,0.21mmol)与等比例的NHS与EDC·HCl加入到烧瓶中,加入DMSO作为溶剂,反应24小时。反应结束后,将反应体系按照(1︰23)比例加入到4代PAMAM树枝状分的水溶液中,反应48小时后,用截留分子量为14000的透析袋透析,冻干后得产品。产率60%。质谱图如图4所示。
实施例44对树枝状分子进行修饰
将三苯基(对羧基苯基)溴化鏻盐(81.0mg,0.45mmol)与等比例的NHS与EDC·HCl加入到烧瓶中,加入DMSO作为溶剂,反应24小时。反应结束后,将反应体系按照(1︰47)比例加入到4代PAMAM树枝状分的水溶液中,反应48小时后,用截留分子量为14000的透析袋透析,冻干后得产品。产率90%。GPC显示分子量为Mw=39442(多分散性指数PDI=1.26)。
实施例45对树枝状分子进行修饰
将三苯基(对羧基苯基)溴化鏻盐(40.0mg,0.22mmol)与等比例的NHS与EDC·HCl加入到烧瓶中,加入DMSO作为溶剂,反应24小时。反应结束后,将反应体系按照(1︰12)比例加入到5代PAMAM树枝状分的水溶液中,反应48小时后,用截留分子量为14000的透析袋透析,冻干后得产品。产率84%。GPC显示分子量为Mw=34432(PDI=1.33)。
实施例46对树枝状分子进行修饰
将三苯基(对羧基苯基)溴化鏻盐(100.0mg,0.58mmol)与等比例的NHS与EDC·HCl加入到烧瓶中,加入DMSO作为溶剂,反应24小时。反应结束后,将反应体系按照(1︰28)比例加入到5代PAMAM树枝状分的水溶液中,反应48小时后,用截留分子量为14000的透析袋透析,冻干后得产品。产率70%。GPC显示分子量为Mw=42243(PDI=1.41)。
实施例47对树枝状分子进行修饰
将三苯基(对羧基苯基)溴化鏻盐(200.0mg,1.16mmol)与等比例的NHS与EDC·HCl加入到烧瓶中,加入DMSO作为溶剂,反应24小时。反应结束后,将反应体系按照(1︰60)比例加入到5代PAMAM树枝状分的水溶液中,反应48小时后,用截留分子量为14000的透析袋透析,冻干后得产品。产率65%。GPC显示分子量为Mw=59432(PDI=1.11)。
实施例48体外转染实验
其具体步骤:在进行转染前24h,在24孔板上种植45000-60000个每孔的细胞,每孔使用500μL无抗体培养基培养,保证在转染时细胞长到80%-90%的细胞密度。将细胞培养液中的培养基小心吸掉,用无血清的RPMI1640或DMEM洗一次后,将制备好放置了30min的不同N/P比(N为树枝状分子上的氮原子,P指DNA碱基骨架上磷酯键中磷原子)的DNA复合物加入相应的细胞孔中,在37℃、5%的二氧化碳氛围下培养4h后,吸掉培养基并加入500μL含有10%血清的RPMI1640或DMEM培养基。继续在37℃、5%的二氧化碳氛围下培养24h后进行下一步的基因表达情况测定。对于荧光蛋白表达实验,转染时使用pEGFP-N1做报告基因,按上述方法转染24h后在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况并拍照。对于转染EGFP基因呈阳性的细胞,使用流式细胞仪测定有荧光反应的细胞数量,确定转染效率。而对荧光素酶定量实验,转染时使用pGL-3做报告基因。按上述方法转染24h后吸掉培养基,用500μL预先冷却的PBS缓冲液洗涤两次。按照荧光素酶试剂盒生产商(Promega)提供的方法,将100μL 1X的细胞裂解液用缓冲液PBS稀释后加入细胞中,室温下在水平摇床上裂解30min后将细胞裂解物转移至EP管中,4000转/min离心2min,将上层液再次转移至另外的EP管中保存在冰块中。取20μL该裂解液和100μL荧光素酶底物(Promega)解冻至室温,然后将该20μL裂解液加入到100μL荧光素酶底物中使他们发生复合作用,用酶标仪(Bio RAD model 550)测定荧光活性(每孔测8次),裂解液的蛋白浓度用Thermo Modified Lowry Protein Assay Kit(Thermo,Rockford,IL,USA)测定,转染效率用相对荧光活性(RLU)/mg蛋白表达,即RLU/mg protein。转染时都做的是两个复孔,转染结果是两次的平均值。
将4代的聚酰胺胺树枝状分子修饰上不同比例的TPP三苯基(对羧基苯基)季鏻盐后(结构如图5所示)与EGFP基因(绿色荧光蛋白基因)以不同N/P比直接混合,然后对Hela细胞与COS-7细胞进行细胞转染。图5所示,G4,G4-TPP12,G4-TPP23与G5-TPP35分别代表每个4代树枝状分子上修饰了0、12、23、35个TPP分子。转染时HeLa细胞,G4、G4-TPP12、G5-TPP23、G4-TPP35分别与EGFP基因按照N/P比为12︰1、16︰1、24︰1、28︰1以及64︰1混合,形成复合物,结果见图6。图6中出示的为个树枝状分子与EGFP基因最佳转染N/P比的结果,即G4与EGFP基因最佳N/P比12︰1,G4-TPP12与EGFP基因最佳N/P比28︰1,G4-TPP23与EGFP基因最佳N/P比24︰1,G5-TPP35与EGFP基因最佳N/P 16︰1时的转染效果。
转染COS-7细胞时,G4、G4-TPP 12、G5-TPP23、G4-TPP35分别与EGFP基因按照N/P比12︰1、16︰1、28︰1、32︰1以及64︰1混合,形成复合物,其结果如图7所示。图7中出示的为个树枝状分子与EGFP基因最佳转染N/P比的结果,即G4与EGFP基因最佳N/P比12︰1,G4-TPP12与EGFP基因最佳N/P比32︰1,G4-TPP23与EGFP基因最佳N/P比28︰1,G5-TPP35与EGFP基因最佳N/P 12︰1时的转染效果。
图6与图7显示:该4代三苯基(对羧基苯基)季鏻盐修饰的树枝状分子可有效运输DNA进入细胞核中并表达。总体效果略低于lipo2000(一种脂质体转染试剂),好于SuperFect(一种聚合物转染试剂)。
Claims (5)
1.一种季鏻盐,其结构如式Ⅰ或Ⅱ所示:
其中n=2;
R为CH3(CH2)xCH2或HOCH2(CH2)yCH2;x=2、3、4、5、6、7或8,y=2、3、4、5、6、7或8。
2.如权利要求1所述的季鏻盐,其特征在于:所述的R为CH3(CH2)2CH2或HOCH2(CH2)2CH2。
3.季鏻盐修饰树枝状分子的方法,其特征在于:包括如下步骤:将季鏻盐、N-羟基琥珀酸亚胺NHS与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl三者等摩尔量混合,加入DMSO作为溶剂,反应24小时;反应结束后,将反应体系加入到树枝状分子的水溶液中,反应48小时后,用截留分子量为14000的透析袋透析,冻干后得产品;季鏻盐与树枝状分子的摩尔比例为10:1~128:1,所述的季鏻盐为三苯基(对羧基苯基)溴化鏻盐,所述的树枝状分子4代、5代聚酰胺胺树枝状分子。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于:季鏻盐与树枝状分子的摩尔比例为12:1~60:1。
5.权利要求3-4任一项所述方法制备的三苯基(对羧基苯基)溴化鏻盐修饰的树枝状分子在制备转基因载体中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510288076.3A CN104844650B (zh) | 2015-05-29 | 2015-05-29 | 季鏻盐修饰树枝状分子的制备及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510288076.3A CN104844650B (zh) | 2015-05-29 | 2015-05-29 | 季鏻盐修饰树枝状分子的制备及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104844650A CN104844650A (zh) | 2015-08-19 |
CN104844650B true CN104844650B (zh) | 2017-12-29 |
Family
ID=53844681
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510288076.3A Active CN104844650B (zh) | 2015-05-29 | 2015-05-29 | 季鏻盐修饰树枝状分子的制备及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104844650B (zh) |
-
2015
- 2015-05-29 CN CN201510288076.3A patent/CN104844650B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104844650A (zh) | 2015-08-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105906807B (zh) | 一种具有本征阻燃性能的聚三唑及其制备方法和应用 | |
KR20080014980A (ko) | 고차가지구조 고분자 및 그들의 응용 | |
JP2009535462A (ja) | 化学的に異なる末端基を含むポリ(エチレングリコール) | |
CN105152970B (zh) | 大位阻二亚胺钯催化剂及其配体、制备方法和用途 | |
CN105566653B (zh) | 一种两性羧酸镧金属有机骨架及其合成方法和应用 | |
CN106496555B (zh) | 一种金属配位聚阳离子基因载体及其制备方法和应用 | |
Sharma et al. | Low generation polyamine dendrimers bearing flexible tetraethylene glycol as nanocarriers for plasmids and siRNA | |
Wang et al. | Metal ion-modulated self-assembly of pseudo-suit [3] anes using crown ether-based terpyridine metalloprisms | |
CN111393350A (zh) | 一种n-甲基-3-取代苄巯基-4-吗啉基马来酰亚胺化合物的合成方法 | |
CN106554499B (zh) | 一种含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体及其合成方法和应用 | |
CN106045991B (zh) | 叶绿素作为光敏剂在可见光催化环化反应合成四氢喹啉衍生物中的应用 | |
CN104844650B (zh) | 季鏻盐修饰树枝状分子的制备及应用 | |
Rolland et al. | Efficient synthesis of phosphorus-containing dendrimers capped with isosteric functions of amino-bismethylene phosphonic acids | |
CN104311582B (zh) | 一种席夫碱锌化合物、其制备方法及聚乳酸的制备方法 | |
Matsumoto et al. | Synthesis and properties of aromatic polyamide dendrimers with polyhedral oligomeric silsesquioxane cores | |
CN106432334B (zh) | 具有双荧光发射的线粒体荧光探针及其制备方法和应用 | |
CN113307804B (zh) | 含氟吲哚喹啉类化合物的合成方法及其应用 | |
CN102276829B (zh) | 一种非病毒基因载体材料及其制备方法和应用 | |
CN102060946A (zh) | 含有苯基的n,n配位的镍乙烯聚合催化剂及制备和应用 | |
Jaycox et al. | Potential DNA bis‐intercalating agents: Synthesis and antitumor activity of novel, conformationally restricted bis (9‐aminoacridines) | |
Wang et al. | Construction of a series of mercury (II) complexes based on a bis-pyridyl-bis-amide ligand: Effect of counter anions, interactions on the supermolecular structures | |
CN113717085B (zh) | 一种序列精确聚单硫代缩醛及其制备方法 | |
CN110183640B (zh) | 基于戊内酯衍生物开环聚合的可降解聚合物及其制备方法与用途 | |
JP5230956B2 (ja) | 第4級アンモニウム塩を用いた疎水性巨大分子の可溶化方法 | |
CN110117215A (zh) | 螺浆烷类化合物连续合成的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201201 Address after: 226000 266 Century Avenue, Nantong hi tech Zone, Nantong, Jiangsu Patentee after: Nantong Yaoxiang Technology Co., Ltd Address before: No. 69 lijiatuo Chongqing District of Banan City Road 400054 red Patentee before: Chongqing University of Technology |
|
TR01 | Transfer of patent right |