CN104844555A - 一种生物碱类化合物、其药物组合物、其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种生物碱类化合物、其药物组合物、其制备方法及用途。本发明还涉及一种矛束霉(Doratomyces sp.)。具体地，本发明涉及式I所示的化合物，或其可药用盐。本发明的化合物能够有效地抑制肿瘤细胞，能够应用于肿瘤的防治。

Description

一种生物碱类化合物、其药物组合物、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种生物碱类化合物、其药物组合物、其制备方法及用途。本发明还涉及一种矛束霉(Doratomyces sp.)。
背景技术
肿瘤严重威胁着人类的健康，全世界每年死于癌症的病人约700万；最近的统计资料表明，我国每年有200万肿瘤患者，因癌症死亡人数为140万，且肿瘤的发病率呈逐年上升和年轻化的趋势，其死亡率占总死亡人口的1/5，成为人类健康的主要杀手之一。经过各国科学家们多年的努力，新的抗肿瘤药物不断出现，肿瘤的化学药物治疗出现飞速的发展，患者生命明显延长，生活质量得到明显改善，特别是对白血病、淋巴瘤等的治疗有了突破性进展。但对危害人类健康最严重的、占恶性肿瘤90%以上的恶性肿瘤如宫颈癌、乳腺癌、肺癌、肝癌及胰腺癌等还缺乏有效治疗药物。此外，抗肿瘤药物的高昂价格、临床治疗中产生的耐药性及给患者带来的毒副作用等都表明，人类迫切需要研究与开发新型、高效的抗癌药物。
在特殊生境或极端环境下形成的生物资源拥有特殊的基因及其表达产物，是人类的珍贵遗传资源宝库。如近年来发挥着巨大医疗作用的抗癌物质紫杉醇、治疗心血管病洛伐他汀、抗疟疾药物青蒿素等。特殊生境真菌和植物来源中功能性活性物质的开发利用，可产生丰富的自主知识产权成果，同时孕育着巨大的产业前景与经济效益。本发明涉及的从矛束霉稻米发酵物中分离制备的一种新生物碱类化合物的抗肿瘤活性及其用途至今未见报道。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种生物碱类化合物（如下面的式I）。并且本发明人惊奇地发现，该化合物能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖和/生长，具有作为或者用于制备抗肿瘤药物的潜力。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及式I所示的化合物，或其可药用盐：
式I。
本发明所提供的式I所示的化合物是从微生物（CGMCC No.5526）固体发酵提取物中首次分离得到的并命名的新化合物，同时是首次报道其抗肿瘤活性。
本发明通过构建细胞筛选模型以鉴定该化合物是否具有抑制肿瘤发生发展的作用。构建的细胞筛选模型有肺癌细胞（A549）、乳腺癌细胞（MCF-7）、结肠癌细胞（SW480、HCT116）、宫颈癌细胞（HeLa）和膀胱癌细胞（T24）等，采用体外细胞增殖实验MTT法筛选该化合物能够抑制何种肿瘤细胞的增殖生长，经试验发现该化合物能够较好的抑制上述肿瘤细胞的增殖生长过程，并且对该化合物呈现剂量效应即随着化合物浓度的增高对肿瘤细胞的增殖生长的抑制效果越好。
本发明的另一方面涉及一种微生物菌株矛束霉XZ059（Doratomyces sp.），其于2011年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.5526。
本发明的再一方面涉及本发明的微生物菌株的发酵液或提取物；具体地，所述发酵液或者提取物含有式I化合物。
本发明的再一方面涉及本发明的微生物菌株在制备本发明的式I化合物或其可药用盐中的用途。
本发明的再一方面涉及本发明的式I化合物的制备方法，包括使用本发明的微生物菌株的步骤。
根据本发明任一项所述的方法，包括下述步骤：
（1）将矛束霉属（Doratomyces sp.）菌株XZ059进行固体发酵，得到发酵培养物；
（2）将步骤（1）中获得的发酵培养物用合适的有机溶剂提取合适的次数，合并提取液，将所述提取液分离有机溶剂后，得到粗提物；
（3）将步骤（2）中获得的粗提物进行层析分离，得到活性组分溶液，将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离，得到所述化合物。
根据本发明任一项所述的方法，其特征在于如下的1）至13）项中的任意一项或者多项：
1）步骤（1）中，发酵使用的培养基是稻米培养基；
2）步骤（1）中，发酵温度为20－30℃，优选22－28℃，更优选25℃；
3）步骤（1）中，发酵时间为15－25天，优选18－22天，更优选20天；
4）步骤（2）中，所述的提取方式为浸泡提取；
5）步骤（2）中，所述的提取方式是将步骤a)得到的发酵培养物在所述的有机溶液中浸泡，浸泡时间为至少1小时；优选地，浸泡时间为0.5－2天；更优选地，浸泡时间为1天；
6）步骤（2）中，提取的次数为1－5次，优选的提取次数为2－4次，更优选的提取次数为3次；
7）步骤（2）中，所述的有机溶剂为甲醇，丙酮和/或乙酸乙酯，优选的有机溶剂为丙酮和/或乙酸乙酯，更优选的有机溶剂为乙酸乙酯；
8）步骤（2）中，分离有机溶剂的方式为蒸馏，更优选的分离方式为减压蒸馏
9）步骤（3）中，所述的层析分离为硅胶柱层析分离和/或凝胶色谱分离；优选地，所述硅胶柱层析分离为减压硅胶柱层析分离；
10）步骤（3）中，将步骤b)中获得的粗提物依次进行硅胶柱层析和凝胶色谱分离；
11）步骤（3）中，硅胶柱层析分离步骤中，流动相为二氯甲烷和甲醇的混合物；优选地，二氯甲烷与甲醇的体积比为100:（1－10）；更优选地，二氯甲烷与甲醇的体积比为100:（4－8）；进一步优选地，二氯甲烷与甲醇的体积比为100:6；
12）步骤（3）中，凝胶色谱分离步骤中，流动相为二氯甲烷和甲醇的等体积混合物；
13）步骤（3）中，高效液相色谱分离步骤中，流动相为甲醇水溶液；优选地，甲醇与水的体积比为72:28。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其含有本发明的式I化合物或其可药用盐，以及任选的一种或多种药学可接受的辅料。
本发明还提供了含有式Ⅰ所示化合物或其可药用盐作为活性成分以及适合的辅料（载体或赋型剂）的药物组合物。所述的载体或赋形剂包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清白蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂等。
所述的药物组合物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
所述的药物组合物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
本发明的再一方面涉及本发明的式I化合物或其可药用盐或者本发明的药物组合物在制备抑制肿瘤细胞的药物中的用途，或在制备抗肿瘤或者预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途；
具体地，所述的肿瘤细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞或膀胱癌细胞；更具体地，所述肺癌细胞为肺癌细胞A549，所述乳腺癌细胞为乳腺癌细胞MCF-7，所述结肠癌细胞为结肠癌细胞SW480或结肠癌细胞HCT116，所述宫颈癌细胞为宫颈癌细胞HeLa，所述膀胱癌细胞为膀胱癌细胞T24；
具体地，所述的肿瘤为肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌或膀胱癌。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制肿瘤细胞的方法，包括使用有效量的式I化合物或其可药用盐的步骤；具体地，所述的肿瘤细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞或膀胱癌细胞；更具体地，所述肺癌细胞为肺癌细胞A549，所述乳腺癌细胞为乳腺癌细胞MCF-7，所述结肠癌细胞为结肠癌细胞SW480或结肠癌细胞HCT116，所述宫颈癌细胞为宫颈癌细胞HeLa，所述膀胱癌细胞为膀胱癌细胞T24。
在本发明的一个实施方案中，所述体外抑制肿瘤细胞的方法是非治疗目的的。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/辅助治疗肿瘤或者癌症的方法，包括使用有效量的本发明的式I化合物或其可药用盐的步骤。具体地，所述肿瘤为选自肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌和膀胱癌中的任意一种或者多种。
另外需要指出，本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。例如使用剂量介于0.01－100mg/kg体重/天，又例如0.1－10mg/kg体重/天。
本发明中，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
如本文所述的，术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
有益效果
本发明的化合物能够有效地抑制肿瘤细胞，能够应用于肿瘤的防治。
附图说明
图1为式I所示化合物的核磁共振1H-NMR谱图。
图2为式I所示化合物的核磁共振13C-NMR谱图。
图3为式I所示化合物的核磁共振HMQC谱图。
图4为式I所示化合物的核磁共振HMBC谱图。
图5为肿瘤细胞对式I所示化合物的剂量效应图，肿瘤细胞包括肺癌细胞（A549）、乳腺癌细胞（MCF-7）、结肠癌细胞（SW480、HCT116）、宫颈癌细胞（HeLa）和膀胱癌细胞（T24）。
图6为式I所示化合物对肿瘤细胞[肺癌细胞（A549）、乳腺癌细胞（MCF-7）、结肠癌细胞（SW480、HCT116）、宫颈癌细胞（HeLa）和膀胱癌细胞（T24）]的IC50值。
图7为阳性对照药物顺铂（DDP）对肿瘤细胞[肺癌细胞（A549）、乳腺癌细胞（MCF-7）、结肠癌细胞（SW480、HCT116）、宫颈癌细胞（HeLa）和膀胱癌细胞（T24）]的IC50值。
关于生物材料保藏的说明：
一种微生物菌株矛束霉XZ059（Doratomyces sp.），其于2011年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.5526，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例中所用的菌株Doratomyces sp.于2011年12月06日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.5526，分类命名为矛束霉（Doratomyces sp.），菌株名称为XZ059。
实施例1：式I化合物的制备
a.菌株Doratomyces sp.的固体发酵
菌株Doratomyces sp.的活化。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，纯净水1000mL，121℃高压蒸汽灭菌30分钟，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25℃培养10天。
菌株Doratomyces sp.的固体发酵。稻米培养基的制备（将4.8Kg稻米和7200mL纯净水等分加入60个500mL三角瓶中，浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌30分钟，冷却待用）；从试管斜面上挑取菌丝体于装有无菌水的试管中配成菌悬液，将制备好的菌悬液（孢子浓度为1×106个/mL）5mL接种于稻米培养基上，在25℃无菌培养间发酵培养20天，获得发酵培养物。
b.粗提物的提取
将步骤a得到的发酵培养物用玻璃棒（0.8cm×30cm）捣碎，将12.0L乙酸乙酯加入500mL三角瓶中（共60瓶，每瓶200mL），静置浸泡1天，用直径为12.5cm的中速定性滤纸(购自杭州特种纸业有限公司)室温常压过滤得到有机相和残渣，将有机相记作粗提液Ⅰ，将残渣记作残渣Ⅰ；
将12.0L乙酸乙酯加入到残渣Ⅰ中（共60瓶，每瓶200mL），静置浸泡1天，过滤得到有机相和残渣，将有机相记作粗提液Ⅱ，将残渣记作残渣Ⅱ；
将12.0L乙酸乙酯加入到残渣Ⅱ中（共60瓶，每瓶200mL），静置浸泡1天，过滤得到有机相和残渣，将有机相记作粗提液Ⅲ，将残渣记作残渣Ⅲ；
合并粗提液Ⅰ、粗提液Ⅱ和粗提液Ⅲ，记作粗提液。
将粗提液减压蒸馏至干燥，得到65.4g的粗提物。
c.粗提物的分离纯化
将上述粗提物装入减压层析硅胶柱[减压硅胶柱（40cm×15cm），购自北京玻璃仪器公司；所用的硅胶为薄层层析硅胶H，购自青岛海洋化工有限公司。柱子中装500g硅胶]，用正己烷-二氯甲烷-甲醇体系进行减压硅胶柱层析,所用流动相为：正己烷:二氯甲烷（v/v）=100:0,99:1,97:3,95:5,92:8,90:10,85:15,80:20,75:25,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80,10:90,0:100；二氯甲烷:甲醇（v/v）=200:1,100:1,100:1.5,100:2,100:2.5,100:3,100:4,100:5,100:6,100:7,100:8,100:9,100:10,0:100；共计31个梯度，每个梯度的洗脱体积均为800mL，将每个梯度的洗脱液减压蒸馏，按照极性由小到大的顺序将粗提物分成31个组分，在活性跟踪[测试31个组分对乳腺癌细胞（MCF-7）和宫颈癌细胞（HeLa）的抑制活性，具体的测试方法如实施例3所述，抑制率大于50%视为有抑制活性]指导下，发现在二氯甲烷:甲醇=100:6（v/v）作为流动相洗脱得到的组分（命名为组分1）有抑制活性，收集活性组分1(1.7g)。
将活性组分1通过凝胶色谱分离，凝胶色谱柱规格为60cm×3.0cm（购自新维尔玻璃仪器公司），所用的凝胶填料为葡聚糖凝胶SephadexLH-20（购自GE Healthcare Bio-Sciences AB公司），柱子中装80g凝胶，流动相是二氯甲烷和甲醇体积比为1:1的混合溶液，将组分1平均分为40个亚组分，然后在活性跟踪[测试40个组分对乳腺癌细胞（MCF-7）和宫颈癌细胞（HeLa）的抑制活性，具体的测试方法如实施例3所述，抑制率大于50%视为有抑制活性]指导下，发现第14个亚组分（命名为亚组分1-14）有抑制活性，收集活性亚组分1-14(150mg)。
将活性亚组分1-14再次通过凝胶色谱分离，凝胶色谱柱规格为60cm×1.8cm（购自新维尔玻璃仪器公司），所用的凝胶填料为葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（购自GE Healthcare Bio-Sciences AB公司），柱子中装30g凝胶，流动相是二氯甲烷和甲醇体积比为1:1的混合溶液，将组分1-14平均分为16个亚组分，然后在活性跟踪[测试16个组分对乳腺癌细胞（MCF-7）和宫颈癌细胞（HeLa）的抑制活性，具体的测试方法如实施例3所述，抑制率大于50%视为有抑制活性]指导下，发现第9个亚组分（命名为亚组分1-14-9）有抑制活性，收集活性亚组分1-14-9(22mg)。
将活性亚组分1-14-9通过HPLC纯化而得到3.3mg式I所示化合物，其中HPLC的条件是：采用Agilent1260型半制备高压液相色谱仪，Agilent C18反相半制备色谱柱（5μm、9.4x250mm），流速2.0mL/min，用甲醇和水作为流动相，制备条件：甲醇/水（72/28，v/v）等度洗脱25分钟，得到式I所示化合物，其保留时间tR=19.0分钟。
综上，65.4g粗提物经过分离纯化而得到3.3mg式I所示化合物，收率为0.005%。
实施例2：式I所示化合物的结构表征
将实施例1制备的式I所示化合物进行高分辨质谱（HRESIMS）、核磁共振谱（NMR）分析，其中高分辨质谱由中国科学院微生物研究所质谱测试中心提供测试（测试仪器型号为AgilentAccurate-Mass-Q-TOF LC/MS6520），核磁共振谱由军事医学科学院仪器分析测试中心提供测试（测试仪器型号为Varian UNTTYINOVA600）。
经过上述测试分析，实施例1制备的式I所示化合物的理化数据为：黄色油状；分子式：C22H35NO5；分子量：393；高分辨质谱HRESIMS：m/z394.2585[M+H]+(计算的C22H36NO5,394.2588)；氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据见表1、附图1和附图2：
表1：式I所示化合物的氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据
以Pyridine-d5为溶剂测试。
通过将上述式I所示化合物的核磁共振氢谱、碳谱、质谱，结合附图3和图4中该化合物的二维核磁共振谱HMQC和HMBC谱，确证化合物的化学式如式I所示：
式I
综上所述，从真菌Doratomyces sp.中提取并分离了式I所示的天然化合物，经过进一步的纯化，结合高分辨质谱和核磁共振技术分析鉴定该化合物的结构特征。
实施例3：式I所示化合物对肿瘤细胞增殖生长的影响
构建细胞筛选模型：肺癌细胞（A549）、乳腺癌细胞（MCF-7）、结肠癌细胞（SW480、HCT116）、宫颈癌细胞（HeLa）和膀胱癌细胞（T24）（上述细胞均由中国科学院微生物研究所姜学军课题组提供）。
采用MTT法（MTT比色法）检验实施例1制备的式I所示化合物对以上6种肿瘤细胞增殖生长的影响。为了验证几种肿瘤细胞对该化合物的剂量效应，将实施例1制备的式I所示化合物和阳性对照药顺铂分别用DMSO（二甲基亚砜，Dimethyl sulfoxide，DMSO）作溶剂配制成浓度分别为123.76μM、61.88μM、30.94μM、15.47μM、7.74μM、3.87μM、1.93μM及0.97μM的待测溶液，每种处理浓度设置三个重复。
具体实验方法如下：
1、将肿瘤细胞悬液接种至96孔板中，接种100μL（浓度1.0×105个/mL），DMEM培养基（购自Invitrogen公司，使用前按说明书加适当体积的水配制成液体培养基灭菌待用）100μL。
2、将肿瘤细胞在37℃，5%CO2的培养箱内培养24小时，然后倾去各孔培养液，用PBS洗涤1次，实验组加入上述配制的不同浓度的式I所示化合物的待测溶液，每个浓度接种3孔，每孔加入200μL；阳性对照组加入不同浓度的顺铂溶液，每个浓度接种3孔，每孔加入200μL；阴性对照组加入200μL的液体DMEM培养液；将其置于37℃，5%CO2的培养箱内培养4小时。
3、培养结束后，用新鲜的DMEM液体培养基等体积替换式I所示化合物溶液、阳性对照药溶液以及阴性对照组的培养液，再在37℃，5%CO2的培养箱内培养48小时。
4、每孔加入50μL（浓度0.5mg/mL）的MTT（噻唑蓝）溶液处理所述的肿瘤细胞，再将其置于37℃，5%CO2的培养箱内培养3小时。
5、离心（1500r/min,5min）除去培养基和MTT溶液，每孔加入200μL的DMSO溶液，37℃下静置1小时。
6、应用酶标仪（SUNRISE-basic TECAN）测定经上述步骤培养后的混合物在570nm波长的条件下的光密度OD值，按公式计算肿瘤细胞生长抑制率。测定光密度OD值时，设空白组，空白组只含200μL的DMSO溶液。
本实验中的阴性对照组OD值，阳性对照组OD值和实验组OD值均为扣除掉空白组OD的值。
式I所示化合物对6种肿瘤细胞抑制作用的结果见附图5。
根据得到的式I所示化合物在各个处理浓度下的抑制率曲线图（如附图5所示）推导得到天然式I所示化合物对6个肿瘤细胞IC50值。
其中IC50表示导致50%细胞增殖抑制的药物浓度。
式I所示化合物对测试的6种肿瘤细胞的IC50值见附图6。
依据上述方法，得到阳性对照药物顺铂（DDP）对测试的6种肿瘤细胞的IC50值见附图7。
综上所述，本发明的式I所示化合物对肺癌细胞（A549）、乳腺癌细胞（MCF-7）、结肠癌细胞（SW480、HCT116）、宫颈癌细胞（HeLa）和膀胱癌细胞（T24）有明显的抑制活性。因此，本发明对研究与开发新的抗肿瘤（肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌和膀胱癌）药物提供了候选化合物，也为开发利用微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解：根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.式I所示的化合物，或其可药用盐：
式I。
2.一种微生物菌株矛束霉XZ059（Doratomyces sp.），其于2011年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.5526。
3.权利要求2所述的微生物菌株的发酵液或提取物；具体地，所述发酵液或者提取物含有权利要求1所述的化合物。
4.权利要求2所述的微生物菌株在制备权利要求1或2所述的化合物或其可药用盐中的用途。
5.权利要求1所述的化合物的制备方法，包括使用权利要求2所述的微生物菌株的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，包括下述步骤：
（1）将矛束霉属（Doratomyces sp.）菌株XZ059进行固体发酵，得到发酵培养物；
（2）将步骤（1）中获得的发酵培养物用合适的有机溶剂提取合适的次数，合并提取液，将所述提取液分离有机溶剂后，得到粗提物；
（3）将步骤（2）中获得的粗提物进行层析分离，得到活性组分溶液，将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离，得到所述化合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于如下的1）至13）项中的任意一项或者多项：
1）步骤（1）中，发酵使用的培养基是稻米培养基；
2）步骤（1）中，发酵温度为20－30℃，优选22－28℃，更优选25℃；
3）步骤（1）中，发酵时间为15－25天，优选18－22天，更优选20天；
4）步骤（2）中，所述的提取方式为浸泡提取；
5）步骤（2）中，所述的提取方式是将步骤a)得到的发酵培养物在所述的有机溶液中浸泡，浸泡时间为至少1小时；优选地，浸泡时间为0.5－2天；更优选地，浸泡时间为1天；
6）步骤（2）中，提取的次数为1－5次，优选的提取次数为2－4次，更优选的提取次数为3次；
7）步骤（2）中，所述的有机溶剂为甲醇，丙酮和/或乙酸乙酯，优选的有机溶剂为丙酮和/或乙酸乙酯，更优选的有机溶剂为乙酸乙酯；
8）步骤（2）中，分离有机溶剂的方式为蒸馏，更优选的分离方式为减压蒸馏
9）步骤（3）中，所述的层析分离为硅胶柱层析分离和/或凝胶色谱分离；优选地，所述硅胶柱层析分离为减压硅胶柱层析分离；
10）步骤（3）中，将步骤b)中获得的粗提物依次进行硅胶柱层析和凝胶色谱分离；
11）步骤（3）中，硅胶柱层析分离步骤中，流动相为二氯甲烷和甲醇的混合物；优选地，二氯甲烷与甲醇的体积比为100:（1－10）；更优选地，二氯甲烷与甲醇的体积比为100:（4－8）；进一步优选地，二氯甲烷与甲醇的体积比为100:6；
12）步骤（3）中，凝胶色谱分离步骤中，流动相为二氯甲烷和甲醇的等体积混合物；
13）步骤（3）中，高效液相色谱分离步骤中，流动相为甲醇水溶液；优选地，甲醇与水的体积比为72:28。
8.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的化合物或其可药用盐，以及任选的一种或多种药学可接受的辅料。
9.权利要求1的化合物或其可药用盐或者权利要求8所述的药物组合物在制备抑制肿瘤细胞的药物中的用途，或在制备抗肿瘤或者预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途；
具体地，所述的肿瘤细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞或膀胱癌细胞；更具体地，所述肺癌细胞为肺癌细胞A549，所述乳腺癌细胞为乳腺癌细胞MCF-7，所述结肠癌细胞为结肠癌细胞SW480或结肠癌细胞HCT116，所述宫颈癌细胞为宫颈癌细胞HeLa，所述膀胱癌细胞为膀胱癌细胞T24；
具体地，所述的肿瘤为肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌或膀胱癌。
10.一种在体内或体外抑制肿瘤细胞的方法，包括使用有效量的权利要求1所述的化合物或其可药用盐的步骤；具体地，所述的肿瘤细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞或膀胱癌细胞；更具体地，所述肺癌细胞为肺癌细胞A549，所述乳腺癌细胞为乳腺癌细胞MCF-7，所述结肠癌细胞为结肠癌细胞SW480或结肠癌细胞HCT116，所述宫颈癌细胞为宫颈癌细胞HeLa，所述膀胱癌细胞为膀胱癌细胞T24。
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