CN104839450A - 一种提取物及其作为饲料添加剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取物及其作为饲料添加剂的应用，该提取物为公丁香的醇提物，可作为饲料添加剂。本发明以公丁香为原料通过乙醇浸提的方式获得醇提物，经实验发现，该醇提物不仅能够防止饲料发霉、抗饲料氧化，而且还能减轻霉菌毒素对生物的毒性效应，尤其是黄曲霉毒素对干细胞的毒害效应；以该醇提物为原料制备的饲料添加剂解决了现有技术中天然植物添加剂功能单一的问题。

Description

一种提取物及其作为饲料添加剂的应用

技术领域

本发明涉及畜牧养殖领域，具体涉及一种提取物及其作为饲料添加剂的应用。

背景技术

目前，由饲料安全问题引发的食品安全事件越来越多：一类是饲料中化学添加剂的滥用和使用超标问题，如近期备受关注的由饲料中抗生素添加剂造成的食品安全危机，还有诸如“健美猪”、“速成鸡”等事件；另一类是由饲料存储不当，发霉变质后，霉菌毒素的残留引发的问题，如2012年蒙牛乳业和南山婴幼儿配方奶粉中检出黄曲霉毒素M1的事件。此类食品安全事件被社会密切关注，并引起了人们的恐慌，也让我们意识到：饲料虽然不被人直接食用，但考虑到食物链的累积放大效应，要从根本上解决食品安全危机就必须从饲料包括饲料添加剂的安全性上抓起。

顺应这股“绿色”潮流，天然植物饲料添加剂应运而生，且越来越受到国内外的提倡和重视。目前，天然植物饲料添加剂已经公认的优势有：安全可靠、来源天然、经济环保、功能多样等。尤其是其对禽畜的多方面的有益的生物学功能如营养、助消化、提高免疫力、提高产品品质、提高生物耐毒性等营养保健作用是传统化学添加剂无法比拟的。

饲料产品在储藏与运输过程中，易被霉菌污染，导致饲料感官发生改变，营养价值降低。据联合国粮食组织估算，全世界每年大约有5％～7％的粮食、饲料等农产品受霉菌的侵害，造成巨大的经济损失。此外，霉菌在繁殖过程中大多会产生霉菌毒素，如黄曲霉素、褐菌素等进入畜禽体内，不仅造成畜禽中毒，还可通过各种渠道进入人体，危害人体健康。天然植物饲料防霉剂既能解决饲料发霉问题，又比传统化学防腐剂低毒、低残留、更经济环保，这方面的理论研究相对比较多：邬本成等人证明了肉桂醛和香芹酚等组成的复合植物精油，可有效抑制青霉(Penicillium)和黑曲霉(Aspergillus niger)的生长；王金娥等人报导了土槿皮、黄柏、白鲜皮和黄芩能控制贮藏前期饲料中的霉菌；罗曼等人研究发现柠檬醛具有较强抗黄曲霉(Aspergillus flavus)作用，并探究了其抗菌机理。实际上市的天然植物饲料防霉剂目前仅有少数几种，如杜仲提取物。

饲料中的抗氧化剂能防止饲料在贮存过程中因氧化作用而破坏维生素，降低营养价值，适口性变差，并且饲料中的脂肪因过氧化而产生的过氧化物对动物还有毒害作用。天然的抗氧化剂大多属多酚类，是具有若干个羟基的苯环结构的物质。目前运用最多的有甘草抗氧化物、茶多酚、迷迭香提取物、植物酸类等数十种。葡萄籽、竹叶抗氧化物(主要是竹叶黄铜)、茶叶中提取的茶多酚等都是天然的抗氧化剂，在肉类食品的抗氧化性方面有一定的显著效果，特别是应用在低温状态下制造肉类等方面。另外茶叶中提取的茶多酚，也被证实其能显著地起抗氧化作用，其在某些低温的肉制品中有所应用。此外，迷迭香、百里香、牛至油、姜科植物、大蒜素、茴香及富含黄酮类的植物都被证实有抗氧化作用。

霉菌毒素是饲料发霉后霉菌所产生的代谢产物，这些毒素不但对禽畜有极大的危害，还会流入食物链，直接威胁食品安全和人类健康，其中危害最大的是黄曲霉素，研究的也最多。

想要抑制霉菌毒素的毒性效应，从逻辑上可以从霉菌毒素产生到发挥最终生物学毒性效应的各个层次上加以阻断：对产毒霉菌而言，可控制其生长达到防霉目的，降低其毒素的合成从而达到减毒的效果，也可利用脱毒技术将其产生的毒素转化为无毒或低毒形式，抑或对受体生物进行保护以减弱毒性效应。目前，虽然还没有成功上市的抑制霉菌毒素的产品，但已经有很多研究显示：某些中草药不仅具有较好的防霉防腐作用，而且能去除饲料中霉菌毒素或降低其活性的功能。

一些植物挥发油(植物精油)能有效抑制产毒霉菌生长并能降低产毒霉菌毒素合成。已报道挥发油具有抑制产毒霉菌生长和产毒的常见植物有30余种，如香茅挥发油抑制寄生曲霉生长和产毒的作用。有时挥发油需与传统抗生素联用，起到联合增效作用：Shin S等人研究发现，天竺葵挥发油及其主成分香叶醇和香茅醇可以提高两性霉素B或酮康唑抑制黄曲霉生长的作用。

在天然植物添加剂对霉菌毒素的脱毒作用方面，研究报道十分有限，仅查到在2013年有关于柠檬酸能对花生粕中的黄曲霉素B进行脱毒的报道，该研究摸索了柠檬酸进行脱毒的最佳条件，但是对于其脱毒机制没有做深入探究。

天然植物添加剂能提高机体的耐毒性从而降低霉菌毒素的毒性效应，起到保护作用。相关研究虽不是很多，但却正在得到重视：蒿艳蓉等人的研究表明银杏叶提取物能显著缓解由黄曲霉素所致的肝细胞损伤。

我国对天然植物饲料添加剂的研究正在快速兴起中，据报道，目前已成功开发出松针粉、麦芽提取物、大蒜素、黄芪多糖和杜仲提取物等100多种中草药饲料添加剂产品，成功用于养殖业并取得良好效果。但现有这些天然植物饲料添加剂产品的功能相对集中而且单一，主要集中在对喂养的禽畜的肉质改善、促进生长等方面。此外，国内外研究报道较多的是天然植物对饲料的防霉和抗氧化作用，而天然植物添加剂对霉菌毒素的减毒作用方面，目前的研究报道十分有限。

因此，有必要研究开发一种新型多功能天然植物饲料添加剂，同时具备防饲料发霉、抗饲料氧化、减轻霉菌毒素(黄曲霉毒素)对生物(肝细胞)的毒性效应这三个方面的功能。

发明内容

本发明提供了一种提取物及其作为饲料添加剂的应用，该提取物不仅能够防止饲料发霉、抗饲料氧化，而且还能减轻霉菌毒素对生物的毒性效应。

一种提取物，其为公丁香的醇提物。

公丁香是丁香花蕾晒干后的花蕾干，可作为中药入药。经实验发现，公丁香的醇提物不仅可以防止饲料发霉、抗饲料氧化，而且还能减轻霉菌毒素对生物的毒性效应。

具体的，所述醇提物为乙醇提取物。上述乙醇为质量分数为95％的无水乙醇。上述醇提物是通过公丁香浸没于乙醇，然后过滤得到。

优化公丁香在乙醇中的浸没时间和温度不仅可以增加公丁香中有效成分的提取量，而且可以提高浸提物在防止饲料发霉、抗饲料氧化以及减轻霉菌毒素对生物的毒性效应上的功效。作为优选，提取时间为4～4.5h，提取温度为75～80℃。另外，采用冷凝回流浸提法可以进一步增加公丁香中有效成分的提取量，冷凝回流的温度为80℃。

将公丁香粉碎后浸提可以提高浸提效果，所以，在提取前，可将公丁香粉碎成粉末，粉末的粒径可以为30～120mesh。

将公丁香粉末浸没于乙醇中浸提后，获得的浸提液，需要进行过滤，然后蒸馏、抽提后得到膏状的醇提物(又称为浸膏)。该醇提物可以浸泡于二甲基亚砜中溶解后喷施于饲料中，也可通过喷雾干燥的方式获得固体与饲料混合。

上述提取物可以直接作为饲料添加剂，也可以作为其中一个组分与其他成分混合制成饲料添加剂；而上述饲料添加剂也可直接加入到常规的饲料中，发挥其作用。

作为优选，所述醇提物在饲料中的含量为1.0～2.0g/kg。

本发明以公丁香为原料通过乙醇浸提的方式获得醇提物，经实验发现，该醇提物不仅能够防止饲料发霉、抗饲料氧化，而且还能减轻霉菌毒素对生物的毒性效应，尤其是黄曲霉毒素对干细胞的毒害效应；以该醇提物为原料制备的饲料添加剂解决了现有技术中天然植物添加剂功能单一的问题。

附图说明

图1为本发明公丁香醇提物置于培养皿中的图片。

图2为从自然发霉的饲料中分离纯化出的五种霉菌的照片；

1：黄曲霉；2：寄生曲霉；3：雪白曲霉；4：黑曲霉；5：桔青霉。

图3为十种中草药和阳性对照苯甲酸钠对五种霉菌混合菌的抑菌效果图；

A：苯甲酸钠(阳性对照)；B：姜黄；C：苦荞；D：牛蒡子；E：淡豆豉；F：炒苍术；G：积雪草；H：山苍子；I：升麻；J：厚朴；K：公丁香。

图4为本发明实施例5中饲料贮存期间霉菌总数的变化情况。

图5为本发明实施例7中饲料贮存期间水分的变化情况。

图6为本发明实施例7中饲料贮存期间粗蛋白含量的变化情况。

图7为本发明实施例7中饲料贮存期间脂肪含量的变化情况。

图8为本发明实施例8中不同浓度的AFB1对HL-7702细胞的抑制率。

图9为本发明实施例8中不同处理方式作用后HL-7702细胞的生长状态；

A：2％DMSO空白对照组细胞；B：AFB1(21μg/mL)处理的细胞；C：公丁香提取物(30μg/mL)预作用后又暴露于AFB1(21μg/mL)的细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释和说明。

下列实施例中以九种中草药即：升麻，积雪草，苦荞，炒苍术，厚朴，牛蒡子，姜黄，山苍子，淡豆豉为对照，证明本发明公丁香的醇提物的突出功能。

下列实施例中采用的实验材料有：小猪饲料(玉米-豆粕型，购于九鼎集团，货号my0158)，山梨酸钾(国产)，霉菌稀释液(按国家标准GB13092-91制作)，高盐察氏培养基(按国家标准GB13O92-91制作)，DPPH(Sigma公司)，DMSO(Sigma公司)，维生素C(生工)，无水乙醇(生工)，硫酸亚铁晶体(生工)，水杨酸(生工)，双氧水(生工)，蒸馏水，TRIS(生工)，邻苯三酚(生工)，盐酸(生工)，RPMI-1640培养基(HyClone)，胎牛血清(四季青)，胰酶(HyClone)，青链霉素(GIBCO)，PBS磷酸盐缓冲液(HyClone)，人正常肝细胞系HL-7702(购于中科院上海细胞库)，活性氧(ROS)检测试剂盒(购于碧云天生物技术研究所)，丙二醛(MDA)试剂盒(购于南京建成工程研究所)。

实施例1 中草药醇提物的制备

取干燥的中药公丁香，进行粉碎至粒径为75mesh；取200g公丁香粉末，在500mL的无水乙醇(质量分数为95％)中浸提，加热至80℃冷凝回流4.5h(三次)得浸提液，再将浸提液过滤，取滤液45℃蒸馏15min，在0.095MPa下抽提，获得醇提物(即浸膏)；

粉碎过程中采用的是微型植物粉碎机进行粉碎；过滤时，采用四层纱布和布氏漏斗进行过滤；蒸馏过程采用旋转蒸发仪。

其他中草药(山苍子、厚朴、炒苍术、姜黄、积雪草、牛蒡子、金荞麦、升麻、淡豆豉)的醇提物采用上述相同的方法进行制备。浸提后，获得的浸膏的得率如表1所示，公丁香的醇提物如图1所示。

表1 十种中草药浸膏的得率

实施例2 饲料发霉菌的分离、纯化和鉴定

取300g小猪饲料自然发霉，湿度75％，平均温度28℃，发霉九天后按照霉菌颜色、形状挑选菌种溶于无菌水中，震荡，静置沉淀后，取上层清液。以此为母液配制梯度为10^-2～10^-8的稀释液，涂布于高盐察氏培养基上，放于28℃生化培养箱内培养6天。在初筛的霉菌平板上挑取形态单一的菌落，继续在察氏培养基上划线培养获得纯培养物。参照《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》进行真菌形态学的分类鉴定。

从自然发霉的饲料中，分离纯化出五种霉菌(如图2)，分别是：黄曲霉(Aspergillus.flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、雪白曲霉(Aspergillus niveus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)，将各霉菌菌种常规保藏。

实施例3 纸片扩散法测抑菌圈直径

以二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，配置浓度为0.3g/mL的十种中草药提取物溶液备用。取吸水力强的优质滤纸，用打孔器打成6mm的圆片，121℃高温高压灭菌20分钟，烘干3～4小时，备用。

用无菌镊子将滤纸片贴在高盐察氏培养基表面(已涂布实施例2中获得的待测发霉菌液)，轻压纸片确保其接触良好，吸取10μL 0.3g/mL的样品溶液于滤纸表面，DMSO滤纸片做空白对照，0.3g/mL山梨酸钾做阳性对照，每个样品做3个平行，霉菌培养箱28℃培养3天后，测定并比较各中草药提取物的抑菌圈直径。

上述发霉菌液即为实施例2所述的物种霉菌的混合菌悬液。实验结果为：阳性对照化学防腐剂山梨酸钾抑菌圈直径在12mm左右；空白溶媒对照DMSO几乎没有抑菌圈出现；样品组里公丁香抑菌圈直径最大在14mm左右，具强抑菌活性；厚朴抑菌圈在12mm左右，与山梨酸钾相似；姜黄和山苍子抑菌效果较弱，抑菌圈直径分别为6mm、5mm；其余中草药的抑菌效果近于无(如图3)。因此，下面防霉实验中只选取(山苍子、厚朴、姜黄和公丁香)这四个有抑菌效果的中草药进行。

实施例4 最小抑菌浓度MIC值的测定

吸取已经活化的混合霉菌液100μL接种于100mL无菌的MH肉汤培养基中，180r/min摇床培养，与麦氏比浊管进行比较，调整菌液浓度为10⁶cell/mL待用。

96孔中1孔为空白对照组，200μLMH肉汤培养基；2孔为正常生长对照组，150μL10⁶cell/mL菌液和50μLMH肉汤培养基；3孔为150μL10⁶cell/mL菌液和50μLDMSO；其它孔为样品组：150μL10⁶cell/mL菌液和50μL不同浓度的样品溶液，所有组和浓度均设3个复孔。放入28℃培养箱培养20小时后，进行涂布。连续观察两周，无菌生长的那一孔中药液的浓度即为最低抑菌浓度(MIC)。

将公丁香、厚朴、姜黄、山苍子的提取物进行MIC值的测定。结果显示：阳性对照山梨酸钾的MIC值是70mg/mL，公丁香、厚朴、姜黄、山苍子的MIC值分别是20mg/mL、30mg/mL、63mg/mL、65mg/mL，因此，这四种有抑菌效果的中草药提取物的抑制霉菌能力大小为：公丁香＞厚朴＞姜黄＞山苍子。

实施例5 饲料防霉效果评价试验

取姜黄浸膏0.45g、山苍子浸膏0.45g、厚朴浸膏0.45g、公丁香浸膏0.45g，分别溶解于10mL的二甲基亚砜中，再均匀喷施于0.3kg的小猪饲料上，使饲料与上述溶液混合均匀；然后置于自然环境下储放，每3天进行一次饲料的感官评定：包括饲料气味、成团、结块程度、霉变情况，同时进行饲料中霉菌总数检测，从各袋中用取样器均匀取样，样品放入已知编号的灭菌塑料袋，带回实验室检测霉菌数量(GB13092-91)。

提取物抑菌率的测定方法见GB13092-91《饲料中霉菌检测方法》：

提取物的抑菌率(％)＝(对照样品的霉菌含量-试验样品的霉菌含量)/对照样品的霉菌含量×100％。

将公丁香、厚朴、姜黄、山苍子四种中草药继续进行配合饲料的防霉效果评价实验，整个实验期间(9～10月份)平均室温为24℃，平均相对湿度为73％。

(1)饲料外观的感官评定

在整个实验期间每3天对试验样品的气味、成团、结块和霉变情况进行观察记录，结果见表2。

表2 饲料外观的变化

(2)饲料霉菌总数的变化

每3天对饲料中霉菌总数的检测结果见图4。实验数据表明在饲料中添加防霉剂能降低饲料中霉菌的数量，由于实验所选用的饲料原料水分含量较低，故实验开始时饲料中的霉菌含量不是很高。当贮存至3天时，各组饲料中霉菌总数变化不大，各实验组间差异不明显。这可能是因为前期空气比较流通，环境气温偏低不适宜霉菌生长。当贮存至10天时，霉菌数量骤长，处于爆发期。当贮存至16天时，其中添加公丁香浸膏和厚朴浸膏的饲料中霉菌总数显著低于其他三组，以公丁香组总数最少。这说明公丁香和厚朴都具有防霉抑菌作用，但公丁香的防霉效果最好。

(3)中草药提取物的抑菌率计算

根据试验获得数据，利用抑菌率公式获得四种有效中草药的抑菌率：公丁香提取物抑制饲料发霉效果最好，抑菌率为60％，厚朴52％、姜黄12％、山苍子14％。

实施例6 抗氧化活性的检测

1、DPPH自由基清除能力的测定

取20μL不同浓度的中草药提取物溶液加样至96孔板中，再在每个孔中平行加入180μL DPPH，之后将96孔板放置在避光环境下反应30分钟，使药品与DPPH充分反应，在波长490nm处测定吸光值A_i；对照组以20μL无水乙醇代替药品，其它条件不变吸光值记为A₀。并按以下公式计算清除率E(％)。清除率E(％)＝(1-A_i/A₀)×100％。

从表3可以看出，以IC₅₀为标准，对DPPH自由基的清除能力由高到低为：公丁香＞山苍子＞升麻＞积雪草＞苦荞＞炒苍术＞淡豆豉＞厚朴＞牛蒡子＞姜黄。公丁香的DPPH自由基清除能力与阳性对照V_C最接近。

表3 十种中草药提取物对DPPH自由基的清除作用

2、羟自由基清除能力的测定

先在96孔板中加入1.25g/L硫酸亚铁溶液和0.622g/L水杨酸-乙醇溶液各45μL，再加入90μL不同浓度的中草药提取物溶液，最后加入20μL4.4mol/L H₂O₂溶液启动反应。将96孔板放置在37℃培养箱中30分钟，使药品与试剂充分反应，在波长490nm处测定吸光值A_i；对照组(A₀)用90％DMSO溶液代替样品；考虑到样品本身的吸光度，用90％DMSO溶液代替4.4mol/L H₂O₂作为无自由基反应时的空白对照组(A_i0)。并按以下公式计算清除率E(％)：清除率E(％)＝{A₀-(A_i-A_i0)}/A₀×100％。

从表4可以看出，以IC₅₀为标准，对羟自由基的清除能力由高到低为：公丁香＞苦荞＞厚朴＞积雪草＞山苍子＞牛蒡子＞升麻＞淡豆豉＞炒苍术＞姜黄。公丁香的羟自由基清除能力与阳性对照V_C最接近。

表4 十种中草药提取物对羟自由基的清除作用

3、超氧阴离子自由基清除能力的测定

加入5mLTRIS-HCl(pH8.2)于10m LEP管中，再加入不同浓度的中草药提取物溶液0.1mL，4.4mL蒸馏水，混匀后在25℃水浴中保温20分钟。取出后立即加入在25℃预热过的邻苯三酚0.5mL，迅速摇匀后在335nm处，以10mmol/L HCl为参比，每隔30秒测定吸光度。以ΔA₁/Δt表示不加样品时邻苯三酚自氧化速率(对照组)；以ΔA₂/Δt表示加样品后的邻苯三酚自氧化速率(样品组)。并按以下公式计算清除率E(％)：清除率E(％)＝(ΔA₁/Δt-ΔA₂/Δt)/(ΔA₁/Δt)×100％。

从表5可以看出，以IC₅₀为标准，对超氧阴离子自由基的清除能力由高到低为：厚朴＞升麻＞公丁香＞积雪草＞姜黄＞炒苍术＞淡豆豉＞苦荞＞牛蒡子＞山苍子。厚朴的超氧阴离子清除能力与阳性对照Vc最接近，公丁香排到第三。

表5 十种中草药提取物对超氧阴离子的清除作用

通过以上三种体系，能快速、客观的初筛出具有抗氧化活性的物质。对以上三大体系的数据结果进行处理，以综合指标评价各样品的综合抗氧化能力，具体处理方法：将各体系的评估结果按优劣进行排序，排名最优的样品所对应的抑制率或IC₅₀的数值以E_n表示，以此类推，E_min表示在此体系中效果最差中药的抑制率或IC₅₀的数值。每味中药在不同体系下的积分以a_n表示，a_n＝|E_n-E_min|；A代表每味中药在3大体系中的总积分，则A＝a₁+a₂+a₃，A值越大，体外抗氧化活性越好。

对以上三大体系的数据结果进行处理，以综合指标评价各样品的综合抗氧化能力，将在三个实验体系中均能得出有效实验结果的中草药进行抗氧化活性比较。由表6可知，综合抗氧化能力大小为：公丁香＞苦荞＞厚朴＞积雪草＞山苍子＞升麻＞牛蒡子＞炒苍术＞淡豆豉＞姜黄。可见，公丁香是综合抗氧化能力最强的中草药。

表6 中草药提取物抗氧化性能的分值

实施例7 醇提取物预混饲料后饲料中水分、粗蛋白、脂肪变化的测定

将抗氧化综合得分最高的提取物与饲料预混后，分别按照国标GB/T6435-2006、GB/T 6432-1994、GB/T 6433-2006中关于饲料中粗水分、蛋白质和脂肪的测定方法进行测定。

将以上防霉和抗氧化实验中表现最好的公丁香提取物与饲料预混后，检测饲料贮藏期间的营养流失情况。

试验分组见表7：1个对照组(试验1组)、2个试验组(试验2、3组)。

表7 试验的分组及防霉剂添加量

(1)饲料中水分的变化测定

影响饲料霉变的最主要因素是饲料本身的水分含量和外界的环境状况。因此，严格控制饲料原料中的水分含量对于防止饲料产品霉变尤为重要。试验选择的饲料原料均符合标准，试验开始时测得其水分为10.54％，之后每隔15天测定水分含量。

由图5可以看出，随着贮藏时间的延长，各组饲料中水分均有不同程度的增加，但各组间差异并不明显。从总体上看，添加防霉剂对饲料水分产生的影响不大。整个试验期间，试验2组饲料水分几乎始终保持最低，这在某种程度上说明了公丁香提取物具有较好的防霉保鲜效果。

(2)饲料中粗蛋白变化的测定

试验开始时饲料粗蛋白含量为16.76％，由图6可知，随着贮存时间的延长，粗蛋白含量有所下降。试验结束时，试验1组和试验2组的粗蛋白含量分别为14.78％和15.12％，都高于试验3组，且试验2组饲料粗蛋白含量相对较高。

(3)饲料中脂肪变化的测定

试验开始时饲料中粗脂肪含量为5.78％，由图7可知，随着贮存时间的延长，脂肪含量显著下降。当贮存至30天时，试验3组粗脂肪含量为2.35％，显著高于其他三组。试验结束时，试验2组粗脂肪含量为0.95％。显著高于试验1组(0.51％)和试验3组(0.76％)。因而，饲料中添加公丁香提取物有效地减少了饲料营养成分的损失，这与公丁香提取物的良好抗氧化性能密切相关。

实施例8 AFB1和中草药提取物对H L-7702细胞的作用

HL-7702细胞常规培养，培养基(RPMI-1640培养基、10％胎牛血清、1％双抗)，于5％CO₂，37℃培养。将处于对数生长期的HL-7702细胞按每孔5000个的浓度接入96孔板中，次日细胞处理如下：(1)AFB1损伤模型建立(求AFB1的IC₅₀值)：分别加入含60、50、40、30、20、10、5μg/mLAFB1的1640培养液，每一浓度设3个复孔，48小时后，MTT比色法检测细胞存活率，计算AFB1对HL-7702细胞的IC₅₀值。1％DMSO组作为本底对照。(2)中草药提取物对肝细胞AFB1损伤的减轻作用：空白对照组为1％DMSO+AFB1(IC₅₀浓度)；2％DMSO组作为本底对照。样品组：加入不同浓度的中草药提取物溶液(具体浓度见实验结果)，每一浓度设3个复孔，预处理HL-7702细胞48小时，再加入AFB1的IC₅₀浓度，继续培养48小时后MTT比色法检测细胞存活率。

HL-7702细胞经不同剂量组AFB1(60、50、40、30、20、10、5μg/mL)作48小时后，细胞生长均受到了不同程度的抑制，且抑制作用随AFB1浓度升高而加强，见表8。经分析后得出AFB1对HL-7702细胞的IC₅₀浓度为21μg/mL，见图8。因此，后面就以AFB1的IC₅₀浓度(21μg/mL)建立肝细胞损伤模型。

表8 不同浓度AFB1对HL-7702细胞增殖的影响

加入不同浓度公丁香提取物预处理HL-7702细胞48小时后再加入21μg/mL AFB1处理48小时，MTT比色法检测细胞存活率，规定提取物对AFB1 IC₅₀处理的细胞存活率大于70％为有损伤减轻作用。实验结果见下表9：以2％DMSO对照组存活率为100％计；不预处理公丁香提取物(代之以等量DMSO)只接受AFB1IC₅₀浓度处理的HL-7702存活率为48％左右；而经浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL的公丁香提取物预处理后，随着浓度的提高，HL-7702的存活率也提高，在预处理公丁香提取物终浓度为30μg/mL时细胞存活率达到了81.7％(大于70％)，P＜0.01，认为该浓度有损伤减轻作用。同时观察到，经公丁香提取物预处理的细胞，细胞数目与对照组比较无明显减少，且细胞生长状态良好，见图9。

表9 不同浓度公丁香提取物对AFB1处理的HL-7702细胞存活率的影响

实施例9 细胞内丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)的检测

收集经处理后的细胞，用冰的PBS洗涤后加1mLPBS制成单细胞悬液，计数；然后在冰上用超声破碎机200V，30S，间隔5S，3次破碎细胞。

以硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA，按试剂盒说明书加样，同时设定空白管、标准空白管及标准管，紫外分光光度计在532nm处检测MDA吸光度。细胞内MDA的含量以nmol/10⁶细胞表示。

以二氛荧光素双乙酸(DCFH-DA)法测定细胞内ROS。按照试剂盒说明书操作步骤进行，破碎的细胞被孵育在终浓度为10nmol/L的DCFH-DA，37℃温箱30分钟，细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，然后在激发波长488nm和发射波长525nm下检测DCF荧光强度。以DCF nmol/10⁶细胞浓度反映细胞内过氧化代谢产物活性氧ROS水平。

以上两实验本底对照组均为含2％DMSO的培养基；空白对照为AFB1组，其加入AFB1的量为1μL，使其终浓度为21μg/mL，为保持与公丁香提取物预处理组的平衡，该组在加入AFB1前48小时，加入1μLDMSO取代样品组的1μL公丁香提取物溶液。

MDA和ROS是被公认的脂质过氧化损伤的标志，因此检测细胞MDA和ROS水平可以反映细胞的脂质过氧化损伤情况，结果表10：HL-7702细胞经AFB1 21μg/mL处理48小时后，MDA和ROS水平均显著高于2％DMSO对照组，P＜0.01；而经公丁香提取物30μg/mL预处理48小时后明显抑制了AFB1诱导的MDA和ROS形成，P＜0.01。

表10 各组细胞的MDA水平(nmol/10⁶细胞)

附注1：^*与对照组比较，P＜0.01；^**与AFB1组比较，P＜0.01。

Claims (8)

1.一种提取物，其特征在于，所述提取物为公丁香的醇提物。

2.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述醇提物为乙醇提取物。

3.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，提取时间为4～4.5h，提取温度为75～80℃。

4.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，提取前，公丁香经粉碎。

5.如权利要求4所述的提取物，其特征在于，粉碎后的粒径为30～120mesh。

6.如权利要求1～5任一项所述的提取物作为饲料添加剂的用途。

7.一种包含权利要求1～5任一项所述提取物的饲料。

8.如权利要求7所述饲料，其特征在于，所述醇提物在饲料中的含量为1.0～2.0g/kg。