CN104830926B - 一种均相酶解纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种均相酶解纤维素的方法，以分子量为20000单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺为修饰剂，定点修饰市售纤维素酶的巯基，制得修饰纤维素酶，标记为Cell‑Mal 20k；用合成的修饰酶Cell‑Mal 20k在氢氧化钠/尿素水溶液中均相酶解纤维素，反应温度30℃，反应时间1h,体系pH值13.98，反应结束后，冷却至‑10℃，Cell‑Mal 20k与产物相分层，分别回收Cell‑Mal 20k和产物相，Cell‑Mal 20k无需处理，可直接循环使用。本发明的特点在于所制备的修饰纤维素酶稳定性高且具有温敏性，在强碱性的氢氧化钠/尿素水溶液中仍能保持高的活性和温控性，实现了酶的高效回收和重复使用，为纤维素提供了一条高效酶解的新途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种在NaOH/尿素/纤维素均相体系下，聚乙二醇马来酰亚胺修饰纤维素酶均相酶解纤维素及其温控分离的方法。
背景技术
纤维素是全球再生量最大的生物质资源，每年生物合成量超过500亿吨。纤维素高值化利用的关键在于如何使其高效降解成单糖，进而可以转化成用途广泛的重要化学品或燃料。因此从长远考虑，实现纤维素高效转化成单糖是解决化石资源日益减少所带来的全球资源危机的有效途径之一。
目前纤维素降解方法包括物理法、化学法和生物法，其中生物法是指利用纤维素酶对纤维素中β-糖苷键进行特异性水解，从而制得糖类化合物的一种有效方法，具有对环境友好，能耗低，副产物少等优点，被认为是最具应用前景的转化途径。但是，由于纤维素是线性长链高分子聚合物，其分子中的羟基易和分子内或相邻分子上的含氧基团形成强氢键作用，使纤维素分子共同组成结晶结构，该结构使纤维素显示出刚性和高度水不溶性，大大减弱了纤维素酶对纤维素的可及性，导致纤维素的转化率低，酶解周期长，成本高。因此，需要寻找对纤维素有高效溶解能力的溶剂，以瓦解纤维素的这种高度结晶结构，有利于纤维素酶与纤维素的有效接触，促进其酶解。目前，对纤维素具有良好溶解能力的溶剂有N-甲基吗啉-N-氧化物(NMMO)、氯化锂/二甲基乙酰胺(LiCl/DMAc)体系、氨基甲酸酯体系和离子液体等，这些溶剂在不同程度上存在着价格高、溶解条件苛刻、易挥发、回收困难、所得溶液粘稠等问题，极大地限制了纤维素的应用。2005年武汉大学的张俐娜老师开发了新一类溶解纤维素的溶剂体系，NaOH/尿素、NaOH/硫脲、LiOH/尿素水溶液体系，其中NaOH/尿素体系以其廉 价和高效的溶解性能成为大家关注的热点。采用7wt％NaOH/12wt％尿素水溶液预冷至-12℃,它能迅速溶解纤维素(重均分子量Mw为1.2×105)得到透明的溶液(5min内完全溶解)。该纤维素溶液在0～5℃的范围内能够长时间保持稳定的溶液态(约1周)。这种新溶剂体系采用了最经济、最普通的化工原料，且所用的化学原料容易回收,可循环使用，因此该体系被认定是新一代无污染的绿色纤维素新溶剂。在该体系下,溶剂小分子更易与纤维素上的-OH基团结合形成新的氢键网络从而破坏纤维素原有的分子内和分子间氢键，使得纤维素在小分子溶剂的包合下，以链状形式均匀分布于水中，得到透明的纤维素溶液。若能在该体系下实现均相酶解，同时反应后将纤维素酶分离出来，进行循环利用，那么富含还原糖的NaOH/尿素体系就可通过pH的调节以适应后期发酵生产。可以设想，按照以上的研究思路，一个高效绿色的纤维素利用体系将被建立。
发明内容
本发明的目的是创制具有高效高稳温敏的纤维素酶，以实现在NaOH/尿素体系下纤维素的均相酶解及纤维素酶的有效回收。
本发明的技术方案是这样实现的：将7wt％NaOH/12wt％尿素水溶液预冷至-12℃，然后加入微晶纤维素，得到均相溶液，pH值为13.98，纤维素占溶剂的重量比5-10％。在30℃下加入修饰纤维素酶，加入量为每毫升溶剂0.5-5mg，反应1小时，纤维素转化成还原糖的转化率在70-80％。反应结束后，体系降温到-10℃，修饰酶主动从反应体系中析出，可直接回收利用。
本发明采用的修饰纤维素酶是这样得到的：在30-35℃下，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH＝7.0)中，加入天然纤维素酶，待其完全溶解后，缓慢加入等质量的分子量20000聚乙二醇马来酰亚胺，混合均匀后，恒温反应3小时，停止反应，通过透析纯化得到修饰纤维素酶，标记为Cell-Mal 20k。
本发明采用的纤维素酶，酶活力：1800u/毫克，最佳pH:4.8，最佳温度50℃。
本发明采用微晶纤维素原料的分子量2.5～5万，聚合度153～300，灰分＜0.6％，粒径25～190μm。
发明效果
本发明提供的新型修饰纤维素酶，能在强碱性NaOH/尿素体系下表现出良好的活性和稳定性及温敏性，很好地促进纤维素降解，并可高效回收纤维素酶。使用本发明的方法可提高天然纤维素酶抵制环境引起酶失活的能力，从而提高了酶的催化活性，在反应过程中始终保持较高的催化活性，并可实现酶的高效回收和重复使用，具有明显的先进性，将为纤维素资源的综合利用提供一条新的途径。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明，并非限制本发明所涉及的范围。
实施例1：
微晶纤维素原料：分子量2.5～5万，聚合度153～300，灰分＜0.6％，粒径25～190μm。
还原糖量的测定方法
DNS试剂：1.6g DNS和21g NaOH，加入到200mL水中溶解，185g酒石酸钾钠溶于500mL水中，与上溶液混合加入5g结晶酚，5g无水亚硫酸钠搅拌溶解，冷却定容于1000mL容量瓶，储于棕色瓶中7-10天后使用。
葡萄糖标准曲线：将葡萄糖在105℃下烘干2h至恒重，精确称取0.1g用蒸馏水溶解，并定容到100mL此浓度为1.0mg/mL。取10支20mL的具塞刻度试管，依次加入0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、 1.4mL、1.6mL、1.8mL葡萄糖标准溶液，然后每支试管中加入蒸馏水，总体积为2.0mL，再分别加入0.5mL DNS试剂，摇均后在沸水中准确放置5min，取出用流水迅速冷却，用蒸馏水定容至20mL，充分摇均后静置20min。最后在波长540nm处测各比色管中溶液的吸光值A，以吸光值作纵坐标，相应葡萄糖浓度C(mg/mL)作横坐标，得到葡萄糖标准曲线。
在装有温度计、冷凝管和转子的50mL三口瓶中加入15mL pH＝7.00.1M的现配柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；设定水浴加热温度为35℃，待瓶内温度稳定后加入150mg纤维素酶粉末，缓慢搅拌溶解；称取150mg分子量20000的单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺作为修饰剂，并开始计时，混合均匀；反应3h后，反应液通过透析袋(截留20k大分子)在pH＝4.80.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中透析过夜；得到纯化修饰纤维素酶液，冻干得到修饰纤维素酶粉。记作Cell-Mal 20k，4℃下保存。
称取7.5g 7wt％NaOH/12wt％尿素水溶液于100mL三口瓶中，降温到-12℃，加入375mg微晶纤维素(5％w/w)溶解5分钟，得到均相溶液，体系pH值13.98。在此均相溶液中加入15.0mg的Cell-Mal 20k，30℃下反应1小时后，取0.5mL反应酶液，加入1.5mLDNS试剂，沸水终止反应显色5min，冰水冷却至室温，蒸馏水定容至20mL。在540nm下测定吸光度值，代入标准葡萄糖曲线，得到还原糖量达到4.25mg/mL，纤维素转化为还原糖的转化率为70％。反应结束后，体系降温到-10℃，修饰酶自动从体系中析出，经离心后回收，无需任何处理，直接回用。
实施例2：
微晶纤维素原料：分子量2.5～5万，聚合度153～300，灰分＜0.6％，粒径25～190μm。
还原糖量的测定方法和修饰酶的制备方法：参见实施例1。
称取7.5g 7wt％NaOH/12wt％尿素水溶液于100mL三口瓶中，降温到-12℃，加入450mg微晶纤维素(6％w/w)溶解5分钟，得到均相溶液，体系pH值13.98。在此均相溶液中加入15.0mg的Cell-Mal 20k，30℃下反应1小时后，取0.5mL反应酶液，加入1.5mLDNS试剂，沸水终止反应显色5min，冰水冷却至室温，蒸馏水定容至20mL。在540nm下测定吸光度值，代入标准葡萄糖曲线，得到还原糖量达到4.37mg/mL，纤维素转化为还原糖的转化率为72％。反应结束后，体系降温到-10℃，修饰酶自动从体系中析出，经离心后回收，无需任何处理，直接回用。
实施例3：
微晶纤维素原料：分子量2.5～5万，聚合度153～300，灰分＜0.6％，粒径25～190μm。
还原糖量的测定方法和修饰酶的制备方法：参见实施例1。
称取7.5g 7wt％NaOH/12wt％尿素水溶液于100mL三口瓶中，降温到-12℃，加入600mg微晶纤维素(8％w/w)溶解5分钟，得到均相溶液，体系pH值13.98。在此均相溶液中加入35.0mg的Cell-Mal 20k，30℃下反应1小时后，取0.5mL反应酶液，加入1.5mLDNS试剂，沸水终止反应显色5min，冰水冷却至室温，蒸馏水定容至20mL。在540nm下测定吸光度值，代入标准葡萄糖曲线，得到还原糖量达到4.55mg/mL，纤维素转化为还原糖的转化率为75％。反应结束后，体系降温到-10℃，修饰酶自动从体系中析出，经离心后回收，无需任何处理，直接回用。
实施例4：
微晶纤维素原料：分子量2.5～5万，聚合度153～300，灰分＜0.6％，粒径
25～190μm。
还原糖量的测定方法和修饰酶的制备方法：参见实施例1。
称取7.5g 7wt％NaOH/12wt％尿素水溶液于100mL三口瓶中，降温到-12℃，加入600mg微晶纤维素(8％w/w)溶解5分钟，得到均相溶液，体系pH值13.98。在此均相溶液中加入40.0mg的Cell-Mal 20k，30℃下反应1小时后，取0.5mL反应酶液，加入1.5mLDNS试剂，沸水终止反应显色5min，冰水冷却至室温，蒸馏水定容至20mL。在540nm下测定吸光度值，代入标准葡萄糖曲线，得到还原糖量达到4.85mg/mL，纤维素转化为还原糖的转化率为80％。反应结束后，体系降温到-10℃，修饰酶自动从体系中析出，经离心后回收，无需任何处理，直接回用。
实施例5-11：
实验条件与步骤同实施例1，只是将修饰酶改为实施例1中回收的修饰酶，进行六次重复回用实验，回用结果见表1。
表1修饰酶的重复回用结果
Claims (1)
1.一种均相酶解纤维素的方法，其特征在于以分子量为20000单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺为修饰剂，定点修饰市售纤维素酶的巯基，制得修饰纤维素酶，标记为Cell-Mal20k；用合成的修饰酶Cell-Mal 20k在氢氧化钠/尿素水溶液中均相酶解纤维素，反应温度30℃，反应时间1h,体系pH值13.98，反应结束后，冷却至-10℃，Cell-Mal 20k与产物相分层，分别回收Cell-Mal 20k和产物相，Cell-Mal 20k无需处理，可直接循环使用。
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