CN104830916A - 一种发酵木质纤维素离子液体水解液制备脂肪酸的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用木质纤维素离子液体水解液发酵生产脂肪酸的方法，利用大肠杆菌菌株DQ430在有氧条件下，加水调节水解液的总糖浓度在10～50g/L，分批或分批补料发酵产脂肪酸，发酵24～72h，脂肪酸浓度可达3～15g/L，糖的利用率为60～90％，生产强度达到0.063～0.313g/L-h，本发明的突出优点是利用竹子粉作为原料替代昂贵的葡萄糖作为碳源发酵生产脂肪酸，利用可再生生物质资源，对环境友好，可缓解化学合成脂肪酸的石化资源紧张问题。

Description

一种发酵木质纤维素离子液体水解液制备脂肪酸的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用木质纤维素离子液体水解液发酵生产脂肪酸的方法，同时涉及大肠杆菌(Escherichia coli)在以竹子粉为原料制备脂肪酸的方法中的应用。
背景技术
脂肪酸(fatty acid)是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，直链饱和脂肪酸的通式是C(n)H(2n+1)COOH，低级的脂肪酸是无色液体，有刺激性气味，高级的脂肪酸是蜡状固体，无可明显嗅到的气味。脂肪酸是最简单的一种脂，它是许多更复杂的脂的组成成分。脂肪酸在有充足氧供给的情况下，可氧化分解为CO2和H2O，释放大量能量，因此脂肪酸是机体主要能量来源之一。
脂肪酸是一类羧酸化合物，由碳氢组成的烃类基团连接羧基所构成。脂肪酸在生物体内与甘油形成三羧酸甘油酯，为脂肪主要成分。脂肪酸还可与磷酸、胆碱、鞘氨醇合成鞘磷脂，与糖结合生成糖脂等，为生物体细胞膜的重要组分。脂肪酸可作为特殊化学品用于食品、医药、农业领域。而在能源问题和环境问题日益严重的今天，脂肪酸最吸引人的地方是其可衍生化为生物柴油和生物汽油，用于制成混合生物燃料或易降解的塑料。
目前脂肪酸的生产主要以动物油或植物油为原料，采用高温高压水解或酶法水解的方式，以及石蜡氧化法等，国际市场的价格依据其成分和纯度不同为500～8000美元/吨。然而，从植物或动物中得到的脂肪酸成分不均一，性能不稳定，存在批次差异，动物来源的脂肪酸可能有微量内毒素，影响其应用于医药、食品工业。目前，越来越多的注意力转移到利用微生物生产脂肪酸的方向上来(Cell Fact.，2012，11：51-59)。天然微生物的产脂肪酸能力非常低，不足细胞重量1％。因此，必须运用生物工程技术对现有产脂肪酸微生物进行改造。目前主要的研究进展集中在单细胞藻类、假单胞菌、酵母菌以及大肠杆菌上(Metab.Eng.，2013，17：23-29)。近来利用可再生资源用微生物发酵合成的方法生产生物燃料得到人们的广泛关注，比如来自森林或农业废弃物的木质纤维素就备受青睐。
木质纤维素是一种廉价的可再生资源，其储量非常丰富。如果把地球上每年由光合作用形成的纤维素物质全部有效地利用起来，所产生的能量远远超过全世界每年所消耗的能量。然而，到目前为人类对其利用效率非常低，全球每年产生的生物质总量约2.9x1021焦耳的能量，但是利用率才将近7％。天然纤维素来源广泛，但其复杂的结构特征、较高的结晶度和分子间与分子内存在大量的氢键，使其不溶于水及普通有机溶剂，这已成为纤维素生物质开发应用的最大障碍。而用离子液体处理时，它能够破坏纤维素的复杂结构，降低其结晶度，从而促进纤维素的进一步高效糖化，提高此类生物质的利用率。
离子液体作为一种极具前景的绿色溶剂，以其优良的溶解性、强极性、不挥发、不氧化、对水和空气稳定等特点而受到广泛关注。有关利用离子液体处理生物质得到还原糖的研究有一些报道，哈尔滨工业大学巩桂芬等人合成了不同种类的离子液体，并用其处理纤维素生物质可发酵还原糖。天津工业生物技术研究所王钦宏等人对一种离子液体作用水解生物质生产可发酵还原糖的新方法进行报告。
众所周知，竹子中含有大量的木质纤维素，是一种非常宝贵的绿色无污染可再生资源。我国的中国的竹类资源非常丰富，有竹类植物40属，400多种，约占世界竹类种质资源的1/3。每年可砍伐毛竹4亿多枝，杂竹300万t，相当于1000万m3木材的量。竹子价格低廉，是非常方便易得的原料，广泛应用于各个行业。但是目前竹子的利用率很低，造成了竹子资源的极大浪费，严重影响其经济效益。因此，研究以竹子为原料的发酵方法，使其得到充分利用，既能保护环境、节约资源又能提高经济效益、造福大众。
我国是一个人口众多但是粮食相对短缺的国家，每年大量由国外进口粮食。以粮食为原料的生物发酵法生产脂肪酸会消耗大量粮食，而利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸，做到了不与人争粮，有利于缓解粮食危机。目前发酵生产脂肪酸的原料有葡萄糖、秸秆、玉米芯等，利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸酸，扩展了脂肪酸发酵的原料来源，为脂肪酸的生产提供了新思路。关于利用发酵生产脂肪酸的研究也有一些报道，像公布号为CN 104388479 A，涉及一种利用餐厨垃圾厌氧发酵产短链脂肪酸的方法，使用的原料为餐厨垃圾；像公布号CN104099380 A，名为一种利用污泥厌氧发酵生产脂肪酸的方法，使用污泥作为原料。目前，以木质纤维素水解液，特别是竹子粉为原料发酵生产脂肪酸的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术存在的问题，提供一种利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸的方法，同时提供竹子粉在制备脂肪酸中的应用及大肠杆菌(Escherichia coli)在以竹子粉为原料制备脂肪酸的方法中的应用。
本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸的方法，包括以下步骤：
1.一种利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将竹子粉碎得到竹子粉，将竹子粉过80目筛子，基于离子液体进行酸水解或酶水解竹子粉得到木质纤维素水解液直接用于配制培养基或置于-20℃冰箱备用；
(2)将新鲜的或解冻后的水解液加水调整总糖浓度至10～50g/L，加入氮源、无机盐、pH缓冲剂配制成脂肪酸发酵培养基；
(3)将平板上的大肠杆菌(Escherichia coli)DQ430接入种子培养基中，在有氧培养箱培养16～20h。
所述的大肠杆菌(Escherichia coli)DQ430，为本实验在大肠杆菌MG1655的基础上，敲除了FadD基因，并将携带了酰基载体蛋白硫酯酶基因的质粒PTrc-DQTE转入其中所得到的工程菌。然后在不同浓度的离子液体中进行传代培养，使最终得到的大肠杆菌DQ430能耐受一定浓度的离子液体。
所述的种子培养基的成分及其浓度为：蛋白陈10～20g/L，酵母粉5～10g/L，NaCl 5～10g/L。
(4)将培养好的大肠杆菌接种至发酵培养基中，接种量为5～10％(v/v)，在有氧环境中发酵，pH缓冲剂调节pH在6.0～7.0，并在30～37℃发酵24～72h，即可得到脂肪酸。
所述的发酵培养基的成分及其浓度为：总糖10～50g/L，氮源10～40g/L，K2HPO41～5g/L，CaCl20.5～1g/L，，NaCl 0.5～2g/L，(NH4)2SO40.5～2g/L，MgCl20.5～1g/L。
所述的pH缓冲剂是碳酸盐、氨水、NaOH，所述的碳酸盐为碱式碳酸镁或碳酸钠，所述的发酵条件为有氧。
所述的氮源包括有机氮源和无机氮源；所述的有机氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米浆、豆饼粉，所述的无机氮源包括尿素、硫酸铵。
所述的发酵方式可采用分批发酵、分批补料发酵或连续发酵。
所述处理方法包括：
(1)酸解法：足量离子液体熔融后，与竹子粉、氯化铜和10％(v/v)盐酸在100℃搅拌反应4～5h，抽滤后加入50％(w/w)氢氧化钠使其分层，快速混匀30min，使用离心机快速离心所得下层清液即为用于发酵的水解液。
(2)酶解法：足量离子液体与竹子粉在120℃搅拌反应3h后，加水抽滤，并用水洗4～6次，得到处理过的纤维素，经80℃干燥6h后，加入纤维素酶在pH为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中反应24h。抽滤所得水解液用于发酵。
所述离子液体为：1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑溴盐、1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐、1-辛基-2，3-二甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑四氟盐。
分析方法：
样品处理：发酵液在室温下12000RPM，离心10min，取上清，然后用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，用高效液相色谱(HPLC)检测发酵液脂肪酸及还原糖浓度。
有机酸测定：：发酵液中的各种有机酸的浓度由液相色谱分析仪检测，检测器为紫外检测器(Agilent Technologies，G1315D)及示差折光检测器(Agilent Technologies，G1362A)，分析柱为HPX-87H column(300mm×4.6mm，Bio-Rad)。柱温为25℃，流动相为pH 2.5，5mmol/LH2SO4溶液，流速为0.6mL/min，进样量为20μL。
还原糖测定：3，5一二硝基水杨酸法(DNS)，测定时以葡萄糖为标准物质。取182g酒石酸钾钠溶于500mL热水中，于热溶液中依次加入262mL的2mol/L NaOH溶液、6.3g 3，5-二硝基水杨酸、5.0g苯酚、5.0g无水亚硫酸钠，搅拌至试剂完全溶解。待溶液冷却后，转入到1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，贮存于棕色试剂瓶中，避光保存一周后使用。绘制葡萄糖标准曲线。在比色管中加入1.5mL的DNS试剂和2mL反应液样品，在沸水中加热5min。反应完成后冷却至室温。用JASCO-530型分光光度计，在540nm波长下测定样品的吸光度。
生物量测定：生物量采用上海精密科学仪器公司生产的723N型可见光分光光度计测定，使用波长为600nm。样品先用0.2M HCI进行处理，溶解所含的MgCO3，12000RPM离心10min，再用蒸馏水洗三次，以除去所含的色素及杂质。
脂肪酸产率(％)定义为每消耗1g还原糖所产生脂肪酸的克数。
本发明的突出优点和有益效果：
以竹子粉为原料发酵生产脂肪酸，游离脂肪酸浓度可达3～15g/L，糖的利用率为60～90％，游离脂肪酸的产率达到了20％～30％，生产强度达到0.063～0.313g/L-h。
利用廉价的竹子粉原料替代昂贵的葡萄糖或粮食作物为碳源发酵生产脂肪酸，一方面能充分利用大量的竹子资源，以防止资源的浪费，同时，可以节约葡萄糖等昂贵的资源，减少生产的成本；另一方面可以调节糖价，保障农民权益。
利用可再生生物质资源生产脂肪酸，可以降低发酵生产成本，与石化法处理得到及动植物来源的脂肪酸进行市场竞争。在缓解化学合成脂肪酸的石化资源紧张问题的同时，对环境友好，可再生资源的利用，也是走可持续发展道路的必然选择。
附图说明
图1是本发明采用5L发酵罐分批发酵水解液产脂肪酸的发酵结果图。
具体实施方式
以下是本发明所述的利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸的方法的具体实施例，但对本发明没有限制。
实施例1
不同处理方式得到的水解液对竹子粉发酵产脂肪酸的影响
分别通过酸解法、酶解法两种方法利用离子液体对竹子粉进行水解，得到木质纤维素水解液。
(1)酸解法：足量离子液体熔融后，与竹子粉、氯化铜和10％(v/v)盐酸在100℃搅拌反应4～5h，抽滤后加入50％(w/w)氢氧化钠使其分层，快速混匀30min，使用离心机快速离心所得下层清液即为用于发酵的水解液。
(2)酶解法：足量离子液体与竹子粉在120℃搅拌反应3h后，加水抽滤，并用水洗4～6次，得到处理过的纤维素，经80℃干燥6h后，加入纤维素酶在pH为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中反应24h。抽滤所得水解液用于发酵。
将大肠杆菌DQ430的菌株的平板在培养20h后，用接种环接一环至30mL种子培养基中，在普通培养箱中37℃培养18～20h，按照8％接种量接入初始总还原糖20g/L发酵培养基的250mL三角瓶，装液量为40mL，30℃有氧发酵培养72h。实验结果如表1。
表1 不同处理方法对大肠杆菌产脂肪酸的影响
从表1可以看出：利用离子液体采用不同的处理方式得到的水解液有氧分批发酵产脂肪酸时，使用酶解法时，脂肪酸的产量和产率最高，分别达到4.32g/L和0.24g/g还原糖。
实施例2
不同初始总糖浓度对木质纤维素水解液发酵产脂肪酸的影响
使用酶解法得到木质纤维素离子液体水解液：足量离子液体与竹子粉在120℃搅拌反应3h后，加水抽滤，并用水洗4～6次，得到处理过的纤维素，经80℃干燥6h后，加入纤维素酶在pH为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中反应24h。抽滤所得水解液用于发酵。
将大肠杆菌菌株接入种子培养基中，在普通培养箱中37℃静止培养18～20h，按8％的接种量接入装有不同初始总糖浓度发酵培养基的250mL三角瓶中，装液量为40mL，碱式碳酸镁调节pH在6.0～7.0，置于有氧培养箱中30℃发酵72h，采用HPLC测定脂肪酸含量。结果见表2。
表2 不同水解液初始总糖浓度对脂肪酸产量的影响
由表2可知：不同初始总还原糖浓度的水解液有氧分批发酵生产脂肪酸时，初始总还原糖浓度为40g/L时，脂肪酸的产量最高，达到6.72g/L。但是初始总还原糖浓度为20g/L时，脂肪酸的产率最高，达到0.24g/g还原糖。
实施例3
不同氮源对木质纤维素水解液发酵产脂肪酸的影响
使用酶解法得到木质纤维素离子液体水解液：足量离子液体与竹子粉在120℃搅拌反应3h后，加水抽滤，并用水洗4～6次，得到预处理过的纤维素，经80℃干燥6h后，加入纤维素酶在pH为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中反应24h。抽滤所得水解液用于发酵。
按照实施例2中大肠杆菌菌株发酵产脂肪酸的方法，将实验室构建的DQ430菌株平板在普通箱培养24h后，用接种环接一环至30mL种子培养基中，37℃培养20h，按照8％的接种量接入初始总还原糖20g/L的发酵培养基的250mL三角瓶，装液量为40mL，置于培养箱中在30℃下发酵72h，采用HPLC测定脂肪酸含量，结果见表3。
表3 不同氮源对水解液发酵产脂肪酸的影响
由表3可以观察到：最适氮源为酵母粉(4.32g/L)，其次为玉米浆(4.14g/L)，硫酸铵为氮源时较差(3.42g/L)。由以上可知，酵母粉为氮源时产量略优于玉米浆，但玉米浆价格远低于酵母粉，考虑到生产成本及产业化生产等因素，选择玉米浆作为竹子粉产脂肪酸发酵的氮源。
实施例4
5L发酵罐分批发酵产脂肪酸
使用酶解法得到木质纤维素离子液体水解液：足量离子液体与竹子粉在120℃搅拌反应3h后，加水抽滤，并用水洗4～6次，得到处理过的纤维素，经80℃干燥6h后，加入纤维素酶在pH为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中反应24h。抽滤所得水解液用于发酵。
按照实施例3中大肠杆菌菌株发酵产脂肪酸的方法，采用5L发酵罐发酵，加水稀释水解液，初始总糖浓度为40g/L，氮源为玉米浆，装液量为3L，发酵温度为30℃，发酵时间为72h，采用碳酸镁调节发酵液pH，浓度为70g/L，发酵结果见图1。
从图1中可以看出：在初始总糖浓度为40g/L，经过72h发酵，脂肪酸浓度达到6.71g/L，发酵残糖为2.01g/L，脂肪酸产率为22.31％，生产强度为0.14g/L-h。
实施例5
5L发酵罐分批补料发酵产脂肪酸
使用酶解法得到木质纤维素水解液：足量离子液体与竹子粉在120℃搅拌反应3h后，加水抽滤，并用水洗4～6次，得到处理过的纤维素，经80℃干燥6h后，加入纤维素酶在pH为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中反应24h。抽滤所得水解液用于发酵。
按照实施例4方法，在5L发酵罐中进行分批补料发酵，初始总糖浓度为50g/L，当发酵液残糖降至10g/L时，采用蠕动泵以一定的速度流加总糖浓度为150g/L的水解液，发酵液中糖浓度控制在10g/L左右，发酵72h，实验结果如表4。
表4 5L发酵罐分批补料试验结果
从表4中可以看出：在初始总糖浓度为50g/L，经过补料发酵72h，脂肪酸浓度达到14.68g/L，脂肪酸产率为30％，生产强度为0.31g/L-h。

Claims (6)

1.一种利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将竹子粉碎得到竹子粉，将竹子粉过80目筛子，基于离子液体进行酸水解或酶水解竹子粉得到木质纤维素水解液直接用于配置培养基或置于-20℃冰箱备用；
(2)将新鲜的或解冻后的水解液加水调整总糖浓度至10～50g/L，加入氮源、无机盐、pH缓冲剂配置成脂肪酸发酵培养基；
(3)将平板上的大肠杆菌(Escherichia coli)接入种子培养基中，在普通培养箱培养16～20h。
所述的种子培养基的成分及其浓度为：蛋白陈10～20g/L，酵母粉5～10g/L，NaCl 5～10g/L。
(4)将培养好的大肠杆菌接种至发酵培养基中，接种量为5～10％(v/v)，在有氧环境中发酵，pH缓冲剂调节pH在6.0～7.0，并在30～37℃发酵24～72h，即可得到脂肪酸。
所述的发酵培养基的成分及其浓度为：总糖10～50g/L，氮源10～40g/L，K2HPO4 1～5g/L，CaCl2 0.5～1g/L，NaCl 0.5～2g/L，(NH4)2SO4 0.5～2g/L，MgCl2 0.5～1g/L。
2.根据权利要求1所述的利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸的方法，其特征在于，所述的pH缓冲剂是碳酸盐、氨水、NaOH，所述的碳酸盐为碱式碳酸镁或碳酸钠。
3.根据权利要求1所述的利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸的方法，其特征在于，所述的氮源包括有机氮源和无机氮源；所述的有机氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米浆、豆饼粉，所述的无机氮源包括尿素、硫酸铵。
4.根据权利要求1所述的利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸的方法，其特征在于，所述的发酵方式采用分批发酵、分批补料发酵或连续发酵。
5.根据权利要求1所述的离子液体对竹子粉处理的两种方法，包括酸解法和酶解法。
6.根据权利要5所述的利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸衍生物的其它方法。
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