CN104830875A - 表达猪传染性胃肠炎病毒s蛋白a位点的重组猪痘病毒载体疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药领域，提供一种表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点(SA蛋白)的重组猪痘病毒载体疫苗，该疫苗包括重组猪痘病毒rSPV-SA，其包括猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点编码基因，该编码基因序列如SEQID NO.1所示，能够表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点即SA蛋白。本发明首次成功研制了表达猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点的重组猪痘病毒载体疫苗rSPV-SA，该重组猪痘病毒载体疫苗突破了猪传染性胃肠炎病毒常规灭活疫苗和弱毒疫苗的局限性，兼具有弱毒疫苗的免疫效果好和灭活疫苗的安全性高等特点，而且对人、猪等动物没有致病性，安全性较高。

Description

表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的重组猪痘病毒载体疫苗

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点(SA蛋白)的重组猪痘病毒载体疫苗，具体涉及表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的编码基因、重组猪痘病毒载体疫苗和重组猪痘病毒的制备方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of swine，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒((Transmissible gastroenteritisvirus，TGEV)引起的高度接触性传染病，可引起猪呕吐、水样腹泻。TGEV主要存在于猪的空肠和十二指肠，其次为回肠，各日龄猪均易感染。由于仔猪肠道内尚未建立稳定的微生态系统，自身抵抗力较低，对外界刺激敏感，因此，感染TGEV后常因脱水而死亡，尤以10日龄以内的仔猪发病率、死亡率最高，死亡率可高达100％。

S蛋白(Spike protein)突出于TGEV病毒粒子表面，形成典型的花瓣状突起，长约20nm。S蛋白的膜外区上分布有该蛋白的主要抗原位点、宿主细胞氨肤酶受体(pAPN)的识别位点以及一段DRTRG序列。早在1979年研究发现，S蛋白具有对TGEV的免疫保护作用。通过放射免疫分析进一步证实，S蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白。S蛋白抗原位点分为A、B、C、D共4个位点，研究表明4个抗原位点都位于S蛋白N端543个氨基酸残基之内，由仅占2.2kb的S基因5’端基因片段编码。A位点位于S蛋白氨基酸序列的538-591位范围，暴露在病毒粒子表面，依赖于细胞内糖基化。A位点为不连续抗原位点，可分为Aa、Ab和Ac等3个亚位点，应用抗原决定簇扫描定位亚位点对应的氨基酸残基证实，氨基酸残基538、591和543位对A位点的Aa、Ab和Ac等3个亚位点的形成分别起着关键作用，而残基586位同时影响Aa、Ab亚位点的形成，这表明A位点具有复杂的空间结构。

作为疫苗表达载体，猪痘病毒(Swinepox virus，SPV)有许多特有的优点：(1)SPV作为基因重组疫苗的载体，不仅可以诱导机体产生良好的体液免疫反应，而且可以诱导很强的细胞免疫反应。(2)SPV基因组允许大片段的删除以及外源基因的插入。(3)重组SPV载体疫苗有多种接种途径，可通过口服进行免疫接种。利用SPV载体表达TGEV的S蛋白基因的重组疫苗国内外迄今尚无成功报道，更没有利用SPV载体表达TGEV的S蛋白A位点预防TGE的疫苗或药物的报道。

发明内容

本发明的目的是研制一种能够有效防制猪传染性胃肠炎的重组猪痘病毒载体疫苗，对猪传染性胃肠炎的预防工作提供有力的支持。

本发明的目的通过以下技术方案实现

1.本发明提供一种猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的编码基因，该基因序列如SEQID NO.1所示，用于制备重组猪痘病毒rSPV-SA。

2.本发明还提供一种重组猪痘病毒rSPV-SA，该重组猪痘病毒通过在猪痘病毒载体中插入猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点编码基因重组制备得到，A位点编码基因序列如SEQID NO.1所示，能够表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点即目的蛋白SA。

通过试验，目的蛋白SA能够在重组猪痘病毒中有良好的表达，重组猪痘病毒能在猪体内表达目的蛋白SA。

3.上述2提供的重组猪痘病毒，其中，猪痘病毒载体为Kasza株(ATCC：VR363^TM)。

4.本发明还提供一种预防猪传染性胃肠炎的疫苗，该疫苗包括重组猪痘病毒rSPV-SA，其包括猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点编码基因，该编码基因序列如SEQID NO.1所示，能够表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点。

通过动物免疫试验，该疫苗能够刺激免疫动物产生高效价的猪传染性胃肠炎病毒血清中和抗体。

5.本发明还提供上述1提供的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的编码基因在制备预防猪传染性肠胃炎的药物上的应用。

6.上述2或3提供的重组猪痘病毒rSPV-SA在制备预防猪传染性肠胃炎的药物上的应用。

7.上述2或3提供重组猪痘病毒的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)引物设计：以S蛋白A位点编码基因为基础，设计引物序列，在引物5’端分别引入限制性内切酶BamH I和Sal I的酶切位点；

(2)目的基因片段与载体连接：以猪传染性胃肠炎病毒JS2012株的RNA为模板，通过RT-PCR反应，获得目的基因片段SA；以BamH I和Sal I酶切目的基因片段和穿梭载体pUSZ11/P28M，凝胶电泳回收；在连接酶缓冲液中，连接酶切后目的基因片段和穿梭载体，获得含有目的基因片段SA的穿梭载体pUSZ11/P28SA；

(3)重组猪痘病毒的获取：用脂质体转染法使穿梭载体pUSZ11/P28SA与猪痘病毒Kasza株发生同源重组，获得重组猪痘病毒rSPV-SA原液；

(4)通过细胞痘斑纯化重组猪痘病毒rSPV-SA。

8.上述8提供的重组猪痘病毒的制备方法，其中，所述引物序列如下，

SA1：5’-GCGTCGACATGGGTCTTGGTATGAAGCGTAG-3’；

SA2：5’-CGGGATCCTTATAGCGTCCTGTTAGTTTGTC-3’。

9.上述8提供的重组猪痘病毒的制备方法，其中，所述重组猪痘病毒的获取方法为：以猪痘病毒感染PK15单层细胞，1h后将脂质体与穿梭载体的混合液加入到PK15单层细胞，5-6h后换成细胞维持液，继续培养2-3天；待细胞出现50％以上细胞病变后，将其反复冻融3次，收获重组猪痘病毒rSPV-SA原液。本发明所述疫苗的接种途经包括但不限于肌肉注射等。

本发明的有益效果：

1.本发明首次成功研制了表达猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点的重组猪痘病毒载体疫苗rSPV-SA，该重组猪痘病毒载体疫苗突破了猪传染性胃肠炎病毒常规灭活疫苗和弱毒疫苗的局限性，兼具有弱毒疫苗的免疫效果好和灭活疫苗的安全性高等特点，而且对人、猪等动物没有致病性，安全性较高。

2.试验证明，本发明构建的表达猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点的重组猪痘病毒载体疫苗目的蛋白SA表达稳定，病毒的滴度稳定在1.0×10⁷TCID₅₀/mL。通过病毒中和试验证明了该重组猪痘病毒免疫实验动物后产生了针对TGEV的高效价的中和抗体，三免后中和抗体效价最高可达1∶1024，具有很好的免疫保护作用。

3.重组猪痘病毒对免疫动物不致病，与现在应用的猪传染性胃肠炎病毒商品化灭活疫苗相比，该重组猪痘病毒能同时诱导免疫动物产生强烈的细胞免疫反应以及体液免疫反应，且病毒中和抗体维持的时间更持久，因此该重组猪痘病毒活载体疫苗在猪传染性胃肠炎病毒预防方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1穿梭载体pUSZ11/P28M。其中，BamH I和Sal I为酶切位点；LF和RF分别为猪痘病毒的左、右同源交换序列；P11和P28为痘病毒启动子；LacZ为筛选标记基因；SA为目的蛋白基因。

图2穿梭载体pUSZ11/P28SA。其中，LF和RF分别为猪痘病毒的左、右同源交换序列；P11和P28为痘病毒启动子；LacZ为筛选标记基因；SA为目的蛋白基因。

图3S基因A位点在重组猪痘病毒rSPV-SA中的PCR检测。其中，1：DL2000核酸Marker；2：rSPV-SA感染的PK15细胞；3：wtSPV感染的PK15细胞。

图4Western Blot检测目的蛋白SA在重组猪痘病毒rSPV-SA中的表达。M：SM0671预染蛋白Marker；1：rSPV-SA感染的PK15细胞；2：wtSPV感染的PK15细胞。

图5间接免疫荧光试验检测目的蛋白SA在重组猪痘病毒rSPV-SA中的表达。A：重组猪痘病毒rSPV-SA感染的PK15单层细胞；B：猪痘病毒野毒wtSPV感染的PK15单层细胞。

图6间接ELISA试验检测免疫动物血清S蛋白抗体效价。

图7重组猪痘病毒rSPV-SA免疫后血清猪传染性胃肠炎病毒中和抗体效价。

图8猪小肠组织病理切片观察(100×)。(一)重组猪痘病毒rSPV-SA血清组；(二)TGEV灭活疫苗血清组；(三)wtSPV血清组；(四)PBS血清组；(五)空白对照组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1

穿梭载体pUSZ11/P28M的构建过程及具体序列结构

穿梭载体pUSZ11/P28M是本发明人以基因工程常用的商业化质粒pUC19(Takara公司，货号：D3219)为基础，经过多步酶切、连接构建而成。具体构建过程如下：

1.1 pUS01载体的构建

根据猪痘病毒(SPV)的基因序列(GenBank：AF410153)设计两对特异性引物：

LF1：GAATTCTAAATCTACTTCTTCAACGG，(12121-13268)

LF2：

GGTACCTATAACTACTAGGTCCACACGTGTGGACCTAGTAGTTATAGGTACC；

RF1：CTCGAGAGGCGATTATTTATGTTATTA，(13457-14831)

RF2：

AAGCTTATTTTTATCCTATTGTTGTTCGAACAACAATAGGATAAAAATAAGCTT。

用病毒核酸提取试剂盒(Geneaid)提取猪痘病毒(ATCC：VR-363^TM)的基因组，作为模板，用上述引物通过PCR方法分别扩增出穿梭载体中的左右同源交换序列LF和RF。PCR扩增产物经回收纯化后，LF片段插入到质粒pUC19的EcoR I-Kpn I酶切位点，同时将RF片段插入到质粒pUC19的Xho I-Hind III酶切位点，构建出pUS01载体。

1.2 通用穿梭载体pUSZ11/P28M的构建

以质粒pSP1(韩国Korea大学的Ahn教授惠赠)为模板，用引物：

11Z1：GGATCCCCCAAATAGTACATAATGGAT，

11Z2：

CTCGAGTAGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATGGTTCGTGCAAACAAACG。

扩增出lacZ基因，通过酶切、连接，克隆到1.1中构建的载体pUS01中的Xho I-NotI位点，形成转移载体pUSZ11。

设计并合成两条互补的寡核苷酸链：

P28M1：

CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATGGTCGACTCGAGATCTCGG，

P28M2：

GATCCCGAGATCTCGAGTCGACCATTTATATGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGTAC。

二者退火形成带Kpn I和Not I粘性末端的双链DNA片段。此片段中含经过改造的痘苗病毒强启动子P28序列及2个可用于外源基因插入的限制性酶切位点Sal I和BamH I。然后把这个DNA片段克隆到载体pUSZ11的Kpn I和NotI位点，得到一个通用穿梭载体pUSZ11/P28M，如图1所示。

实施例2

S基因A位点的扩增、克隆、鉴定和测序分析

2.1 引物设计

根据TGEVTH-98株的基因序列(GenBank：AF494337.1)设计了一对针对S基因A位点的特异性引物，在引物的5’端分别含有限制性内切酶BamH I和Sal I的酶切位点。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

特异性引物序列如下所示：

SA1：5’-GCGTCGACATGGGTCTTGGTATGAAGCGTAG-3’

SA2：5’-CGGGATCCTTATAGCGTCCTGTTAGTTTGTC-3’

2.2 RT-PCR扩增

提取本实验室从江苏宿迁某规模化猪场疑似发病猪肠道中分离纯化得到的TGEV JS2012株(该菌株纯化方法属于常规技术，公众能通过普通方法再次获得。该菌株为本实验室保存，愿意提供给公众进行研究)的RNA，经过RT-PCR反应，得到目的基因片段。具体操作如下：

利用病毒RNA提取试剂盒(QIAGEN)提取TGEV JS2012株的RNA，具体步骤按照试剂盒操作手册进行。

在无RNA酶离心管中配制如下混合液：无RNA酶超纯水4μL，随机六聚体引物(50ng/μL)1μL，PEDV总RNA3μL。65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。在上一步的混合液中加入2×RT Mix 10μL，HiScript^TMII Enzyme Mix 2μL，用移液器轻轻吹打混匀。25℃反应5min，50℃反应45min，85℃反应5min，得到PEDV第一链cDNA。

在灭菌PCR管中配制如下反应体系，2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(2.5mM each)4μL，模板cDNA 4μL，SA11μL，SA21μL，Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase(1U/μL)1μL，用无菌超纯水补至总体积50.0μL。在PCR仪上进行反应。循环参数为94℃预变性3min；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共进行30个循环；然后72℃延伸5min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收纯化。

2.3 PCR产物酶切与纯化

酶切反应总体积为40μL：PCR回收片段30μL，10×T buffer 6μL，BamH I2μL，SalI 2μL。37℃作用3h，然后进行琼脂糖凝胶电泳并回收纯化，获得S基因A位点(目的片段SA)。

2.4 pUSZ11/P28M酶切与纯化

酶切反应总体积40μL：pUSZ11/P28M 30μL，10×T buffer 6μL，BamH I 2μL，Sal I 2μL。37℃作用3h，然后进行琼脂糖凝胶电泳并回收纯化，获得载体pUSZ11/P28M酶切产物，大小为8430bp。

2.5 目的片段SA与载体pUSZ11/P28M的连接

目的片段SA 6μL，载体pUSZ11/P28M酶切产物2μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶(大连TaKaRa公司)1μL，混匀各组份后在16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。

2.6 重组质粒的提取和鉴定

挑取转化后平板上的大肠杆菌单菌落，进行PCR鉴定。取2×PCR Mix 12.5μL，上游引物SA10.5μL、下游引物SA20.5μL，大肠杆菌单菌落模板2.0μL，用无菌超纯水补至总体积25μL。在PCR仪上进行反应。循环参数为94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共进行30个循环；然后72℃延伸10min。PCR产物进行1％(g/mL)琼脂糖凝胶电泳。阳性菌落可以得到长度为516bp的目的条带，即目的片段SA。

挑取阳性菌落接种到LB液体培养基，放入180转/分钟的37℃摇床中培养14h。提取重组质粒pUSZ11/P28SA(如图2所示，按照Axygen质粒小量提取试剂盒操作手册进行)并进行BamH I、Sal I双酶切鉴定。酶切反应总体积为20μL：重组质粒pUSZ11/P28SA 15μL，10×T buffer 3μL，BamH I 1μL，Sal I 1μL。37℃作用2h，然后进行琼脂糖凝胶电泳。连接正确的重组质粒酶切后，凝胶电泳可以观察到516bp和8430bp两条核酸条带。

2.7 目的基因SA序列分析

将重组质粒pUSZ11/P28SA送Invitrogen公司测序。S基因A位点测序结果如SEQ ID NO：1所示序列，克隆入重组质粒pUSZ11/P28SA中的SA基因未发生基因突变。

实施例3

重组猪痘病毒rSPV-SA的制备及鉴定

3.1 重组猪痘病毒的获取

用脂质体转染法使穿梭载体pUSZ11/P28SA与猪痘病毒(SPV)Kasza株(ATCC：VR363^TM)发生同源重组。

具体步骤为：提前一天将PK15细胞接种到24孔细胞培养板上，使其长成单层细胞。先用0.05感染复数(MOI)的SPV感染PK15单层细胞，1h后将脂质体(Lipofectamine 2000)与穿梭载体pUSZ11/P28SA的混合液加入到24孔细胞培养板中，6h后换成含2％胎牛血清的DMEM细胞维持液，继续培养2-3天。待50％左右的PK15细胞脱落时，将其反复冻融3次，收获重组猪痘病毒rSPV-SA原液。

3.2 重组猪痘病毒的噬斑纯化

在6孔细胞板中每孔接种3.0×10⁵个PK15细胞，5％的二氧化碳温箱中静置培养。待细胞长成单层后，把重组病毒原液按1∶5倍比稀释接种到单层细胞上，37℃吸附1.5h，弃去感染液，用DHanks缓冲液轻轻冲洗两次，每孔加入含2％低熔点琼脂糖的MEM细胞培养液3mL，37℃二氧化碳温箱中静置培养3-5天，观察噬斑。待能观察到明显的噬斑后，按每孔2mL加入含80μg/mL X-gal和2％低熔点琼脂糖的MEM细胞培养液，继续培养1-2天，重组病毒中的LacZ基因充分表达后，病毒噬斑部分将会形成蓝色的斑点。用灭菌枪头挑取含有蓝色噬斑的琼脂糖凝胶块放入无菌离心管中，加入200μL的无菌PBS，将琼脂块捣碎后反复冻融三次，12000rpm离心5min，收获的病毒接种于新的六孔细胞培养板中。纯化操作重复十次以上，即可得到纯化的重组猪痘病毒。

3.3 重组猪痘病毒滴度的测定

按病毒学操作手册介绍的方法，用含青霉素和链霉素的DHanks缓冲液将病毒作十倍梯度稀释。然后分别接种于长满PK15细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，每孔100μL。同时设定阴、阳性对照。37℃5％二氧化碳温箱培养2h后，换维持液继续培养。逐日观察细胞病变，并按Reed-Muech法计算病毒滴度为1.0×10^6.24pFU。

3.4 PCR检测重组猪痘病毒

取出同步接种重组猪痘病毒rSPV-SA的PK15细胞和接种野生型猪痘病毒wtSPV的PK15细胞各一管，用Geneaid病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA，以提取的DNA为模板，进行PCR检测S基因A位点。结果表明(图3)，重组猪痘病毒中含有S基因A位点片段(第2泳道，大小516bp)，而对照组的野生猪痘病毒中扩增不出S基因A位点片段(第3泳道)，表明重组猪痘病毒构建成功。

3.5 Western Blot检测目的蛋白SA的表达

按5MOI将重组猪痘病毒rSPV-SA接种到PK15细胞单层上，37℃二氧化碳温箱中培养2天，使病毒大量增殖。弃去细胞培养液，并用灭菌PBS冲洗两次单层细胞，加入少量灭菌PBS，用细胞刮子将单层细胞刮下，收获细胞。反复冻融两次，使重组猪痘病毒充分释放，离心后取上清煮沸后进行SDS-PAGE电泳，同时设wtSPV感染的PK15细胞阴性对照。将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转印到PVDF膜上，然后用5％脱脂奶封闭，置于4℃冰箱中过夜。次日将PVDF膜放入含1∶5000稀释的含TGEV抗体的猪康复血清，置37℃摇床中2h；然后将PVDF膜取出用TBST溶液洗三次，每次5min；再将膜放入含1∶10000稀释的含酶标二抗(HRP标记的SPA)的封闭液中，置37℃摇床中1h；再用TBST溶液洗三次，每次5min，将PVDF膜放入沉淀型TMB单组份底物显色液中，使其显色。结果表明(图4)，目的蛋白SA在重组猪痘病毒rSPV-SA中有良好的表达(第2泳道，大小为19kDa)，而在阴性对照中则没有检测到目的蛋白(第3泳道)。

3.6 间接免疫荧光实验

在24孔细胞培养板上接种PK15细胞，使其长成细胞单层。用DHanks缓冲液将重组猪痘病毒rSPV-SA进行10倍倍比稀释，按15TCID₅₀/孔接种PK15细胞，同时设wtSPV感染的阴性对照组。在37℃二氧化碳温箱中培养60h。弃去细胞维持液，用PBS洗涤细胞3次，然后加入-20℃预冷的甲醇，固定10min。用PBST冲洗3次，然后加入含1∶1000稀释的含TGEV抗体的猪康复血清，置37℃摇床中2h；用PBST冲洗3次，加入罗丹明标记的羊抗猪IgG-R二抗，37℃作用1h；最后用PBST洗涤3次，在荧光显微镜下观察结果。

结果表明(图5)，接种了重组猪痘病毒rSPV-SA的PK15细胞胞浆内出现了明显的红色荧光(图A)，而wtSPV感染的阴性对照组未观察到荧光(图B)，表明目的蛋白SA在重组猪痘病毒rSPV-SA中有良好的表达。

实施例4

重组猪痘病毒疫苗的动物免疫试验

4.1 重组猪痘病毒rSPV-SA的猪体免疫试验

20头一月龄清洁级长白猪，随机分成四组，每组3头。第一组用2.0×10⁶TCID₅₀的重组猪痘病毒rSPV-SA颈部肌肉注射免疫；其余三组分别为用2.0×10⁶TCID₅₀TGEV灭活疫苗进行免疫的阳性对照组，用2.0×10⁶TCID₅₀野生型猪痘病毒wtSPV免疫的阴性对照组以及用PBS免疫的空白对照组。初次免疫后的第14天按相同方法进行二免。免疫后，每天观察试验猪，记录其临床反应。在初次免疫的前一天(-1d)以及初次免疫后的第6、13、20、27、34和41天前腔静脉采血，分离血清，用间接ELISA法测定血清S蛋白抗体效价并用病毒中和试验测定血清TGEV中和抗体效价。

临床症状观测结果表明，重组猪痘病毒载体疫苗rSPV-SA免疫后，免疫猪的饮食及精神状态正常；与空白对照组相比，未见任何异常临床症状；体表及注射部位未见痘疹或红斑。间接ELISA检测结果表明，重组猪痘病毒rSPV-SA免疫组的血清S蛋白抗体效价显著高于其他三组(图6)。病毒中和试验结果显示，重组猪痘病毒rSPV-SA免疫组血清中和效价最高可达到1∶1024(图7)，显著高于其他三组。表明重组猪痘病毒rSPV-SA能够刺激免疫动物产生高效价的血清S蛋白抗体以及血清TGEV中和抗体。

4.2 重组猪痘病毒rSPV-SA的被动免疫保护试验

25头3日龄清洁级新生仔猪，随机分成五组，每组5头，用牛奶人工饲喂，每日3次。分别取4.1中四个试验组采集到的血清3mL与TGEV强毒JS2012株1mL(1.0×10⁶TCID₅₀/mL)混匀，置于37℃培养箱中。1h后取出血清-病毒混合液，分别灌胃攻毒第1-4组新生仔猪(4mL/头)。第5组新生仔猪不攻毒，作为空白对照。攻毒后，每隔8h观察仔猪临床症状。攻毒后72h剖杀仔猪，取其小肠等组织进行病理学检测。

攻毒试验结果显示，rSPV-SA和TGEV灭活疫苗免疫组的血清与TGEV强毒JS2012株作用后灌胃攻毒新生仔猪，72h内仔猪没有出现明显的临床症状，存活率均为100％。而wtSPV和PBS免疫组的血清与TGEV强毒JS2012株作用后灌胃攻毒新生仔猪，16h内仔猪出现腹泻、呕吐、食欲下降等症状，24h出现死亡，64h内第三、四组仔猪均全部死亡。小肠组织病理切片观察结果表明，用rSPV-SA和TGEV灭活疫苗免疫组血清与TGEV强毒JS2012株作用后灌胃攻毒的新生仔猪小肠组织结构正常，未出现明显的病理变化；而用wtSPV和PBS免疫组血清与TGEV强毒JS2012株作用后灌胃攻毒的新生仔猪小肠组织可观察到小肠绒毛坏死、脱落、出血等病理变化(图8)。

综上所述，本发明的TGEV重组猪痘病毒载体疫苗rSPV-SA能够表达目的蛋白SA，能够诱导免疫动物产生高效价的血清中和抗体，并对动物产生良好的免疫保护作用，是一种理想的新型疫苗。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的编码基因，其特征在于：该基因序列如SEQ ID NO.1所示，用于制备重组猪痘病毒rSPV-SA。

2.一种重组猪痘病毒rSPV-SA，其特征在于：该重组猪痘病毒通过在猪痘病毒载体中插入猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的编码基因重组制备得到，A位点编码基因序列如SEQ ID NO.1所示，能够表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点。

3.权利要求2所述的重组猪痘病毒，其特征在于：猪痘病毒载体为Kasza株。

4.一种预防猪传染性胃肠炎的疫苗，其特征在于：该疫苗包括重组猪痘病毒rSPV-SA，其包括猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点编码基因，该编码基因序列如SEQ ID NO.1所示，能够表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点即SA蛋白。

5.权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的编码基因在制备治疗或预防猪传染性肠胃炎的药物上的应用。

6.权利要求2或3所述的重组猪痘病毒rSPV-SA在制备治疗或预防猪传染性肠胃炎的药物上的应用。

7.权利要求2或3所述重组猪痘病毒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)引物设计：以S蛋白A位点编码基因为基础，设计引物序列，在引物5’端分别引入限制性内切酶BamH I和Sal I的酶切位点；

(2)目的基因片段与载体连接：以猪传染性胃肠炎病毒JS2012株的RNA为模板，通过RT-PCR反应，获得目的基因片段SA；以BamH I和Sal I酶切目的基因片段和穿梭载体pUSZ11/P28M，凝胶电泳回收；在连接酶缓冲液中，连接酶切后目的基因片段和穿梭载体，获得含有目的基因片段SA的穿梭载体pUSZ11/P28SA；

(3)重组猪痘病毒的获取：用脂质体转染法使穿梭载体pUSZ11/P28SA与猪痘病毒Kasza株发生同源重组，获得重组猪痘病毒rSPV-SA原液；

(4)通过细胞痘斑纯化重组猪痘病毒rSPV-SA。

8.权利要求7所述的重组猪痘病毒的制备方法，其特征在于，所述引物序列如下，SA1：5’-GCGTCGACATGGGTCTTGGTATGAAGCGTAG-3’；SA2：5’-CGGGATCCTTATAGCGTCCTGTTAGTTTGTC-3’。

9.权利要求7所述的重组猪痘病毒的制备方法，其特征在于，所述重组猪痘病毒的获取方法为：以猪痘病毒感染PK15单层细胞，1h后将脂质体与穿梭载体的混合液加入到PK15单层细胞，5-6h后换成细胞维持液，继续培养2-3天；待细胞出现50％以上细胞病变后，将其反复冻融3次，收获重组猪痘病毒rSPV-SA原液。