CN104826123B - 一种齐墩果酸与胺类环糊精的包合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种五环三萜类化合物齐墩果酸与胺类环糊精的包合物，所述的胺类环糊精为氨基取代的β‑环糊精，该包合物采用溶剂法或超声法进行制备；齐墩果酸与胺类环糊精形成包合物之后，其在水中的溶解度大大提高，稳定性增加，可望提高其生物利用度。同时，体外抗肿瘤实验表明，该包合物对几种肿瘤细胞株具有很好的体外抗肿瘤活性；其制备方法简便、易于操作且反应条件温和，可用于齐墩果酸新制剂的开发。

Description

一种齐墩果酸与胺类环糊精的包合物

技术领域

本发明属于制药技术领域，涉及一种齐墩果酸与胺类环糊精的包合物。

背景技术

齐墩果酸（如式II所示）英文名为Oleanolic Acid，是一种五环三萜类化合物，以游离体和配糖体的形式广泛存在于多种植物（126种）中。现代药理研究表明，齐墩果酸具有抑菌消炎、降酶护肝、强心利尿、升白、增强机体免疫功能等方面的作用。临床上齐墩果酸主要用于治疗急性黄胆型肝炎和慢性中毒型肝炎，也用作抗肿瘤辅助药物。齐墩果酸的水溶性极差，溶出速度很慢，生物利用度低，这些都限制了它的进一步应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水溶性好、抗肿瘤活性高的齐墩果酸与胺类环糊精的包合物，该包合物含有齐墩果酸和胺类环糊精，其中齐墩果酸与胺类环糊精的物质的量比为1：1～1：10，采用溶剂包合法，在25～60℃下边搅拌边向溶有胺类环糊精的水溶液中加入齐墩果酸，继续避光搅拌24~72 h后，滤去不溶物，减压蒸干溶剂即得齐墩果酸与胺类环糊精的粉末状固体包合物。

本发明化合物还可以采用超声包合法，25～60℃温度范围内，向正在超声振荡中的胺类环糊精水溶液中加入齐墩果酸，然后继续避光超声1~10 h后，滤去不溶物，减压蒸干溶剂即得齐墩果酸与胺类环糊精的粉末状固体包合物。

本发明中所述胺类环糊精为6-位单取代的β-环糊精，其结构式如式I所示：

其中，R = -NH₂，-NH(CH₂)₂NH₂、-NH(CH₂)₂NH(CH₂)₂NH₂或-NH(CH₂)₂NH(CH₂)₂NH(CH₂)₂NH₂。

所述胺类环糊精为单-（6-氨基-6-脱氧）-β-环糊精、单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精、单-（6-二乙烯三胺基-6-脱氧）-β-环糊精或单-（6-三乙烯四胺基-6-脱氧）-β-环糊精。

本发明中所述的环糊精（cyclodextrin，简称CD）是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，其中研究得较多并且具有实际意义的是含有6、7、8个葡糖糖单元的分子，分别称作α-，β-，γ-环糊精。根据X-射线晶体衍射、红外光谱和核磁共振波谱分析的结果，确定构成环糊精分子的每个D（+）-吡喃葡萄糖都是椅式构象，各个葡萄糖单元均以α-1，4-糖苷键连接成环。由于连接葡萄糖单元的糖苷键不能自由旋转，从而使环糊精形成两个开口端一大一小，中间空心的圆筒立体结构。在其空腔结构中，腔内部由于受到C-H键的屏蔽作用而形成了疏水区间，而所有的羟基分布在分子外部，大口端由C₂，C₃位仲羟基构成，小口端由C₆位伯羟基构成，具有较强的亲水性。其立体结构如图9所示；

胺类环糊精为环糊精分子的D（+）-吡喃葡萄糖C₆的羟基被氨基取代生成的衍生物，对可包合的客体分子特别是含有酸性基团的分子具有很好的增溶效果。

胺类环糊精的合成方法可参照已有的文献方法进行。首先对吡喃葡萄糖C₆位羟基进行单磺酰化得到单6-OTs-CD，然后与胺类化合物反应生成胺类环糊精，其中，所述的磺酰化试剂一般为对甲基苯磺酰氯；所述的氨基化合物包括含氨水、甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙烯三胺和三乙烯四胺等，其合成步骤如式IV所示：

IV

其中，m = 7，对应β-环糊精。n = 0、1或2，分别对应的胺类化合物为乙二胺、二乙烯三胺和三乙烯四胺。

药物分子与环糊精及其衍生物形成包合物后，可增加药物水溶解性，提高其稳定性，还可掩盖其不良气味、降低其在胃肠道的刺激性与不良反应并延长药物的释放时间和提高药物的生物利用度，并具有结肠靶向性。同时，应用环糊精包合技术可有效避免或减少有机溶剂、表面活性剂和脂类的使用。环糊精包合物最大的优点在于它可从分子水平改变药物的性质并且对药物的药动学过程几乎没有干扰。目前世界上约有30种含有环糊精的药物制剂上市，在这些制剂中环糊精的作用主要是：替换注射剂或局部应用制剂处方中的有机溶剂；提高第Ⅱ类和一些第Ⅳ类药物的口服生物利用度；减少胃肠道刺激和增加药物的透皮扩散能力等。经过动物和人体实验研究表明，环糊精可以改善几乎所有类型药物的跨膜转运。

本发明包合物的制备方法简便易行，条件温和，适合工业化生产。

附图说明

图1为单-（6-氨基-6-脱氧）-β-环糊精与其固体包合物¹H-NMR的比较示意图；

图2为单-（6-氨基-6-脱氧）-β-环糊精与齐墩果酸包合物的2D-NMR示意图；

图3为单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精与其固体包合物¹H-NMR的比较示意图；

图4为单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精与齐墩果酸包合物的2D-NMR示意图；

图5为单-（6-二乙烯三胺基-6-脱氧）-β-环糊精与其固体包合物¹H-NMR的比较示意图；

图6为单-（6-二乙烯三胺基-6-脱氧）-β-环糊精与齐墩果酸包合物的2D-NMR示意图；

图7为单-（6-三乙烯四胺基-6-脱氧）-β-环糊精与其固体包合物¹H-NMR的比较示意图；

图8为单-（6-三乙烯四胺基-6-脱氧）-β-环糊精与齐墩果酸包合物的2D-NMR示意图；

图9为环糊精立体结构式示意图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步对本发明中所述方法进行描述，但本发明保护范围不受实施例限制，本实施例中使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂，使用的方法如无特殊说明均为常规方法。

实施例1：齐墩果酸与单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精包合物的制备

（1）单6-OTs-β-CD的制备

取用水重结晶过的β-环糊精210 g，分批加入盛有1300 mL水的三颈瓶中，室温搅拌。称取17.2 g 氢氧化钠溶于50 mL水中，然后缓慢将该氢氧化钠水溶液滴加到β-环糊精的混悬液中至反应液逐渐澄清，继续搅拌1.5 h。待反应液中环糊精完全溶解变澄清后，将含有26.0 g对甲苯磺酰氯的乙腈（80 mL）溶液缓慢滴加至反应液中（约30分钟滴完），继续搅拌2 h后，滤去不溶物，滤液用2 mol/L的盐酸调节至pH = 7.5，此时有大量白色沉淀析出。抽滤收集沉淀，加热条件下将沉淀物溶于450 mL的蒸馏水中，趁热抽滤不溶物，滤液室温静置12 h，收集沉淀物，并用水重结晶几次，直至薄层色谱显示产物纯净。得最终产物17g，产率8%；产物结构表征如下：¹H NMR (500 MHz，DMSO-d₆，ppm)：δ 2.43(s, 3H, -CH₃)，3.23-3.71(m, 42H, H-2, -3, -4, -5, -6 of β-CD)，4.34-4.45(m, 6H, 6-OH of β-CD)，4.84(s, 7H, H-1 of β-CD)，5.66-5.88(m, 14H, 2-, 3- OH of β-CD)，7.43-7.45(d, 2H, Ar-H)，7.74-7.77(d, 2H, Ar-H)；

（2） 单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精（EN-β-CD）的制备

将3.0 g（2.3 mmol）6-OTs-βCD溶于20 mL已干燥的乙二胺溶液中，室温搅拌至完全溶解，于氮气保护下80℃反应10 h，待反应完成后，减压蒸去溶剂，向反应瓶中加少量水溶解固体，继续蒸除溶剂，然后加入2 mL水溶解产物，并将其缓慢滴入至400 mL丙酮中，室温搅拌30 min，抽滤收集白色沉淀，并将所得固体粗品于真空干燥箱中干燥24 h。将已干燥的固体粉末再次溶于2 mL蒸馏水中，过滤除去少量不溶物，滤液滴入300 mL丙酮中，收集白色沉淀。重复上述操作至薄层色谱检测无杂质点，即得到纯的单-（6-乙二胺-6-脱氧）-β-环糊精（2.3 g），产率84%；产物结构表征：¹H NMR (500 MHz，D₂O，ppm)：δ 2.8-3.0(m, 4H, -CH₂-CH₂- of CD)，3.4-3.6(m, 14H, H-2, 4 of CD)，3.7-3.9(m, 28H, H-3, 5, 6 ofCD)，4.98(s, 7H, H-1 of CD)；

（3） 齐墩果酸与单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精包合物的制备

于25 mL的反应瓶中加入单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精（3528 mg，3 mmol）加入20 mL蒸馏水搅拌至溶解，然后加入齐墩果酸（456 mg，1 mmol）的甲醇溶液，在25℃下避光搅拌72 h，过滤除去未溶解的固体药物，再用0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液蒸干即得白色粉末，在真空干燥箱中干燥24 h，即得齐墩果酸与单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精包合物（见图3、4）。

实施例2：齐墩果酸与单-（6-二乙烯三胺基-6-脱氧）-β-环糊精包合物的制备

（1）单6-OTs-β-CD的制备方法同实施例1之步骤（1）；

（2） 单-（6-二乙烯三胺基-6-脱氧）-β-环糊精（DETA-β-CD）的制备

将3.0 g（2.3 mmol）单6-OTs-β-CD溶于20 mL干燥的二乙烯三胺中，室温搅拌至完全溶解，氮气保护下，于80℃下反应10 h，待反应结束后，将反应液缓慢滴入400 mL丙酮中，室温搅拌30 min后，抽滤除去滤液，收集白色沉淀，将沉淀溶于少量水，并将其再次滴入300mL丙酮中，搅拌0.5 h后抽滤收集白色沉淀，将其于真空干燥箱中干燥，将所得固体粉末研碎后加入200 mL乙醇中，超声20 min后，收集白色沉淀。重复上述操作至薄层色谱检测无杂质点，即得纯的单-（6-二乙烯三胺基-6-脱氧）-β-环糊精（DETA-β-CD）（2.2 g），产率78%；产物结构表征如下：¹H NMR (500 MHz，D₂O，ppm)：δ 2.65-2.76 (m, 8H, -CH₂CH₂- of CD)，3.47-3.58 (m, 14H, H-2, 4 of CD)，3.75-3.89 (m, 28H, H-3, 5, 6 of CD)，4.98 (s,7H, H-1 of CD)；

（3） 齐墩果酸与单-（6-二乙烯三胺基-6-脱氧）-β-环糊精包合物的制备

于25 mL的反应瓶中加入单-（6-二乙烯三胺基-6-脱氧）-β-环糊精（6095 mg，5mmol）加入20 mL的蒸馏水搅拌至溶解，然后加入齐墩果酸（456 mg，1 mmol）的乙醇溶液，在25℃下避光超声10 h，过滤除去未溶解的固体药物，再用0.45μm的微孔滤膜过滤，然后将滤液减压蒸干即可得白色粉末，在真空干燥箱中干燥24 h，即得包合物（见图5、6）。

实施例3：齐墩果酸与单-（6-氨基-6-脱氧）-β-环糊精包合物的制备

（1）单6-OTs-β-CD的制备方法同实施例1步骤（1）；

（2）单-6- N₃-β-CD的制备

将6.5 g（5.0 mmol）单6-OTs-β-CD溶于15 mL干燥的DMF中，室温搅拌至完全溶解，然后加入叠氮钠 （0.4 g，6.15 mmol）， 氮气保护下，于75℃下反应10 h，待反应结束后冷却至室温，将反应液缓慢滴入300 mL丙酮中，搅拌30 min后，抽滤取滤饼，真空干燥得到白色粉末4.7 g， 产率为80%。¹H NMR (500 MHz，D₂O，ppm)：δ 4.90（s，7H, H-1 of CD）, 3.38-3. 80 (m, H-2, 3, 4, 5, 6 of CD)。

（3）单-（6-氨基-6-脱氧）-β-环糊精的制备

将单-6- N₃-β-CD （1.5 g， 1.32 mmol）溶解于20 mL干燥DMF中，加入三苯基膦（1.7 g， 6.49 mmol）， 25℃下搅拌2 h。缓慢加入7 mL水，继续反应18 h，过滤除去不容物，将澄清液缓慢滴入300 mL丙酮中，搅拌30 min后过滤取滤饼，真空干燥，得白色粉末0.97g， 产率65%。¹H NMR (500 MHz，D₂O，ppm)：δ 5.01 （s，7H, H-1 of CD）， 3.32-3.95（m, H-2, 3, 4,5, 6 of CD）；

（4）齐墩果酸与单-（6-氨基-6-脱氧）-β-环糊精包合物的制备

于25 mL的反应瓶中加入单-（6-胺基-6-脱氧）-β-环糊精（7931 mg，7mmol）加入20mL的蒸馏水搅拌至溶解，然后加入齐墩果酸（456 mg，1 mmol）的乙醇溶液，在25℃下避光超声5 h，过滤除去未溶解的固体药物，再用0.45μm的微孔滤膜过滤，然后将滤液减压蒸干即可得白色粉末，在真空干燥箱中干燥24 h，即得包合物。（见图1、2）。

实施例4：齐墩果酸与单-（6-三乙烯四胺基-6-脱氧）-β-环糊精包合物的制备

（1）单6-OTs-β-CD的制备方法同实施例1步骤（1）；

（2）单-（6-三乙烯四胺基-6-脱氧）-β-环糊精的制备

将3.0 g（2.3 mmol）单6-OTs-β-CD溶于20 mL干燥的三乙烯四胺中，室温搅拌至完全溶解，氮气保护下，于85℃下反应12 h，待反应结束后，将反应液缓慢滴入400 mL丙酮中，室温搅拌30 min后，抽滤除去滤液，收集白色沉淀，将沉淀溶于少量水，并将其再次滴入300mL丙酮中，搅拌0.5 h后抽滤收集白色沉淀，将其于真空干燥箱中干燥，将所得固体粉末研碎后加入200 mL乙醇中，超声20 min后，收集白色沉淀。重复上述操作至薄层色谱检测无杂质点，即得纯的单-（6-三乙烯四胺基-6-脱氧）-β-环糊精（DETA-β-CD）（1.59 g），产率54%；产物结构表征如下：¹H NMR (500 MHz，D₂O，ppm)：δ 2.61-2.85 (m, 12H, -CH₂CH₂- ofCD)，3.38-3.89 (m, H-2, 3, 4, 5, 6 of CD)，5.08 (s, 7H, H-1 of CD)。

（3）齐墩果酸与单-（6-三乙烯四胺基-6-脱氧）-β-环糊精包合物的制备

于25 mL的反应瓶中加入单-（6-三乙烯四胺基-6-脱氧）-β-环糊精（6876 mg，4mmol）加入20 mL的蒸馏水搅拌至溶解，然后加入齐墩果酸（456 mg，1 mmol），在25℃下避光超声7 h，过滤除去未溶解的固体药物，再用0.45μm的微孔滤膜过滤，然后将滤液减压蒸干即可得白色粉末，在真空干燥箱中干燥24 h，即得包合物（见图7、8）。

实施例5：齐墩果酸与胺类环糊精的包合物的水溶性测定

（1）齐墩果酸溶解度标准曲线的测定

精确配制一系列浓度范围为0.5~5×10^-3 mol/L 的齐墩果酸的甲醇溶液，用荧光分光光度计测定其在25℃下激发波长在355 nm处的荧光强度F，然后以浓度 C（mol/L）为横坐标，以荧光强度F为纵坐标拟合标准曲线为：F = 41578 C-4.5329（R² = 0.9991）。

（2）包合物在水中溶解度的测定

于25 mL 的反应瓶中分别加入0.1 mmol单-（6-氨基-6-脱氧）-β-环糊精、单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精、单-（6-二乙烯三胺基-6-脱氧）-β-环糊精和单-（6-三乙烯四胺基-6-脱氧）-β-环糊精，然后加入20 mL 的蒸馏水搅拌至溶解，再加入0.3 mmol的齐墩果酸，于室温下避光搅拌3天；最后用0.45μm的微孔滤膜过滤即得到齐墩果酸的胺类环糊精的饱和溶液。取1 mL该饱和溶液用水稀释至10 mL，在25 ℃、激发波长355 nm的条件下测定其荧光强度，最后代入标准曲线计算其浓度。

通过荧光分光光度计测得齐墩果酸的单-（6-氨基-6-脱氧）-β-环糊精、单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精、单-（6-二乙烯三胺基-6-脱氧）-β-环糊精、单-（6-三乙烯四胺基-6-脱氧）-β-环糊精饱和水溶液的荧光强度分别为：F = 80.123，95.973，97.420，225.127。通过标准曲线计算得到齐墩果酸在单-（6-氨基-6-脱氧）-β-环糊精、单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精、单-（6-二乙烯三胺基-6-脱氧）-β-环糊精、单-（6-三乙烯四胺基-6-脱氧）-β-环糊精中的水溶解度分别为：2.1×10^-2 mol/L，2.4×10^-2 mol/L，2.5×10^-2mol/L，5.5×10^-2 mol/L。

通过检索文献得知，25℃下齐墩果酸在水中的溶解度为1.08×10⁵ mol/L（文献：Liu, L. & Wang, X. J. Chem. Eng. Data, 2007, 52, 2527-2528.），由此可见，通过与胺类环糊精进行包合后，齐墩果酸在水中的溶解度得到显著提高，且对其增溶作用最强的为单-（6-三乙烯四胺基-6-脱氧）-β-环糊精。

实施例6：包合物对人肝癌细胞（HepG2）及人结肠癌细胞（HT-29和HCT116）的体外抑制作用

以实施例1所制备的齐墩果酸与单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精包合物为例。取人肝癌细胞（HepG2）及人结肠癌细胞（HT-29和HCT116）悬液（浓度为4×10⁴个/mL）各180μL加入96孔板，在5%二氧化碳浓度、37℃及饱和湿度下预培养24 h。更换其中的150 μL培养基后，再加入含有不同浓度齐墩果酸与单-（6-乙二胺基-6-脱氧）-β-环糊精包合物的培养基20μL，并继续培养48 h。用MTT法分别测定其OD值，求出生长抑制率，观察高、中、低各浓度的上述包合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，并计算IC₅₀值。上述实验平行进行三次后取其平均值。

表1 齐墩果酸/胺类环糊精包合物在人肝癌细胞（HepG2）及人结肠癌细胞（HT-29和HCT116）中的IC₅₀值（μM）

由表1可以发现，所有四种包合物对人肝癌细胞（HepG2）及人结肠癌细胞（HT-29和HCT116）的抑制活性均强于齐墩果酸本身。其中，以齐墩果酸/单-（6-氨基-6-脱氧）-β-环糊精包合物的体外抗肿瘤活性最为优越。

Claims (2)

1.一种齐墩果酸与胺类环糊精的包合物，其特征在于：采用溶剂包合法，在25～60℃下边搅拌边向溶有胺类环糊精的水溶液中加入齐墩果酸，继续避光搅拌24~72 h后，滤去不溶物，减压蒸干溶剂即得齐墩果酸与胺类环糊精的粉末状固体包合物，其中齐墩果酸与胺类环糊精的摩尔比为1︰1～1︰10；

所述胺类环糊精为6-位单取代的β-环糊精，其结构式如式I所示：

其中，R = -NH₂。

2.一种齐墩果酸与胺类环糊精的包合物，其特征在于：在25～60℃下向超声振荡中的胺类环糊精水溶液中加入齐墩果酸，然后继续避光超声1~10 h后，滤去不溶物，减压蒸干溶剂即得齐墩果酸与胺类环糊精的粉末状固体包合物；其中齐墩果酸与胺类环糊精的摩尔比为1︰1～1︰10；

所述胺类环糊精为6-位单取代的β-环糊精，其结构式如式I所示：

其中，R = -NH₂。