CN104818316B

CN104818316B - 用于筛查柳氮磺胺吡啶所致皮肤药物不良反应的人类白细胞抗原基因检测试剂盒

Info

Publication number: CN104818316B
Application number: CN201310627036.8A
Authority: CN
Inventors: 邢清和; 骆肖群; 徐金华; 杨凡萍
Original assignee: Fudan University; Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Fudan University; Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2013-11-28
Filing date: 2013-11-28
Publication date: 2018-09-21
Anticipated expiration: 2033-11-28
Also published as: CN104818316A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种人类白细胞抗原基因‑‑HLA‑B*13:01基因的检测试剂盒。HLA‑B*13:01基因可作为预测柳氮磺胺吡啶所致DRESS的标记基因。从患者的外周血中抽取DNA后，用现行的方法检测HLA‑B*13:01基因，如PCR‑SSO(序列特异性寡核苷酸探针)方法。利用本发明提供的HLA‑B*13:01基因检测试剂盒可用于柳氮磺胺吡啶使用前筛查及筛选治疗柳氮磺胺吡啶所致DRESS的靶向药物。前者可指导临床用药，从而减少柳氮磺胺吡啶所致DRESS的发生。后者主要靶向作用于HLA‑B*13：01分子，从而阻断其在发病中与柳氮磺胺吡啶或其代谢产物之间的相互作用。

Description

用于筛查柳氮磺胺吡啶所致皮肤药物不良反应的人类白细胞抗原基因检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药和试剂检测领域，涉及一种人类白细胞抗原基因检测试剂盒。具体而言，涉及人类白细胞抗原基因--HLA-B*13:01基因，它与柳氮磺胺吡啶所致伴嗜酸性粒细胞增多和系统症状的皮肤药物不良反应发病相关。

背景技术

柳氮磺胺吡啶是临床上常用药物，它主要用于炎症性肠病及类风湿关节炎（Mottonen,T.,et al.,Comparison of combination therapy with single-drugtherapy in early rheumatoid arthritis:a randomised trial.FIN-RACo trialgroup.Lancet,1999.353(9164):p.1568-73.Van Hees,P.A.,et al.,Effect ofsulphasalazine in patients with active Crohn's disease:a controlled double-blind study.Gut,1981.22(5):p.404-9.Dissanayake,A.S.and S.C.Truelove,Acontrolled therapeutic trial of long-term maintenance treatment of ulcerativecolitis with sulphazalazine(Salazopyrin).Gut,1973.14(12):p.923-6）。但是有研究显示部分患者因服用该药后发生药疹而停用该药（Donovan,S.,et al.,Tolerability ofenteric-coated sulphasalazine in rheumatoid arthritis:results of a co-operating clinics study.Br J Rheumatol,1990.29(3):p.201-4.）。

皮肤药物不良反应即药疹，指药物通过各种途径进入人体后引起的皮肤黏膜炎症反应。重症药疹是病情较重的药疹，其中包括伴嗜酸性粒细胞增多和系统症状的药物反应（Drug rush with eosinophilia and systemic symptoms，DRESS）。后者死亡率高达10%，临床上以常有多器官累及、嗜酸粒细胞增多及皮疹为特点（Peyriere,H.,et al.,Variability in the clinical pattern of cutaneous side-effects of drugs withsystemic symptoms:does a DRESS syndrome really exist?Br J Dermatol,2006.155(2):p.422-8.Roujeau,J.C.,Clinical heterogeneity of drughypersensitivity.TOXICOLOGY,2005.209(2SI):p.123-129.Mockenhaupt,M.,Epidemiology of cutaneous adverse drug reactions.Chem Immunol Allergy,2012.97:p.1-17.）。目前柳氮磺胺吡啶所致药疹的报道中以DRESS居多（Aquino,R.T.,etal.,Sulfasalazine-induced DRESS syndrome(Drug Rash with Eosinophilia andSystemic Symptoms).Sao Paulo Med J,2008.126(4):p.225-6.Bejia,I.,et al.,DRESSsyndrome induced by sulphasalazine in rheumatoid arthritis.Joint Bone Spine,2006.73(6):p.764-5.Michel,F.,et al.,DRESS syndrome in a patient onsulfasalazine for rheumatoid arthritis.Joint Bone Spine,2005.72(1):p.82-5.）。因此如果能找到柳氮磺胺吡啶所致DRESS发病的基因标志，将对临床用药起到指导作用。

人类白细胞抗原（Human leukocyte antigen，HLA）基因的表达产物为人类白细胞抗原，后者在免疫反应中担任至关重要的角色。已有研究发现包括卡马西平、阿巴卡韦、别嘌呤醇等在内的数种药物引起的药疹与HLA等位基因相关（Bharadwaj,M.,et al.,Drughypersensitivity and human leukocyte antigens of the major histocompatibilitycomplex.Annu Rev Pharmacol Toxicol,2012.52:p.401-31.Cao,Z.H.,et al.,HLA-B*58:01allele is associated with augmented risk for both mild and severe cutaneousadverse reactions induced by allopurinol in Han Chinese.Pharmacogenomics,2012.13(10):p.1193-201.Roujeau,J.C.,et al.,Genetic susceptibility to toxicepidermal necrolysis.Arch Dermatol,1987.123(9):p.1171-3.）。美国FDA已早在2008年推荐亚洲人群在使用卡马西平前进行HLA-B*15：02基因的筛查（Ferrell PB Jr,McleodHL.Carbamazepine,HLA-B*15:02and risk of Stevens-Johnson Syndrome and toxicepidermal necrolysis:US FDA recommendations[J].Pharmacogenomics,2008,9(10):1543-1546），以指导临床用药。

经对现有技术文献的检索发现，至今未见关于HLA-B*13:01基因与柳氮磺胺吡啶引起DRESS的发病相关，可作为基因标记用于筛选该型药疹的相关报道。也未见相关试剂盒的报道。

发明内容

本发明提供了一种检测检测HLA-B*13:01基因的试剂盒及其使用方法。

本发明还提供了一种上述试剂盒的应用，也就是通过检测HLA-B*13:01基因的存在来评估患者服用柳氮磺胺吡啶后是否具有患DRESS的潜在可能。同时可以据此指导临床用药，从而减少柳氮磺胺吡啶所致DRESS的发生。

一方面，本发明提供了一种人类白细胞抗原基因的检测试剂盒。

所述的人类白细胞抗原基因是HLA-B*13:01基因；

所述的试剂盒中含有检测人类白细胞抗原基因的核酸或者蛋白的试剂。

所述的试剂盒中含有人类白细胞抗原基因的扩增引物；或者标记探针。

或者，所述的试剂盒中含有人类白细胞抗原基因的特异性抗体。

本发明所述柳氮磺胺吡啶所致DRESS的相关HLA等位基因-HLA-B*13:01基因的核酸序列如SEQ NO.1所示：

(a)序列特征：

*长度：3324碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线形

(b)分子类型：基因组DNA(gDNA文库)

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人

(f)SEQ ID NO.1核酸序列描述如下：

另一方面，本发明提供了上述检测试剂盒的应用，即对样本的HLA-B*13:01基因进行分型。

例如，如本发明的实施例中所示，采用PCR-SSO法进行HLA-B*13:01基因的分型。

具体而言，对HLA-B*13:01基因的分型的步骤如下：

抽提样本中的DNA；

对HLA的多态区域进行扩增；

在扩增过程中对PCR产物进行同位素或非同位素标记；

将PCR产物与膜上的探针杂交、放射自显影根据信号判断结果。

其中，所述的探针针对PCR扩增产物设计并且固定在膜上。

所述的样本可以是RNA、蛋白、细胞或者血清样本。

最常见的情况下，所述的样本是离体的外周血。

利用HLA-B*13:01基因的分析结果可以判断伴嗜酸性粒细胞增多和系统症状的药物反应。

本发明的实验数据证明，HLA-B*13:01基因可作为预测柳氮磺胺吡啶所致DRESS的标记基因。

试验结果显示，柳氮磺胺吡啶所致DRESS患者中HLA-B*13:01阳性比例相比于正常对照组及柳氮磺胺吡啶耐受组之间差异有统计学意义（表2）。HLA-B*13：01与柳氮磺胺吡啶结合模型见图1（柳氮磺胺吡啶与HLA-B*13：01结合模型图）。

本发明的具有实用性的例证：

1)可以利用本发明所介绍的HLA-B*13:01基因作为预测柳氮磺胺吡啶所致DRESS的标记基因。

2)利用本发明提供的HLA-B*13:01基因可用于评价或制备柳氮磺胺吡啶使用前筛查试剂盒。

3）利用本发明提供的HLA-B*13:01分子可用于评价或制备柳氮磺胺吡啶所致药疹靶向药物。

本发明涉及的是一种人类白细胞抗原基因--HLA-B*13:01基因，它与柳氮磺胺吡啶所致伴嗜酸性粒细胞增多和系统症状的药物反应发病相关。HLA-B*13:01基因可作为预测柳氮磺胺吡啶所致DRESS的标记基因。从患者的外周血中抽取DNA后，用现行的方法检测HLA-B*13:01基因，如PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸探针)方法。利用本发明提供的HLA-B*13:01基因检测试剂盒可用于柳氮磺胺吡啶使用前筛查及筛选治疗柳氮磺胺吡啶所致DRESS的靶向药物。前者可指导临床用药，从而减少柳氮磺胺吡啶所致DRESS的发生。后者主要靶向作用于HLA-B*13：01分子，从而阻断其在发病中与柳氮磺胺吡啶或其代谢产物之间的相互作用。

附图说明

图1.柳氮磺胺吡啶与HLA-B*13：01结合模型图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：基因的收集和抽提

柳氮磺胺吡啶所致DRESS患者来自于中国上海复旦大学附属华山医院。

诊断标准由Bocquet等人（Bocquet,H.,M.Bagot and J.C.Roujeau,Drug-inducedpseudolymphoma and drug hypersensitivity syndrome(Drug Rash with Eosinophiliaand Systemic Symptoms:DRESS).Semin Cutan Med Surg,1996.15(4):p.250-7.）提出，即满足皮肤发疹、血液学异常改变（嗜酸性粒细胞增多大于1500/mm3和出现异常淋巴细胞）和系统受累症状（淋巴结肿大，直径大于2cm或肝炎转氨酶为正常值2倍以上、间质性肾炎、间质性肺炎或心脏炎）三项条件诊断为DRESS。在知情同意的前提下参加本课题的研究，采集血液，并签署知情同意书。所有入组患者均通过病史及皮肤病理检查排除病毒疹及毒性红斑等其他诊断。所有患者均在发疹前2个月内首次口服柳氮磺胺吡啶。本实验有两组对照，其一是来自human MHC database(dbMHC)的283位健康人群，另外一组来自中国东部地区的30例患者为柳氮磺胺吡啶耐受组，均口服柳氮磺胺吡啶大于2月且没有发生任何药物反应。

取样本血液300ul，按试剂盒说明书提取DNA，用紫外分光光度仪检测DNA浓度和纯度。

实施例2：检测HLA基因分型

本发明采用PCR-SSO法（推荐试剂盒-One Lambda,CA,USA）进行HLA基因的分型。其原理是先对HLA的多态区域进行扩增,在扩增过程中对PCR产物进行同位素或非同位素标记,然后针对PCR扩增产物根据碱基配对原则设计系列寡核苷酸探针固定在膜上,最后将PCR产物与膜上的探针杂交、放射自显影根据信号判断结果。根据试剂盒标准步骤进行HLA基因分型。（即将DNA样本、底物、Taq酶、引物混合后混匀，加入扩增板中，按试剂盒说明书中条件扩增，扩增产物进行杂交、染色和读板）。结果分析通过HLA Fusion软件(Onelambda,CA,USA,HLA Fusion3.0)进行。

实施例3：HLA-B*13:01与柳氮磺胺吡啶所致DRESS相关

统计：利用SPSS16.0计算Odds Ratio(OR)及其95%的可信区间，必要时使用Haldane’s校正，选用卡方检验进行统计学分析，统计学的显著性水平设定为P小于0.05。

结果：共搜集到柳氮磺胺吡啶所致DRESS患者6例（表1），柳氮磺胺吡啶耐受组30例。柳氮磺胺吡啶所致DRESS患者中HLA-B*13:01阳性比例相比于正常对照组及柳氮磺胺吡啶耐受组之间差异有统计学意义（表2）。HLA-B*13：01与柳氮磺胺吡啶结合模型见图1（柳氮磺胺吡啶与HLA-B*13：01结合模型图）。

表1.柳氮磺胺吡啶所致DRESS的临床特点及HLA分型

表2.柳氮磺胺吡啶所致DRESS组与柳氮磺胺吡啶耐受组HLA-B*13:01阳性比例

*差异有统计学意义(P<0.05)。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 用于筛查柳氮磺胺吡啶所致皮肤药物不良反应的人类白细胞抗原基因检测试剂盒

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3324

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gatcaggacg aagtcccagg tcccggacgg ggctctcagg gtctcaggct ccgagagcct 60

tgtctgcatt ggggaggcgc agcgttgggg attccccact cccacgagtt tcacttcttc 120

tcccaaccta tgtcgggtcc ttcttccagg atactcgtga cgcgtcccca attcccactc 180

ccattgggtg tcgggtgtct agagaagcca atcagtgtcg ccggggtccc agttctaaag 240

tccccacgca cccacccgga ctcagaatct cctcagacgc cgagatgcgg gtcacggcgc 300

cccgaaccct cctcctgctg ctctgggggg cagtggccct gaccgagacc tgggccggtg 360

agtgcgggat cgggagggaa atggcctctg tggggaggag cgaggggacc gcaggcgggg 420

gcgcaggacc cggggagccg cgccgggagg agggtctggc gggtctcagc ccctcctggc 480

ccccaggctc ccactccatg aggtatttct acaccgccat gtcccggccc ggccgcgggg 540

agccccgctt catcaccgtg ggctacgtgg acgacaccca gttcgtgagg ttcgacagcg 600

acgccacgag tccgaggatg gcgccccggg cgccatggat agagcaggag gggccggagt 660

attgggaccg ggagacacag atctccaaga ccaacacaca gacttaccga gagaacctgc 720

gcaccgcgct ccgctactac aaccagagcg aggccggtga gtgaccccgg cccggggcgc 780

aggtcacgac tccccatccc ccacggacgg cccgggtcgc cccgagtctc cgggtccgag 840

atccgcctcc ctgaggccgc gggacccgcc cagaccctcg accggcgaga gccccaggcg 900

cgtttacccg gtttcatttt cagttgaggc caaaatcccc gcgggttggt cggggcgggg 960

cggggctcgg gggacggggc tgaccgcggg gccggggcca gggtctcaca tcatccagag 1020

gatgtatggc tgcgacctgg ggccggacgg gcgcctcctc cgcgggcata accagttagc 1080

ctacgacggc aaggattaca tcgccctgaa cgaggacctg agctcctgga ccgcggcgga 1140

caccgcggct cagatcaccc agctcaagtg ggaggcggcc cgtgtggcgg agcagctgag 1200

agcctacctg gagggcgagt gcgtggagtg gctccgcaga tacctggaga acgggaagga 1260

gacgctgcag cgcgcgggta ccaggggcag tggggagcct tccccatctc ctataggtcg 1320

ccggggatgg cctcccacga gaagaggagg aaaatgggat cagcgctaga atgtcgccct 1380

cccttgaatg gagaatggca tgagttttcc tgagtttcct ctgagggccc cctcttctct 1440

ctaggacaat taagggatga cgtctctgag gaaatgtagg ggaagacagt ccctagaata 1500

ctgatcaggg gtcccctttg acccctgcag cagccttggg aaccgtgact tttcctctca 1560

ggccttgttc tctgcctcac actcagtgtg tttggggctc tgattccagc acttctgagt 1620

cactttacct ccactcagat caggagcaga agtccctgtt ccccgctcag agactcgaac 1680

tttccaatga ataggagatt atcccaggtg cctgcgtcca ggctggtgtc tgggttctgt 1740

gccccttccc caccccaggt gtcctgtcca ttctcaggct ggtcacatgg gtggtcctag 1800

ggtgtcccat gagagatgca aagcgcctga attttctgac tcttcccatc agacccccca 1860

aagacacacg tgacccacca ccccatctct gaccatgagg ccaccctgag gtgctgggcc 1920

ctgggcttct accctgcgga gatcacactg acctggcagc gggatggcga ggaccaaact 1980

caggacactg agcttgtgga gaccagacca gcaggagata gaaccttcca gaagtgggca 2040

gctgtggtgg tgccttctgg agaagagcag agatacacat gccatgtaca gcatgagggg 2100

ctgccgaagc ccctcaccct gagatggggt aaggaggggg atgaggggtc atatctcttc 2160

tcagggaaag caggagccct tctggagccc ttcagcaggg tcagggcccc tcatcttccc 2220

ctcctttccc agagccatct tcccagtcca ccgtccccat cgtgggcatt gttgctggcc 2280

tggctgtcct agcagttgtg gtcatcggag ctgtggtcgc tgctgtgatg tgtaggagga 2340

agagctcagg tagggaaggg gtgaggggtg gggtctgggt tttcttgtcc cactgggggt 2400

ttcaagcccc aggtagaagt gttccctgcc tcattactgg gaagcagcat gcacacaggg 2460

gctaacgcag actgggaccc tgtgtgccag cacttactct tttgtgcagc acatgtgaca 2520

atgaagcacg gatgtatcac cttgatggtt gtggtgttgg ggtcctgatt ccagcattca 2580

tgagtcaggg gaaggtccct gctaaggaca gaccttagga gggcagttgg tccaggaccc 2640

acacttgctt tcctcgtgtt tcctgatcct gccctgggtc tgtagtcata cttctggaaa 2700

ttccttttgg gtccaagact aggaggttcc tctaagatct catggccctg cttcctccca 2760

gtcccctcac aggacatttt cttcccacag gtggaaaagg agggagctac tctcaggctg 2820

cgtgtaagtg gtgggggtgg gagtgtggag gagctcaccc accccataat tcctcctgtc 2880

ccacgtctcc tgcgggctct gaccaggtcc tgtttttgtt ctactccagg cagcgacagt 2940

gcccagggct ctgatgtgtc tctcacagct tgaaaaggtg agattcttgg ggtctagagt 3000

gggcgggggg ggtggtgggg cagaggggaa aggcctgggt aatggacatt ctttgattgg 3060

gatgtttcgc gtgtgtggtg ggctgtttag agtgtcatca cttaccatga ctaaccagaa 3120

tttgttcatg actgttgttt tctgtagcct gagacagctg tcttgtgagg gactgagatg 3180

caggatttct tcacgcctcc cctttgtgac ttcaagagcc tctggcatct ctttctgcaa 3240

aggcacctga atgtgtctgt gtccctgtta gcataatgtg aggaggtgga gagacagccc 3300

aactgtgtgt ccactgtgac ccct 3324

Claims

1.人类白细胞抗原基因在用于制备检测柳氮磺胺吡啶所致皮肤药物不良反应的试剂盒中的用途；所述的人类白细胞抗原基因是HLA-B*13:01基因；所述的试剂盒中含有检测人类白细胞抗原基因的核酸或者蛋白的试剂。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒中含有人类白细胞抗原基因的扩增引物；或者标记探针。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒中含有人类白细胞抗原基因的特异性抗体。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的与柳氮磺胺吡啶所致皮肤药物不良反应是柳氮磺胺吡啶所致药疹伴嗜酸性粒细胞增多和系统症状(DRESS)或药物超敏综合征(DIHS)。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，采用所述的试剂盒通过PCR-SSO法对样本的HLA-B*13:01基因进行分型，其步骤如下：

(1)抽提样本中的DNA；

(2)对HLA的多态区域进行扩增；

(3)在扩增过程中对PCR产物进行同位素或非同位素标记；

(4)将PCR产物与膜上的探针杂交、放射自显影，根据信号判断结果；

所述的探针针对PCR扩增产物设计并且固定在膜上。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的样本是RNA、蛋白、细胞或者血清样本。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，利用HLA-B*13:01基因的分析结果判断伴嗜酸性粒细胞增多和系统症状的药物反应。

8.人类白细胞抗原基因在用于制备鉴别和/或筛选治疗由柳氮磺胺吡啶所致药物不良反应的候选药物中的用途，其中所述的人类白细胞抗原基因为HLA-B*13:01，该HLA-B*13:01等位基因作为标记基因。

9.人类白细胞抗原基因在用于制备治疗由柳氮磺胺吡啶所致药疹伴嗜酸性粒细胞增多和系统症状(DRESS)或药物超敏综合征(DIHS)的鉴别和/或筛选候选药物中的用途，其中所述的人类白细胞抗原基因为HLA-B*13:01，该HLA-B*13:01等位基因作为标记基因。