CN104812301B - 暴露系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及获得气溶胶到模型材料的受控的暴露的方法。本发明还提供了一暴露帽和用于研究或预计模型材料例如细胞和雾化试剂之间的相互作用的系统。气溶胶到模型材料的受控的暴露使得可以精确地计算气溶胶暴露的质量平衡。
Description
技术领域
本发明涉及用于研究模型材料和气溶胶的受控制的相互作用的方法和系统。
背景技术
存在强大的驱动力研发新的可靠的体外试验以减少在环境研究领域以及在药物行业二者中的动物试验的数目。存在许多研发来用于使用培养细胞系统模拟毒剂或治疗剂暴露的体外系统。一些系统被研发用于模拟皮肤，而其他的系统被研发以模拟胃肠管道和呼吸道。呼吸道或许是模拟起来最复杂的，因为培养气道上皮细胞应当通过仅覆盖细胞表面的一薄层流体直接地暴露于空气中；所谓的空气吸升状况。这是特别的问题，如果细胞应当暴露于空气传播的粒子中。用于反复性的暴露一个假定是以较小体积产生的解聚集的粒子气溶胶(aerosol)，其是通过根据由Inhalation Sciences Sweden AB(ISAB)研发的美国专利6,003,512的技术所提供的。ISAB还已经研发了一种喷雾干燥技术(WO 2004/041900)，其可将较小部分的物质快速地重新配制成高产量的细粉末，以用于喷粉枪机械中，喷粉枪气溶胶发生器已经被证明与啮齿类动物的分离的、换气的和灌注的肺(IPL)结合是有用的，如在P.Gerde et al.Inhalation Toxicology，2004，16，45-52中所公开的，其中研究了柴油机烟灰的肺部沉积。在吸入暴露于候选药物期间，研究的物质在肺的目标区域中的沉积是一希望过程，其通过在供应设备中和在呼吸道的非目标区域中的沉积伴随有研究材料的不想要的损失。在用于吸入供应的药物的研发过程早期，物质损失是经由吸入的防止经常的决定性的早期试验的关键因素。两个较大的机构导致当气溶胶正流过管道(duct)时的粒子的壁沉积：空气动力损失和静电损失。空气动力损失是由粒子的扩散、沉积、嵌塞和阻截贡献的并且主要受到研究的气溶胶的质量中值空气动力学直径(MMAD)和所研究的管道系统的流体动力学的影响。空气动力损失可通过理论模型很好地合理预测。静电损失附加在空气动力损失上并且强烈地依赖于所研究的粉末和管道系统的壁的材料性质。静电损失更不稳定且难以预测，并且可以是研究的气溶胶的主要的沉积机理。粉末气雾胶的该不可预测的行为导致不仅对呼吸道的气溶胶发生器设备的、暴露系统(exposure)和非目标区域的血管壁而且在需要获得研究对象中的目标暴露量的暴露参数的调节期间的物质损失。本发明的目的是要致力于该问题。静电方法也已经被设计以改善细胞培养中的气溶胶沉积。然而，这些方法更适合于纳米尺寸的粒子和经常空气污染源的非常稀的气溶胶，并不适合于临床有关的稠密的医药制品气溶胶。存在若干可用的方法，用于研究培养的气道细胞的是例如专门的培养小室(well)，其发育以使肺细胞在可渗透薄膜的上面生长以及灌注液的储室(reservoir)在该薄膜之下以在气道上皮和周围空气之间产生紧密接触，类似于体内的情况。Corning已经研发了“Transwell系统”，其中融合性的以及甚至纤毛的上皮细胞可被培养并用于试验中。存在可从Becton，Dickinson and Company；FalconTM获得的相似系统。Epithelix公司提供了即可使用的、完全地区分的上皮细胞，其具有在Transwell小室即MucilAir中培养的纤毛功能，但是它们没有一种方法，用于实施这样的细胞的受控制的暴露到可呼吸的气溶胶。Vitrocell公司提供了栽培-和暴露系统，其包括基于Transwell系统的细胞培养模块和专卖气溶胶暴露单元。该系统通过充满气溶胶流垂直嵌塞在研究表面上而实现粒子沉积在一表面上。然而，今天可用的该方法的主要缺点是：缺少合适的方法来产生具有足够浓度的同质的气溶胶并修正要被测试的化合物(compound)的粒子尺寸分配；最终不够的剂量控制。当然在该领域内存在对基于体外的方法的改善的需要。这样的改善是这样实现的：通过提供一种很好的受控制的方法，其适合于筛分因受到各种空气中悬浮粒子的影响的细胞培养；例如毒性测试，药物、诊断、新陈代谢研究，其中对发育-或区分或基因调节的影响可被研究(基因调节研究)等。
如在以下部分中描述的本发明消除了在该技术中的缺点中的至少一些并且提供了筛分(screening)模型，其使得可以更好地在体外研究气溶胶在类似呼吸道中的空气-血-阻挡层的模型材料上的受控制的暴露。
发明内容
本发明大体上提供一种用于受控的气溶胶暴露的改善的模型系统，其可基于类似于气道的自然空气-血-屏障(barrier)的模型材料以便支持用于后来的药物研发的候选物质如何遵循对呼吸道的服用(administration)进行沉积，吸收和代谢的预计。
改善的系统支持雾化的试验物质的淀积剂量和质量平衡的可靠的确定，同时最小化在暴露对象(模型材料)外部的设备中的雾化的药物的分配的剂量的损失并且允许在暴露系列之后设备沉积材料的恢复。还重要的是，雾化药物暴露到表面模型材料可被允许以类似于在药物的吸气的剂量之后肺中的过程。
为了该目的，本发明的系统包括来自气溶胶发生器和暴露单元的气溶胶输送配置。暴露单元包括暴露帽，包含模型材料的容器以及灌注托盘。这些部分和它们的改善将在下面的部分中进行描述。
在本发明的上下文中，“空气-血-屏障”表示空气和呼吸道的组织之间的分界面。典型地，传送气道的粘膜组织和肺的肺泡组织是空气-血-屏障的例子。
术语"气溶胶"常常称为液滴的雾；然而如在本发明的上下文中使用的术语指的是在空气流中的固体粒子的悬浮体。因此术语“气溶胶”还可以表示描述具有形成物的悬浮粒子的一定体积空气的气溶胶团。术语“气溶胶”，“粒子”，“气溶胶粒子”，“雾化形成物”和相似的在本发明的上下文中可互换地使用并且指的是由药学上活性的药物和被形成为用于气溶胶输送的载体组成的形成物的粒子。优选地，所述粒子可具有在0.005到10微米的范围内的直径。
术语接收材料被理解为广泛地限定为与气溶胶相互作用的模型材料，气溶胶的粒子沉积在模型材料上或其中，即一部分的完全服用的气溶胶剂量与所述接收材料相互作用。例如，所述细胞可以是单独培养的或共同培养的，单层的或若干层的，悬浮的或如类似于一件组织壁。
模型材料例如，细胞，可培养在可渗透载体例如薄膜优选地聚碳酸酯薄膜的一侧上或两侧上。
术语“暴露目标”也用在本发明的上下文中并且应当看作具有和“接收材料”相似的一般意义，所述“接收材料”即用于通过本发明的系统和方法进行气溶胶输送的目标。
术语模型材料是类似于呼吸道中的空气-血-屏障的模型。
术语模型材料可包括类似于呼吸道优选地肺道的空气-血-屏障的任何类型的材料。
接收模型材料例如细胞被理解为广泛地限定为与气溶胶相互作用的细胞，气溶胶的粒子淀积在细胞上或其中，即一部分的全部服用的气溶胶剂量与沉积细胞相互作用。
在本发明的上下文中，接收材料可以是一种包括分离的细胞的模型材料，单独培养的或共同培养的，单层的或若干层的，或在可渗透载体的两侧上的，悬浮的以及还如雷雨一块组织壁的。
在一个总的方面，本发明涉及一种获得模型材料到气溶胶的受控的暴露的方法。该方法包括以下步骤：提供包括模型材料的容器，将所述暴露帽插入到所述容器中以便在暴露期间获得基本上密封的环境，将受控的气溶胶流引入到暴露帽的上部部分并且通过围绕暴露帽的中心轴的旋转流动将气溶胶朝向模型材料的表面输送。模型材料因此被允许与气溶胶接触，同时模型材料容器受到保护使之免于与气溶胶接触。在暴露过程期间没有由模型材料保持的气溶胶通过暴露帽中的出口功能在轴向向上的流动中被输送走，与暴露帽中的向下的气溶胶流分离。出口功能可通过任何传统的流动产生设备提供以便辅助产生通过所述暴露帽的正确的流动。在一个方面，气溶胶通过围绕暴露帽的中心轴的旋转流动以当气溶胶暴露到所述模型材料时基本上已经减小的流量从所述进口被输送。在其他的术语中，围绕气溶胶流的中心轴的旋转已经停止或基本上停止。所述流量例如可被布置成当气溶胶朝向模型材料运行时逐渐减小。气溶胶的流量，当与模型材料的区域接触或被引入到该区域时，可减小到适于模型材料或任何其他的试验模型的状况的预定值。
在如此描述的方法中，暴露帽适合于符合(fit with)保持模型材料在它的底部的模型材料容器的尺寸并且延伸到它的上表面的区域以便在气溶胶暴露期间实现密封的环境。在下面更详细地描述的应用中，模型材料容器是一基本上圆筒形容器，细胞培养在它的底部中的薄膜上，并且暴露帽因此是适合的。在一个方面，所描述方法包括从在暴露帽的下部部分中的单个出口以与模型材料容器的中心轴一致的单个流输送剩余的气溶胶。在所述方法的一个方面中，所述气溶胶以沿着模型材料的表面的基本恒定的流剪切速率与模型材料接触，以便获得模型材料的均匀的气溶胶分配。所述方法还可以包括收集剩余的气溶胶在暴露过滤器中步骤，即气溶胶未沉积到所述模型材料。所述方法还可包括检测引入到暴露帽的气溶胶的浓度。由于这些理由，所述方法可进一步包括从检测到的气溶胶浓度，过滤器沉积的气溶胶和计算的气溶胶沉积因数估计暴露的沉积的剂量。在模型材料中包括活细胞的应用中，这些可在暴露期间通过气溶胶与灌注流体接触以便类似于气道-血屏障的状况。因此通过所述方法，在所述方法中，所述气溶胶包括试验物质，例如候选药物，该方法进一步包括确定从累积在灌注流体中的试验物质和从模型材料容器冲洗的剩余的试验物质的质量平衡，从而确定最初的暴露的沉积剂量。
所描述的本发明的方法有利地(1)最小化或抵消了气溶胶材料到用于执行模型材料容器例如暴露帽和管道的暴露所需要的设备的任何损失，(2)提供了用于尽可能均匀地暴露模型材料的表面的设备，以及(3)限制模型容器仅暴露到模型材料表面。所述方法暗含所述插入的暴露帽以合适的方式对准到容器中的模型材料因此基本上仅模型材料表面暴露到气溶胶。为了该原因，模型保持物质的正确的估计可被获得，即使整个模型容器在暴露帽已经被移除之后在合适的溶剂中被冲洗。在许多其他的优点中，所述方法特别地便于暴露和循环的质量平衡的正确的确定以及很好地可再生的暴露状况的建立。
所述方法可适于不同模式的引入气溶胶，用于暴露模型材料。在这一点上，本领域内的技术人员觉察到在许多应用中，会希望在遍及模型材料的朝向引入气溶胶的表面范围内产生均匀和受控的暴露。
许多不同方式的气溶胶浓度检测器可被预想到，例如通过光学设备的气溶胶粒子检测器。通过该方法，模型材料可受到一接触灌注流体，随后通过分馏收集(fractioncollection)被收集以便接近地确定模型材料和气溶胶之间的相互作用，例如模型材料中的活细胞如何代谢变化或如何对包含在气溶胶中的试剂(agent)作出生物学上的反应。
在一个方面，本发明涉及一种暴露帽，用于建立一受控的并且甚至可类似于空气-血屏障的模型材料到不同的试验气溶胶的暴露。暴露帽大体上设置有适于接收气溶胶的进口流的上部部分；和下部部分，适于对准所述模型材料，以随着它的模型材料的暴露收集气溶胶流并且保护模型材料容器使之免于受到气溶胶的影响。暴露帽从而包括一进口管道，具有切向定位的进口孔，用于接收气溶胶在它的上部部分并且用于产生从上部部分到下部部分的围绕中心轴旋转的气溶胶流动以便接触模型材料；以及单个出口管道，用于将来自于模型材料的剩余气溶胶从下部部分输送到上部部分中的出口。出口管道具有位于距离模型材料限定高度的出口孔，并且优选地出口管道沿着在暴露装置的上部部分和下部部分之间纵向地延伸的中心轴定位。旋转气溶胶流用来提供满足所述模型材料的在该流中的均匀的气溶胶浓度。该布置产生气溶胶的均匀的进口流，均匀或恒定的、受控的、流动剪切流可被实现为围绕模型材料的整个周边。这些状况可通过在进口管道中的气溶胶进口流量，进口孔的直径和模型材料和出口孔之间的高度进行控制。通过对这些参数建模，暴露帽可适合于为专门的气溶胶和模型材料设计的不同的暴露模型然而获得当气溶胶被引入到模型材料时对气溶胶浓度和流动剪切速率的控制。为了这些目的，所述暴露帽被设计或操作以允许旋转的气溶胶流动或气溶胶流动以及允许该旋转在暴露到模型材料之前停止或基本上停止，以便抵消气溶胶中的浓度梯度，同时从模型材料表面到出口管道的出口孔产生漏斗状的流动。暴露帽装置的设计和操作从而允许气溶胶和模型材料之间的均匀的和受控制的暴露状况。
在一个方面，暴露帽包括限定环形管的内壁的内部、中心主体，用于将气溶胶从切向进口孔输送到模型材料。内部主体具有容许在暴露帽的底部部分中的一环形缝隙，用于沿着模型材料表面将气溶胶从环形管输送到出口管道。在该布置中，环形缝隙在模型材料的上表面和内部主体的下端之间延伸。优选地，内部主体的下部部分包括从内部主体的周边下端延伸到内部管的出口孔的漏斗状的空腔，从而限定一空腔高度。在该实施例中，空腔高度和狭缝高度被适配因此气溶胶沿着模型材料的表面以基本上恒定的流动剪切速率输送。优选地，出口管道的进口孔具有小于环形管内壁直径的宽度的直径。优选地，出口管道基本上沿着在上部部分和下部部分之间纵向地延伸的一中心轴定位。另外地建议环形管的横截面区域小于模型材料的表面的3/4。
在一个方面，所述装置具有一内部中心主体，其在它的下部部分中带有面向模型材料的朝向暴露帽的内壁的漏斗状的延伸部，并且容许环形管具有横截面比环形缝隙基本上更大的面积。该布置有助于通过容许在气溶胶流动变换到朝向环形缝隙和模型材料的暴露区域的轴向向下流动之前的气溶胶的足够旋转而容许气溶胶的足够的均质性。
通过本发明的暴露帽，在圆形的模型表面之上的均匀的流动剪切场可通过旋转沿着周边从进口进来的气溶胶，然后通过调节在模型表面的中央上方的轴出口的高度来控制旋转体积，得以实现。在环面内的合适的旋转和向下运动可以这样被控制：通过1)气溶胶流量，2)进口管道进口管道嘴的横截面面积，以及3)可与空腔高度比较的环面的宽度。漏斗状的空腔的形状可用于微调在模型表面之上的旋转流场。
暴露帽可以在气溶胶的暴露期间获得基本上密封的环境的方式被对准到类似于空气血-屏障的模型材料。在该上下文中，“对准到”表示它充分地接近模型材料并且例如可表示暴露帽能够可释放地连接到包括模型材料的容器。在一个替代的选择中，暴露帽是筒状的形状，它还可以是截断的锥体。其他的形状是可想得到的以适合于符合具体的培养容器。暴露帽的出口管道，优选地被连接到暴露过滤器，用于收集从模型材料输送走的气溶胶粒子。进一步地，出口管道可被连接到转子流量计或质量流量调节器，用于控制流量。进一步地，暴露帽适于由最小化或抵消气溶胶粘附到它的气溶胶暴露表面的材料制成，因此粒子的不想要的沉积在它的内部表面上被最小化。合适的材料可以是喷射模压塑料，例如特氟纶。
本发明还涉及适合于研究或预计类似呼吸道中的空气-血-屏障的模型材料和气溶胶之间的相互作用的系统。该系统包括暴露单元和将来自于气溶胶产生源的气溶胶输送到暴露单元的气溶胶输送单元。暴露单元包括如在以上的前述部分中描述的暴露帽，容器包括一模型材料，其适合于接收暴露帽以使得模型材料获得即气溶胶的受控的暴露。暴露单元进一步包括灌注托盘，用于建立灌注流体和容器中的模型材料之间的接触。用于建立气溶胶暴露的模型材料和灌注流体之间的接触的合适的布置件描述在WO 2008/153493中。气溶胶输送布置件将来自于气溶胶产生源的气溶胶输送到暴露帽的进口孔。气溶胶输送布置件包括具有一个或多个支流的暴露流动管线，所述分支连接到一个或多个暴露帽以将来自于所述暴露管线的气溶胶输送到暴露帽的气溶胶进口。有利地，暴露流动管线的出口设置有端部过滤器以便获得还没有分配到暴露单元的任何气溶胶的控制。气溶胶输送布置件还被密封地连接到一气溶胶发生器，该气溶胶发生器是在美国专利号6，003，512中公开的类型，其适合于产生高质量的气溶胶。气溶胶输送布置件还可以包括气溶胶粒子检测仪器以改善多少剂量抵达模型材料的暴露目标的控制。气溶胶输送布置件进一步可包括在WO2009/002267中公开的特征，例如在该文献中描述的竖直取向的成圆锥形形状的类型的气溶胶保持室。在该系统中，灌注托盘优选地连接到容器并且它设置有用于灌注流体的进口和用于灌注流体的出口。灌注托盘的进口优选地布置成因此基本上整个的模型材料通过气溶胶在暴露循环期间和之后与流动灌注流体均匀接触。灌注托盘的合适的设计的横截面基本上是圆形的，即使其他的配置是完全可想得到的，具有对称地位于该托盘的周边区域的进口和出口。优选地，进口和出口在径向相对方向上位于至少两个平行脊之间，用作用于灌注流体的流量控制器或流量调节器。在一个方面，所述脊分别到进口和出口是平行和等距离的，以便容许沿着所述薄膜的受控的、定向的流路。例如，两个平行的脊从基本上圆形的托盘壁在相反方向上延伸，同时所述脊具有分别逆着进口和出口流的相同的角度。为了进一步控制灌注状况和在分馏收集器或类似地辅助装置中的灌注流体的正确的收集，灌注托盘可被连接到能够控制对所述薄膜施加的流体压力的控制装置。为了该目的，控制装置可监视和调节在连接到灌注托盘进口的灌注流体容器中的灌注流体的水平。在该系统中，灌注托盘，暴露帽及所述系统的其他部分作为可任意处理的单元是可利用的。
以下详细的描述示出本发明的系统的若干例子以及它的操作，它们不是用来限制如由所附权利要求综述的保护范围。
附图说明
图1示出根据本发明的用于暴露培养细胞到气溶胶的系统的示意图；
图2示出插入到传统细胞培养容器的暴露单元、暴露帽和灌注托盘的示意图；
图3示出如插入到附连于灌注托盘的细胞培养容器中的暴露帽的实施例；
图4示意性地示出灌注托盘。
具体实施方式
在本发明被公开和详细描述之前，要理解到，本发明不限于在此公开的特定化合物、配置、方法步骤、衬底和材料，因而配置、方法步骤、衬底和材料可稍微变化。
还要理解到，在此使用的术语是用于仅描述特定实施例的目的并不是用来进行限制，因为本发明的范围仅由所附的权利要求及其等同物限制。
如果别的没有被限定，在此使用的任何术语和科学术语是用来具有通常由本发明相关的技术领域内的人员所理解的意义。
必须注意到，如在该说明书中和所附的权利要求中所使用的，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数对象，除非上下文中另有清楚地规定。
如在整个说明书和权利要求中与数字数值有关地使用的术语“about(大约)”表示本领域内的技术人员熟悉和可接受的精度的区间。所述区间是±10％。
本发明的其他特征和使用及它们的有关优点对所属技术领域的专业人员而言在阅读了所述描述和所述例子时将是显而易见的。
要理解到，本发明不限于在此示出的特定实施例。以下例子被提供用于说明的目的并不是用来限制本发明的范围，因为本发明的范围仅由所附的权利要求及其等同物限制。
图1示出用于研究模型材料即细胞层在体外到试验气溶胶的受控的暴露的装置的示意图。
该系统包括位于光束仪器(100)的左侧的气溶胶发生器(未示出)，连接到端部过滤器(102)的暴露流动管线(101)，暴露流动管线包含三个分支点(104)，每个分支点分别连接暴露单元(105)到暴露流动管线(101)。暴露单元(105)包括暴露帽(106)，该暴露帽包括进口孔管道(107)和出口孔管道(108)，连接到转子流量计的暴露过滤器(109)。暴露帽(106)与细胞培养容器接触，未示出(参见图2)，其反过来与灌注托盘(111)(图3)接触，所述灌注托盘包括可连接到分馏收集器(114)(图1)的出口管道孔(113)。暴露单元的温度是通过使用加热块(120)进行控制的，一个或若干钻孔适于分别接收一个或若干暴露单元。加热块(120)优选地由钢制成。在图1中，所述装置被示出为具有三个暴露单元(106)，每个暴露单元包括具有培养细胞的商业培养容器。
当操作图1的系统时，气溶胶产生并经由耦连到暴露流动管线(101)的光束仪器(100)从气溶胶发生器(未示出)穿过，所述暴露流动管线包含三个分开的分支点(104)，每个分支点被连接到位于相应的暴露帽(106)的上部部分中的进口管道(107)。在每个暴露帽中，气溶胶围绕所述暴露帽的中心轴向下旋转的流动得以产生以使得每次基本上仅该层细胞被均匀地暴露到受控制量的可呼吸气溶胶。每个帽具有用于从下部部分穿过它的上部部分中的开口输送剩余气溶胶的出口管道(108)，其中暴露过滤器(109)收集所有剩余的气溶胶。转子流量计(未示出)被连接到每个都穿过暴露系统的每个分支产生恒定流量的出口管道(109)。另外，暴露管线的整个的流量是通过位于端部过滤器(102)的下游的又一个转子流量计或类似装置得以实现的。细胞培养容器包括一层细胞，其在可渗透薄膜的一侧或两侧上培养并且在可渗透薄膜的另一侧上由与气道粘膜中的血液循环类似的灌注液流体接触。灌注液流体的流量将被保持在与粘膜中的流量相似的流量。当对于直径为12毫米的膜模型在0.4ml/min的范围内选择时，更新流量将类似于粘膜中的。
在可渗透薄膜下方的灌注层的厚度(参见图2，115)将近似为0.5毫米，举例为0.2毫米，以类似于气道粘膜的毛细管的丰富表面网络的分配的方式。灌注液流体将以单程的方式由所述薄膜输送然后立刻分馏到合适的器皿中，例如96小室板，用于在质谱中进行分析。专门的分馏收集器已经被研发，其中分馏尺寸不取决于液滴形成并且仅是由用于样品收回的流量和希望的时窗进行控制。这样，多至三个小室可被暴露并且样品从一次气溶胶暴露中并行收回。仅在所述小室的底部的细胞层将会通过良好的表面平面度被暴露并且不在试验材料容器的内壁中(杯)，其是Cultexsystem和相似的系统的情况。气溶胶将围绕暴露帽的上部部分中的轴向定位的气溶胶出口(108)慢慢地向下旋转，随后经由位于覆盖细胞的圆形表面的中间上方的中心的气溶胶出口管道(108)被吸出暴露单元。
接下来暴露溶解物质的经上皮细胞(trans-epithelial)的吸收和由试验的物质引起的在细胞中的最后生物反应将被研究，因为它通过从所述细胞产生和排泄不同的标识物将是显然的。
图2示出包括传统的细胞培养容器(杯)的暴露单元(105)的示意图。虚线示出在那里暴露帽(106)和灌注托盘(111)分别被连接以组装包括在图1的系统中的暴露单元。图2的暴露帽(106)具有带切向定位的进口孔的进口管道(107)。暴露帽覆盖Transwell杯的内侧下至细胞覆盖薄膜(115)的边缘。这是要防止任何气溶胶暴露在细胞覆盖表面的外侧，并且用于细胞保持的气溶胶材料的正确数字将被获得，即使全部的Transwell单元在暴露帽和托盘已经被移除之后在溶剂中被冲洗。所述细胞在位于杯的底部处的可渗透薄膜上被培养并且由一薄层的灌注液灌注，所述薄层的灌注液以被选择为类似于气道粘膜的血液循环的构造的方式被泵送到灌注液托盘在可渗透薄膜下方的间隙中。图2进一步示出位于暴露帽中央的出口管道(108)，所述暴露帽具有在模型材料上方的限定高度处的出口孔，在此由细胞覆盖薄膜(115)表示。在操作中，气溶胶被引入通过进口管道(107)的切向进口孔并且在中空的暴露帽中向下旋转位于内壁和在中央且对称放置的出口管道(108)之间。旋转速度由气溶胶进口流量，进口孔的直径和出口孔和模型材料之间的高度，控制。具有气溶胶的均匀的流动剪切速率和浓度的流动现在将分配在模型材料上方用于暴露，漏斗状的流动将产生在出口孔的方向上。
图3示出具有内部主体(120)的暴露帽(106)的特定的实施例的横截面视图。暴露帽(106)被插入到使活细胞培养在所述薄膜(115)上的细胞培养容器(100)中。暴露帽在该插入位置暴露期间保护细胞容器内壁以便最小化和控制气溶胶输送损失。暴露帽(106)设置有用于气溶胶的进口管道(107)，该进口管道具有切向定位的进口孔和布置在内部主体(120)中央且对称布置的轴向延伸的出口管道(108)。环形管(122)允许在内部主体(120)和暴露帽的内壁之间，用于向下的气溶胶输送。内部主体(120)朝向由薄膜(115)的细胞表示的模型材料轴向延伸以允许一环形缝隙(124)。内部主体(120)的下部部分具有从周边延伸到出口管道(108)的位于中央的进口孔(128)的漏斗状的空腔或凹陷(126)。图3所示的实施例示出环形主体(122)如何在漏斗状的延伸部130中延伸，所述延伸部朝向内壁延伸以允许环形缝隙(124)。通过配置漏斗状的延伸部和尺寸环形管(124)基本上窄于所述环形管，在气溶胶中的浓度梯度可被避免或抵消，并且气溶胶的均质的暴露可被建立。通过如此配置的暴露帽，受控的和延伸的向下旋转流动可在气溶胶朝向所述暴露区域和薄膜(115)轴向地向下输送之前在所述暴露的上部部分中被建立。
在图3的布置的操作中，气溶胶通过进口管道(107)的切向定位的孔被引入，因此向下旋转的气溶胶流动在环形管(122)中被获得如所述的到所述环形缝隙(124)并且在气溶胶暴露期间沿着细胞培养物分配。剩余的气溶胶从所述细胞培养物通过空腔(126)被输送走并且进入到被连接到传统的流动产生设备(未示出)的出口管道(108)中。如此描述的实施例允许气溶胶沿着模型材料的表面的均匀的流动剪切速率，提供气溶胶粒子到培养细胞的均匀且受控的沉积从而实现在早前讨论中概述的本发明的许多优点。
图3还示出附连到带插入的灌注帽(106)的细胞培养容器(110)的灌注托盘(111)。图4示意性地示出具有径向相对的进口和出口(112，113)和充当灌注流分配器的两个居间的脊或挡板(119，119’)的灌注托盘(111)。灌注托盘用于使设置有的设备用于附连和密封到细胞培养容器，因此大约0.2毫米的间隙被提供在所述托盘和可渗透薄膜之间。如前所解释的，灌注托盘可容纳在加热块中。在操作中，系统的模型材料(例如细胞)与所述灌注流体接触。灌注流体流过灌注托盘，以便促进溶解和吸收到来源于所述模型材料中的粒子的溶质的循环血中。灌注流将接收溶解或代谢的试剂，并且通过模型材料和薄膜扩散并且被输送走用于后来的分析。灌注流体通常适于以类似于粘膜中具有高的更新速率的自然血流的方式与所述模型材料相互作用。典型地，这会相当于在12毫米直径的容器中的0.4ml/min量级的流量。更具体地说，灌注流体应当是与所述模型材料相容的生理上可接受的流体。灌注液对插入薄膜的压力可优选地这样进行调整：通过从所述插入件(inserts)调节灌注液出口管的水平以至于实现合适的压头，该压头具有作用于插入薄膜的负的或正的静压分量。然后这对防止在管出口处的小滴形成是重要的，因为在复现的液滴中的灌注液表面张力将引起对插入薄膜的波动的压力。
所描述的系统可有利地适合于同时提供受控的暴露到具有模型材料的多个容器，例如具有细胞的培养容器。所述容器可是传统类型的，具有模型材料，例如在薄膜上的细胞培养物。暴露帽优选地适合于在气溶胶暴露期间覆盖除了模型材料薄膜之外的所述容器的整个内部。有利地，在通过试验物质的暴露中，在移除暴露帽之后用溶剂冲洗所述模型容器将仅恢复(recover)模型保持的物质。所述系统通过在每个容器中建立相似或基本相同的暴露状况将很好地提供可靠的状况。为了建立可靠的控制系统，其中转子流量计或质量流量调节器控制并监视来自于暴露帽的出口管道中的流量并且从而将用来控制来自于暴露流动管线的分支的进口流，因此每个模型材料(细胞培养物)获得相似的暴露状况。
本发明的系统对当物质的细胞保留部分不能被测量时估计或预知气溶胶的沉积剂量，或者对用分离的细胞或另一模型材料进行进一步的药物动力学建模，是同样有用的。具有相似模型材料的模仿容器那么可以与研究容器一致地使用以估计气溶胶的沉积的剂量。
实施例的一个优点是所需要的试验化合物例如在药物成分中的活性物质的量较小。例如，小于1毫克的试验化合物足以同时暴露三个单元，每个单元分别包括12毫米的小室。因此，本发明允许筛分候选药物或其他有关的物质的改进的方法。
进一步地，本发明的受控的暴露使得可以容易控制系统中的质量平衡；即，气溶胶的沉积的剂量被计算为在模型材料例如细胞中的剩余物质和灌注液的累积量的总和。因为仅材料容器的模型材料表面被暴露到试验的气溶胶，材料保持物质的正确的分馏物可被获得，即使真个模型容器在分析溶剂中被冲洗。
另一个优点是模型材料连续地提供有新鲜的介质，即，灌注液流体，在那里使用的包含从气溶胶粒子吸收的或代谢的试验物质的灌注液流体被收集和分析。
进一步的优点是气溶胶可均匀分配到多个培养容器中，优选地同时三个培养容器(SD+/-15％)。
气溶胶与模型材料的相互作用会是由于物理化学性能例如粒子沉积密度，粒子尺寸，溶解和吸收率，或生化性质例如新陈代谢或其他的影响。
在本发明的上下文中，沉积的模型材料可以是培养细胞，例如分离的初级细胞，优选地分离的上皮细胞和可能地内皮细胞或其他相关的来自于呼吸道的细胞类型。
合适的细胞可以是分离的初级细胞，优选地分离的上皮的初级细胞或慢性阻塞性肺病(COPD)细胞或从遭受哮喘的人分离的细胞，它还可以是细胞系，例如549细胞，优选地上皮细胞源并且它还可以是分离的干细胞，优选地将区分成上皮细胞类型或任何类型的合适细胞的干细胞。在一个实施例中，细胞源自于呼吸道，更优选地来源于肺部细胞的分离的细胞。在另一实施例中，所述细胞与另一细胞类型即喂养细胞是共同培养的。
细胞培养容器可包括在模型薄膜的一侧或两侧上的一层或若干层细胞，或在悬浮液中培养的细胞。
培养的细胞还可以是共同培养物，例如与内皮细胞共同培养以类似于分别具有内部和外部的器官的壁的上皮细胞。
有利地，当基于候选药物与类似于空气-血-屏障的模型材料相互作用的性质筛分候选药物时可使用所述系统。第一，粉末状的一剂候选药物被雾化并且所述系统适合于确定沉积在所述材料容器中的预计剂量(Mdep)。第二，粉状药物的预计沉积现在可用于运行所述系统以将模型材料暴露到相同的气溶胶，用于确定候选药物与模型材料在希望的剂量的水平如何相互作用。在其他术语中，在模型材料中预期的剂量的确定，允许在当仅较少量的试验材料和较少的模型材料容器是可用的时所述系统可以最优化的暴露时间和其他的操作状况在随后的试验中用模型材料直接运行。所述模型材料可以是在培养容器/器皿中的细胞，优选地人细胞。优选地，输送气溶胶流被基本保持在相同的速率，其中所述流动是由转子流量计或质量流量调节器控制的。优选地和有利地，少量的药物被使用，在毫克范围内，例如0.1到3毫克。
通过以下这些惯例，在用最优化的量的昂贵的材料的操作中所述系统的总的优点是不同的候选药物之间的进一步增强且迅速的、可靠的辨别可在早期临床前的阶段优选地执行。通过该方法是可利用的的相互作用研究不仅包括候选药物的吸收研究，而且也同样是可行的，用于研究许多生理学的作用，包括施加在肺组织或经由肺组织施加的药物活性，例如新陈代谢，包括治疗作用的发作的药理学的和毒理学的反应，以及生物利用率和药物动力学方面。本发明的系统和使用该系统的方法将降低和简单化药物研发的发现和临床前阶段并且从而当正试图找到新的用于市场准入的全新的产品时对降低遭受增加的负担的工业成本是相当有益的。所述系统和方法在诊断应用中同样是有用的，其中所述的方法可应用于确定肺部的沉积和确定对试剂的气道敏感性。同样的优点对于与较低剂量和试验准确性有关的诊断应用将是显然的。为早前公开的方法、暴露帽和系统的形式的本发明还用来适合于药物形成物与市场上可买到的作为气溶胶发生器的吸入器或喷雾器的生物学批准。在这样的应用中，本发明允许根据粒子溶解和药物动力学特征的雾化的药物形成物生物学特性的方便的和可靠的估计，以及可利用的服用的适用性以充分地执行所选择的药物形成物的受控的肺部服用。
Claims (13)
1.一种获得模型材料到气溶胶的受控的暴露的方法，包括以下步骤：
i.提供包括所述模型材料的模型材料容器；
ii.将暴露帽插入到所述模型材料容器中以便在暴露期间获得基本上密封的环境；
iii.将受控的气溶胶流引入到所述暴露帽的上部部分并通过围绕所述暴露帽的中心轴的旋转流动将所述气溶胶朝向所述模型材料的表面输送；
iv.容许气溶胶接触所述模型材料，同时保护所述模型材料容器使之免受气溶胶接触的影响；以及
v.在轴向地向上定向的单独的流动中将剩余的气溶胶从所述模型材料表面输送走，
将剩余的气溶胶从所述暴露帽的下部部分中的单个出口以与所述模型材料容器的中心轴一致的单个流动输送，其中所述暴露帽包括中心主体(120)，用于将接收到的气溶胶输送到所述暴露帽的下部部分，所述中心主体的下部部分包括漏斗状的空腔。
2.根据权利要求1所述的方法，包括收集剩余的气溶胶在暴露过滤器中并从检测到的气溶胶浓度、过滤器沉积的气溶胶和计算的气溶胶沉积因素来估计所述暴露的沉积的剂量。
3.根据权利要求1所述的方法，包括检测引入到所述暴露帽中的气溶胶的浓度。
4.根据权利要求1所述的方法，包括通过灌注流体接触类似于气道-血屏障的模型材料。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述气溶胶包括试验物质，包括确定从所述模型材料容器冲洗的剩余的试验物质和在所述灌注流体中累积的试验物质的质量平衡，从而确定所述暴露的最初沉积的剂量。
6.根据权利要求1到5中的任一项所述的方法，该方法包括容许所述气溶胶沿着所述模型材料的表面以基本上恒定的流动剪切速率接触所述模型材料。
7.根据权利要求1到5中的任一项所述的方法，其中所述气溶胶的流量从所述暴露帽的上部部分朝向所述模型材料的表面减小，通过容许在所述上部部分中围绕中心轴的旋转流动变换为朝向所述模型材料的表面的轴向向下流动。
8.一种暴露帽装置(106)，用于建立模型材料到气溶胶的受控的暴露，所述暴露帽装置适于插入到模型材料容器中，所述暴露帽具有：
上部部分，适于接收气溶胶的进口流；以及
下部部分，适于对准到所述模型材料，以随着它的模型材料的暴露收集气溶胶流并且保护所述模型材料容器使之免受所述气溶胶的影响，其中大体上筒状的暴露帽包括：
(a)进口管道(107)，用于接收在所述上部部分中的气溶胶，其中所述进口管道设置有切向定位的进口孔，用于产生围绕中心轴的从上部部分到下部部分的旋转流动；以及
(b)单个出口管道(108)，用于将来自于所述模型材料的剩余气溶胶从下部部分输送到上部部分中的出口并且基本上沿着在所述上部部分和下部部分之间纵向延伸的中心轴定位，
容许一环形管(122)的内部中心主体(120)，用于将接收到的气溶胶输送到所述下部部分，其中所述内部中心主体(120)具有容许在下部部分中的环形缝隙(124)的延伸部，用于沿着模型材料表面将气溶胶从环形管输送到出口管道，所述内部中心主体的下部部分包括漏斗状的空腔。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述出口管道的出口孔具有小于所述环形管直径的宽度的直径。
10.根据权利要求8所述的装置，其中所述漏斗状的空腔(126)从所述内部中心主体的周边下端延伸到所述内部中心主体的出口孔，从而限定一空腔高度。
11.根据权利要求8到10中的任一项所述的装置，其中所述环形管的横截面面积小于所述模型材料的表面的3/4。
12.根据权利要求8到10中的任一项所述的装置，其中所述内部的中心主体具有朝向内壁的漏斗状的延伸部并且容许所述环形管具有基本上大于所述环形缝隙(124)的面积。
13.一种适合于建立类似于呼吸道中的气道-血-屏障的模型材料到气溶胶的受控的暴露的系统，该系统包括气溶胶输送布置件，用于将所述气溶胶从气溶胶产生源输送到暴露单元，其中：
(i)所述暴露单元包括：
(a)根据权利要求8-12中的任一项所述的暴露帽装置；
(b)包括在可渗透薄膜上的模型材料的容器，所述可渗透薄膜附连到所述暴露帽装置以当暴露到气溶胶时获得基本上密封的环境；
(c)灌注托盘(111)，用于建立流体进口和所述容器的可渗透薄膜的下侧之间的均匀的灌注流体接触；以及
(d)灌注流体出口，适于抵消出口处的液滴形成，以及
(ii)所述气溶胶输送布置件包括暴露流动管线(101)，包括一个或多个支流，该一个或多个支流被连接到暴露帽的一个或多个进口管道，以将所述气溶胶从所述暴露流动管线输送穿过所述暴露帽的气溶胶进口并且到位于暴露分支的下游的端部过滤器上。
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