CN104807691A - 肽的回收方法、肽的检测方法及试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供肽的回收方法，其包括：通过混合含肽和血中蛋白质的复合物的液体样品与含中性氨基酸、酸性氨基酸或这两者的试剂而使所述肽自所述血中蛋白质游离的工序，及回收游离的所述肽的工序。

Description

肽的回收方法、肽的检测方法及试剂
【技术领域】
本发明涉及从血液等的液体样品回收肽的方法、检测肽的方法及用于这些方法的试剂。
【背景技术】
在血液中含有白蛋白或球蛋白等蛋白质(以下，也称为血中蛋白质)，肽多与血中蛋白质结合。因此，为了检测血液中的肽，优选从血中蛋白质使肽游离。作为使肽游离的技术，可例举美国专利申请2012/0277407的技术。美国专利申请2012/0277407中记载的方法是通过加热处理含肽/白蛋白复合物的溶液而使肽非结合性的白蛋白形成自身聚集体，从而使肽从白蛋白游离的方法。
【发明内容】
本发明的范围仅由随附的权利要求定义，且不受此发明概述内容的任何影响。
【发明要解决的技术课题】
本发明旨在提供以高回收率及高纯化度从液体样品回收肽的方法、检测肽的方法及用于这些方法的试剂。
【解决课题的技术方案】
本发明人经锐意研究的结果发现，通过混合含肽和血中蛋白质的复合物的液体样品与含特定的氨基酸的试剂可以高回收率或高纯化度回收肽，从而完成本发明。
本发明提供肽的回收方法，其包括：
通过混合含肽和血中蛋白质的复合物的液体样品与含中性氨基酸、酸性氨基酸或这两者的试剂而使所述肽自所述血中蛋白质游离的工序，及
回收游离的所述肽的工序。
另外，本发明提供肽的检测方法，其包括：
通过混合含肽和血中蛋白质的复合物的液体样品与含中性氨基酸、酸性氨基酸或这两者的试剂而使所述肽自所述血中蛋白质游离的工序，及
检测游离的所述肽的工序。
另外，本发明是用于所述的方法的试剂，提供含中性氨基酸、酸性氨基酸或这两者的试剂。
【发明效果】
由本发明的方法及试剂，可以相比以往方法更高的回收率或高纯化度从含肽和血中蛋白质的复合物的液体样品回收肽。
【附图说明】
【图1A】是SDS-PAGE凝胶的条带强度的图。
【图1B】是SDS-PAGE凝胶的条带强度的图。
【实施方式】
以下参照附图描述本发明的优选的实施方式。
本发明的肽的回收方法(以下，也仅称为“回收方法”)的游离工序是通过混合含肽和血中蛋白质的复合物的液体样品与含中性氨基酸、酸性氨基酸、或者这两者的试剂(以下也称为“含氨基酸的试剂”)，使肽从血中蛋白质游离的工序。
在本发明的优选的实施方式中，液体样品是活体样品。作为活体样品，例如，可例举从活体采集的血液等的体液。另外，从血液取得到的血浆及血清也包括在活体样品中。液体样品可稀释使用，稀释率可由本领域技术人员适宜设定。
在本说明书中，“血中蛋白质”是指白蛋白、球蛋白等，血液中存在的蛋白质。此血中蛋白质在血液中与后述的肽结合而形成复合物，由本实施方式的游离工序游离肽。另外，游离肽的血中蛋白质在游离工序中的处理中凝集沉淀。
在本发明的实施方式中，回收的肽不特别限定，可为天然起源的肽，也可为合成肽。作为肽的长度，只要是可由本发明的方法回收的，就不特别限定。液体样品中的多肽之中尺寸比较大的(例如，血中蛋白质等)由本发明的游离工序中的处理而凝集沉淀，尺寸比较小的(例如，寡肽等)游离到液体中。此游离的多肽是可由本发明的方法回收的“肽”。并非液体样品中的全部的多肽被完全地沉淀或被完全地游离，根据多肽的不同，有的多肽也含在沉淀的凝集体中，有的多肽也含在游离的成分之中。由于这样的多肽也含在游离的成分(例如，上清)中，变得可回收，所以其也包括在本发明的“肽”中。再有，根据本发明的方法，由于只要氨基酸是130个残基左右的肽，就游离到样品中，所以适宜于回收不足130个残基的肽，但不限于此。再有，不仅是液体样品中原本存在的多肽，在由本发明的方法处理的过程中片段化的多肽也只要含在游离的成分中，就包括在本发明中的“肽”中。
在本发明的实施方式中，肽的等电点不特别限定，肽可为碱性肽、酸性肽及中性肽中的任何一种。
在本发明的实施方式中，肽可为来源于在活体内生成的分子，也可为来源于从活体外进入的分子。作为来源于在活体内生成的分子的肽，可例示在活体内生成的肽，或在活体内生成的多肽的片段等。
在本发明的实施方式中，肽也可为血液中存在的生物标志物。
作为那样的生物标志物的肽，可例举例如胃促生长素、脑性钠利尿肽(BNP)、肾上腺皮质刺激激素(ACTH)、心房性钠利尿肽(ANP)、缓激肽、α-内啡肽、C-肽、C3f片段、ITIH4片段、Aβ肽等，但不限于这些。即，在本发明中，在游离的肽中也可含至今未被鉴定的具有新的氨基酸序列的肽。
当以生物标志物作为检测对象时，本实施方式的方法可用于例如取得特定的疾病的存在或疾病的进行度的信息。即，可以推定，由本实施方式的方法从活体样品回收作为生物标志物的肽，通过对其进行定性及/或定量检测，可以取得能成为判断疾病的存在或疾病的进行度时的指标的信息。
另外，在本发明的实施方式中，肽也可为向活体施用的多肽、其代谢物、或者这些的片段。此时，本实施方式的方法可用于例如取得对于药剂感受性的信息。即，可以推定，由本实施方式的方法从活体样品回收作为药剂向活体施用的多肽或其代谢物，通过对其进行定性的及/或定量检测，可以取得能成为判断所述药剂的感受性等时的指标的信息。
另外，在本发明的实施方式中，肽也可为不是检查对象的活体来源的，而是从活体外侵入活体内的。作为例，可例举病原体(细菌、病毒等)来源的肽等。此时，本实施方式的方法可例如为了取得对向病原体的感染的信息而利用。即，可以推定，由本实施方式的方法从活体样品回收构成病原体的蛋白质来源的肽或病原体生成的毒素(例如志贺菌毒素等)来源的肽，通过对其进行定性及/或定量检测，可以取得能成为判断向所述病原体的感染时的指标的信息。
在本发明的实施方式中，不使用碱性氨基酸。由于碱性氨基酸作为蛋白质的凝集防止剂使用，从而认为对于通过如本实施方式一样使血中蛋白质凝集而回收肽的方法不适宜。因此，在本实施方式中，使用中性氨基酸或酸性氨基酸。作为中性氨基酸，可例举甘氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸及半胱氨酸；作为酸性氨基酸，可例举天冬氨酸及谷氨酸。也可使用2种以上中性氨基酸，也可使用2种以上酸性氨基酸。另外，也可联用中性氨基酸1种以上和酸性氨基酸1种以上。氨基酸可为L体或D体之任何，也可为天然氨基酸或合成氨基酸中的任何一种。
在本发明的实施方式中，“含氨基酸的试剂”只要是含所述的氨基酸之中的至少1种的，就不特别限定，可为固体，也可为溶液状。优选而言，试剂是固体。
当含氨基酸的试剂是固体时，该试剂可为以上列举的各氨基酸本身，也可为含所述列举的氨基酸之中的至少1种的氨基酸的混合物，也可在不妨碍本发明的实施的范围内再含以上列举的氨基酸以外的成分。
当含氨基酸的试剂是溶液状时，该试剂是以上列举的氨基酸之中的至少1种氨基酸的溶液，在不妨碍本发明的实施的范围内也可再含以上列举的氨基酸以外的成分。溶剂只要适宜于所述的氨基酸的溶解，就不特别限定，本领域技术人员可适宜选择。作为那样的溶剂，可例举例如水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。
在本发明的实施方式中，相对于液体样品的试剂的添加量只要是氨基酸的最终浓度相比血中的氨基酸浓度变得更高的量，就不特别限定，本领域技术人员可适宜设定。那样的添加量优选为氨基酸的最终浓度达1mM以上、再优选为3mM以上的量。
在本发明的优选的实施方式中，本发明的回收方法还包括加热处理由液体样品和试剂的混合得到的混合液的工序。混合液的加热处理中的温度和时间只要在混合液中的肽不因热而完全变性的范围内即可。其中“肽完全地变性”是指肽变性为不可能检测的程度。
这样的加热处理温度可由本领域技术人员适宜设定，但优选在50℃以上260℃以下进行，更优选在100℃以上260℃以下，再优选在120℃以上260℃以下进行。
加热处理时间另外也可由本领域技术人员适宜设定，优选进行30秒钟～5分钟、更优选进行1～3分钟。
加热处理中的升温速度不特别限定，可由本领域技术人员适宜设定。
在本发明的实施方式中，加热处理的方法只要是可以所述的温度加热混合液的方法，就不特别限定，选自现有技术中公知的方法。作为那样的方法，可例举例如由从外部的热传导加热、由微波加热等。
另外，在本发明的实施方式中，用于加热处理的装置只要是可一边调节混合液的温度一边加热的装置，就不特别限定，可例举例如水热反应器、微波照射装置等。
由上述的工序，从混合液中的肽和血中蛋白质的复合物形成被认为是血中蛋白质的自身聚集体的沉淀物。在专利文献1中报告，认为白蛋白的自身聚集体因热变性而使高级结构发生变化，几乎失与肽结合的能力。从而，不旨在受特定的理论约束，作为可说明本发明的回收方法的机制的1个假说，在本发明的回收方法中，在形成被认为是血中蛋白质的自身聚集体的沉淀物时，认为肽从血中蛋白质游离。
所述的沉淀物不溶于混合液中含的溶剂，在加热处理后的混合液中沉淀。即，加热处理后的混合液被分离为被认为是血中蛋白质的自身聚集体的沉淀物和含肽的上清级分。
在本发明的实施方式中，作为样品使用所述的上清级分，通过用现有技术中公知的方法解析，可确认肽从血中蛋白质游离而以游离的状态下存在于混合液中。作为那样的方法，可例举例如电泳法、质谱分析法等。
在本发明的肽的回收方法的回收工序中，从加热处理后的混合液除去沉淀物的方法不特别限定。例如，可用药匙等直接取出沉淀物，也可使用市售的分离器或滤纸等除去该沉淀物。如此，本发明的回收方法可通过从加热处理后的混合液除去沉淀物，取得含游离的肽的上清级分而回收肽。
如上所述，认为白蛋白的自身聚集体不与肽结合。从而难以认为，被认为作为主成分含白蛋白的血中蛋白质的自身聚集体的沉淀物与肽结合。但是，由于此沉淀物有如海绵一样吸水性，在该沉淀物中，掺合了含肽的上清级分。
从而，在本发明的回收方法中，也可再含从除去的沉淀物取得含肽的上清的工序。作为从沉淀物取得含肽的上清的方法，例如可将该沉淀物放入超滤管，通过离心榨取上清，也可通过将该沉淀物用均浆器搅拌而取得上清。再有，在从此沉淀物取得含肽的上清的方法中，没必要进行加热处理。
作为以往的方法，有为了除去血中蛋白质，使血液样品通过与白蛋白特异性地结合的柱，使白蛋白吸附到柱上而得到血液中游离的肽的方法。但是，根据Lowenthal等的报告(Clin.Chem.，vol.51,1933-1945(2005))，在血清中98％的肽与白蛋白结合。即，在吸附除去白蛋白而取得肽的方法中，根据本实施方式的方法，由于肽也与白蛋白一同被除去，从而有仅可取得极其微量的肽的问题。
但是，根据本实施方式，由于与白蛋白等的血中蛋白质结合的肽游离之后被回收，更有效的肽回收变得可能。
另外，本发明也包括肽的检测方法。根据此检测方法，由以往公知的方法检测由所述的游离工序游离的肽。其中，检测包括定量的检测、定性的检测、半定量的检测(阴性、弱阳性、强阳性等的判断)。由此检测方法得到的结果可为了取得所述的疾病的判断、药剂感受性、感染症的有无等的信息而使用。
接下来，由实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
【实施例】
【实施例1】
【(1)含肽和血中蛋白质的复合物的液体样品的制备】
作为肽，使用将含ACTH的1位～24位的氨基酸的ACTH部分肽经作为红色荧光染料的四甲基若丹明(TMR)标记的TMR-ACTH部分肽(株式会社BIOLOGICA)。再有，ACTH是碱性肽(等电点pI＝10.64)。将从健康者来源的全血(ProMedDx公司购入)用0.5×磷酸缓冲性生理盐水(0.5×PBS[pH＝7.4]、氯化钠(最终浓度68.5mM)、磷酸氢二钠(最终浓度4mM)、氯化钾(最终浓度1.3mM)、磷酸二氢钾(最终浓度0.7mM))稀释10倍，向得到的稀释液添加ACTH部分肽至其最终浓度成2μM，制备含肽/血中蛋白质复合物的液体样品。
【(2)含肽/血中蛋白质复合物的液体样品的加热处理】
向所述的含肽/血中蛋白质复合物的液体样品，以示于各自下述的表1的最终浓度添加各种氨基酸(L-丝氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸及L(-)-脯氨酸(和光纯药工业株式会社制)、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、DL-甲硫氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸及L-赖氨酸(SIGMA-ALDRICH公司制)、L-谷氨酰胺(ICN Biomedicals公司制)、L-精氨酸(株式会社Nacalai tesque制))或作为氨基酸衍生物的聚甘氨酸(SIGMA-ALDRICH公司制)、三甲基甘氨酸(和光纯药工业株式会社制)或甘氨酰甘氨酸(和光纯药工业株式会社制)，得到含肽/血中蛋白质复合物和氨基酸的混合液。
【表1】
氨基酸 浓度
无添加 -
Gly(甘氨酸) 2000mM
Gly(甘氨酸) 500mM
Thr(苏氨酸) 500mM
Asn(天冬酰胺) 150mM
Gly+Thr 500mM+450mM
Asn+Thr 90mM+300mM
Ser(丝氨酸) 500mM
Met(甲硫氨酸) 255mM
Val(缬氨酸) 500mM
Trp(色氨酸) 50mM
Gln(谷氨酰胺) 128mM
Ile(异亮氨酸) 150mM
Phe(苯丙氨酸) 160mM
Ala(丙氨酸) 500mM
Pro(脯氨酸) 500mM
TMG(三甲基甘氨酸) 500mM
(Gly)n(聚甘氨酸) 0.05％(w/v)
(Gly)2(甘氨酰甘氨酸) 500mM
Lys(赖氨酸) 500mM
Arg(精氨酸) 500mM
将得到的混合液(1.5mL)移到10mL容积的玻璃试管，接下来用特氟隆制的试管用耐压密封座(Milestone General株式会社)密封，然后使用微波照射装置(MultiSYNTH型、Milestone General株式会社)，经30秒钟从室温(25℃)升温至100℃，其后通过经1分钟从100℃升温到160℃来进行加热处理。加热处理后的冷却通过从与所述的微波照射装置连接的空气压缩机(YC-3R型、株式会社八重崎空压)将压缩空气吹向所述耐压密封座而进行。冷却速度设为每分钟20℃。作为对照，将不添加氨基酸或氨基酸衍生物的所述的液体样品(1.5mL)同样地密封后进行同样的加热处理。在加热处理后的混合液或液体样品中，均见不到沉淀物。
【(3)肽及血中蛋白质的检测】
以加热处理后的上清级分作为样品，进行SDS-PAGE。具体而言，混合作为10×加样缓冲液(宝生物株式会社)及60％(w/w)甘油溶液的1:1混合物的样品缓冲液(还原剂非添加)和所述样品，使用NuPAGE4-12％Bis-Tris凝胶及NuPAGEMES SDS电泳缓冲液(均来自Life Technologies日本株式会社)，以200V(定电压)进行30分钟电泳。电泳槽使用EXEL SURE-LOCK MINICELL(LifeTechnologies日本株式会社)、电源装置使用Power Station1000×P(ATTO株式会社)。对于电泳后的凝胶，使用荧光成像仪(Pharos FXMolecular Imager型、Bio-Rad Laboratories株式会社)检测TMR-ACTH部分肽，由银染色检测HSA。在银染色中使用银染色试剂盒“EzStain Silver”(ATTO株式会社)。染色的各工序如下。固定：用固定液100mL(超纯水40mL+甲醇50mL+醋酸10mL+试剂盒瓶S-11mL)振荡10分钟；清洗：用超纯水100mL振荡10分钟×3次；染色：用染色液(超纯水100mL+试剂盒瓶S-21mL)振荡10分钟；清洗：用超纯水100mL振荡30秒钟，用显色液100mL(超纯水200mL+试剂盒瓶S-31mL+试剂盒瓶S-41mL)振荡30秒钟；显色：用显色液100mL振荡5～10分钟；停止：用停止液100mL(超纯水100mL+醋酸1mL)振荡10分钟；清洗：用超纯水100mL振荡5分钟×2次。振荡机使用体外摇床Wave-SI(TAITEC株式会社)。基于这些荧光成像及银染色的结果，使用图像处理软件ImageJ 1.46r(NIH)求出肽或蛋白质残渣的光密度测定法值，各自根据下述式1及2算出回收率及纯化度。
回收率＝(氨基酸添加时(水热后)的光密度测定法值)/(氨基酸无添加时(水热后)的光密度测定法值)…式1
纯化度＝(氨基酸无添加时(水热后)的凝胶光密度测定法值)/(氨基酸添加时(水热后)的凝胶光密度测定法值)…式2
再有，对于本实施例往后的实施例中的“回收率”，由于相比进行水热反应，不添加氨基酸而回收肽的以往技术，本发明显示更奏显著的效果，根据所述式1，使用利用本实施例的处理(水热反应及氨基酸添加)后的测定样品时的光密度测定法值与使用对照的测定样品(作为以往技术的、氨基酸无添加而进行水热处理的测定样品)时的光密度测定法值的比。对于“纯化度”也同样。从而，“回收率”及“纯化度”表示为以对照的测定样品作为1时的相对值。
再有，由于预计在荧光成像中检测的氨基酸添加时的肽的条带变得相比氨基酸无添加时的肽的条带更浓，所以预计氨基酸添加时的肽条带区域中的光密度测定法值相比氨基酸无添加时(水热后)的条带区域中的光密度测定法值变得更大。从而认为，由式1算出的回收率在能够以良好的回收率回收肽时变大。
另外，由于预计在银染色中检测的氨基酸无添加泳道的银染色像相比氨基酸添加泳道的银染色像变得更浓，所以预计氨基酸无添加泳道(水热后)的凝胶光密度测定法值相比氨基酸添加泳道的凝胶光密度测定法值变得更大。从而认为，由式2算出的纯化度在可以良好的纯化度回收肽时变大。
再者，作为用于综合判断氨基酸添加效果的指标，算出回收率×纯化度的值。
结果示于下述的表2。
【表2】
氨基酸 回收率 纯化度 回收率×纯化度
无添加(水热后) 1 1 1
Gly 2000mM 2.36 8.12 19.15
Gly 500mM 1.56 4.72 7.36
Thr 3.08 2.46 7.59
Asn 3.11 1.75 5.44
Gly+Thr 2.35 2.2 5.18
Asn+Thr 2.35 1.93 4.54
Ser 2.62 1.61 4.22
Met 1.82 2.11 3.83
Val 1.85 2.05 3.8
Trp 2.51 1.2 3.02
Gln 2.3 1.28 2.95
Ile 2 1.36 2.72
Phe 1.64 1.41 2.32
Ala 1.07 2.04 2.18
Pro 1.43 1.3 1.86
TMG 0.82 0.94 0.78
(Gly)n 0.73 0.98 0.72
(Gly)2 0.12 1.03 0.12
Lys 0.11 0.68 0.07
Arg ND 0.86 ND
结果，对于甘氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸/苏氨酸的组合，天冬酰胺/苏氨酸的组合，丝氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸及脯氨酸而言，无论添加任何氨基酸，也与不添加氨基酸时相比，回收率×纯化度的数值增大。另一方面，对于三甲基甘氨酸、聚甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、赖氨酸及精氨酸而言，无论添加任何氨基酸，也见不到回收率×纯化度的数值的增大。
结果显示，对于甘氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸/苏氨酸的组合，天冬酰胺/苏氨酸的组合，丝氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸及脯氨酸而言，无论添加任何氨基酸，也与不添加氨基酸时相比，能够以良好的回收率及纯化度回收肽。
【实施例2】
【(1)含肽和血中蛋白质的复合物的液体样品的制备】
将全血用0.5×PBS稀释10倍，将得到的稀释液用TMR标记的BNP(TMR-BNP)(等电点pI＝10.95)、用TMR标记的Iqp(TMR-Iqp)(等电点pI＝6.75)及用TMR标记的C-肽(TMR-C-肽)(等电点pI＝3.45)(株式会社BIOLOGICA)而以2μM的最终浓度添加，制备含肽/血中蛋白质复合物的液体样品。其中，Iqp是指将含IQ及泛素样结构域的蛋白的326-第337部分肽的第330个丝氨酸取代为天冬氨酸的物质。
【(2)含肽/血中蛋白质复合物的液体样品的加热处理】
向所述的含肽/血中蛋白质复合物的液体样品以1500mM的最终浓度添加甘氨酸，得到含肽/血中蛋白质复合物和氨基酸的混合液。
将得到的混合液(1.5mL)移到10mL容积的玻璃试管，接下来用特氟隆制的试管用耐压密封座(Milestone General株式会社)密封，然后使用微波照射装置(MultiSYNTH型、Milestone General株式会社)，经30秒钟从室温(25℃)升温至100℃，其后通过经1分钟从100℃升温到160℃而进行加热处理。加热处理后的冷却通过从与所述的微波照射装置连接的空气压缩机(YC-3R型、株式会社八重崎空压)将压缩空气吹向所述耐压密封座而进行。冷却速度设为每分钟20℃。作为对照，将不含甘氨酸，含各种肽的所述的液体样品(1.5mL)同样地密封后，进行同样的加热处理，将使用此样品得到的回收率及纯化度设为1。在加热处理后的混合液或液体样品中，均见不到沉淀物。
【(3)肽及血中蛋白质的检测】
作为样品使用加热处理后的上清级分，测定对各种肽的荧光光谱。具体而言，将所述的样品(0.6mL)放入石英池，使用F-7000形分光荧光光度计(株式会社日立HighTechnologies制)照射激发光(540nm)，测定580nm处的荧光光谱。基于结果，各自根据下式3算出回收率。结果示于下述的表3～6。
回收率＝(氨基酸添加时(水热后)的荧光光谱峰值*)/(氨基酸无添加时(水热后)的荧光光谱峰值)…式3
(*：峰值是580nm附近的极大值)
再有，预计氨基酸添加时的荧光光谱的峰值相比氨基酸无添加时的荧光光谱的峰值变得更大。从而认为，由式3算出的回收率在能够以良好的回收率回收肽时变大。
【表3】ACTH部分肽(等电点＝10.64)
添加甘氨酸 回收率 纯化度 回收率×纯化度
无(水热后) 1.00 1.00 1.00
有 3.6 3.38 12.2
【表4】BNP(等电点＝10.95)
添加甘氨酸 回收率 纯化度 回收率×纯化度
无(水热后) 1.00 1.00 1.00
有 3.6 3.09 11.0
【表5】Iqp(等电点＝6.75)
添加甘氨酸 回收率 纯化度 回收率×纯化度
无(水热后) 1.00 1.00 1.00
有 3.2 2.50 8.00
【表6】C-肽(等电点＝3.45)
添加甘氨酸 回收率 纯化度 回收率×纯化度
无(水热后) 1.00 1.00 1.00
有 1.8 2.23 3.95
结果，能够以在使用TMR-ACTH(1-24)时12.2倍，在使用TMR-BNP时11.0倍，在使用Iqp时8.00倍，在使用C-肽时3.95倍优良的回收率×纯化度回收肽。
结果显示，由本发明的回收方法能够以良好的回收率及纯化度地回收各种各样的等电点的肽。
【实施例3】
除了使用的氨基酸作为甘氨酸0mM(无添加)、10mM、100mM、500mM或1500mM，回收率的算出与实施例2同样地进行以外，与实施例1同样地评价回收率及纯化度。结果示于下述的表7。
【表7】
氨基酸最终浓度 回收率 纯化度 回收率×纯化度
无添加(水热后) 1.00 1.00 1.00
10mM 1.56 0.92 1.43
100mM 3.79 1.44 5.45
500mM 4.16 2.20 9.12
1500mM 4.89 5.05 24.6
结果，能够以在将甘氨酸最终浓度设为10mM时1.43倍、在设为100mM时5.45倍、在设为500mM时9.12倍、在设为1500mM时24.6倍优良的回收率×纯化度回收肽。
结果显示，由本发明的回收方法能够以广泛的氨基酸浓度，以良好的回收率及纯化度回收肽。
【实施例4】
首先，将从健康者来源的人血清(ProMedD公司购入)用0.5×PBS稀释10倍，添加作为模型肽的TMR标记ACTH部分肽。将得到的血清/肽的混液1.5mL于160℃加热处理，与实施例1同样地得到对氨基酸无添加样品的荧光成像像、银染色像及凝胶光密度测定法的数据。对于向所述的血清/肽的混液加各种氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸或半胱氨酸；最终浓度示于下述的表8)而得到的氨基酸添加样品(均1.5mL)也进行同样的加热处理，与实施例1同样地得到对各种氨基酸添加样品的荧光成像像、银染色像及凝胶光密度测定法的数据。基于得到的数据，评价回收率及纯化度。结果示于下述的表8。
【表8】
结果，添加甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸及半胱氨酸之任何，也与不添加氨基酸时相比，回收率×纯化度的数值增大。
结果显示，添加甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸及半胱氨酸之任何氨基酸，也与不添加氨基酸时相比，能够以良好的回收率及纯化度回收肽。
【实施例5】
除了作为氨基酸，以最终浓度150mM使用天冬酰胺，及于130℃、140℃、150℃或160℃进行加热处理温度以外，与实施例4同样地得到荧光成像像、银染色像及凝胶光密度测定法的数据。再有，向130℃、140℃及150℃的升温通过经30秒钟从室温(25℃)升温至100℃，其后再通过以1℃/秒升温而从100℃升温至各温度之后，各自保持在各温度30秒钟、20秒钟及10秒钟而进行。结果示于下述的表9。
【表9】
实验条件 回收率 纯化度 回收率×纯化度
无氨基酸添加，加热处理温度160℃ 1.00 1.00 1.00
Asn添加、加热处理温度160℃ 6.84 2.46 16.83
Asn添加、加热处理温度150℃ 4.70 2.01 9.46
Asn添加、加热处理温度140℃ 3.89 2.12 8.22
Asn添加、加热处理温度130℃ 2.44 2.13 5.21
结果，与不添加氨基酸时相比，在Asn添加后加热处理工序中升温到130℃～160℃的温度时，回收率增大到约2倍～7倍，及，纯化度增大到约2倍～约2.5倍，肽的回收率×纯化度的值增大到约5倍～约17倍。
结果显示，由本发明的肽回收方法，可在广泛的加热处理温度以优良的回收率及纯化度回收肽。
【实施例6】
作为成为回收对象的肽，使用129残基的卵白来源盐酸溶菌酶(Wako 120-02674Lot LAQ6504；约15kDa)。将此溶菌酶溶解于PBS，其中添加2M甘氨酸溶液，得到测定样品1。测定样品1中的溶菌酶的浓度是10mg/mL、甘氨酸的浓度是1M。使用等量混合测定样品1和Tris-磷酸混合系缓冲液(Tris·HCl[pH＝7.0](最终浓度100mM)、磷酸钠(最终浓度0.4mM)及NaCl(最终浓度6mM))的溶液(水热无)，进行SDS-PAGE。凝胶的条带强度的图示于图1A。另外，将1.4mL的测定样品1放入10mL容瓶，进行与实施例1同样的水热反应。使用等量混合水热反应后的测定样品1、所述Tris-磷酸混合系缓冲液、磷酸钠及NaCl的溶液进行SDS-PAGE。凝胶的条带强度的图化示于图1B。
在图1A中，在15kDa的位置见到大的峰。这与溶解于样品中的溶菌酶的尺寸一致。在图1B中，可在15kDa的位置确认峰，但与溶菌酶的PBS溶液的峰(图1A)相比，其大小大幅地降低。代之，在3.5～10kDa及不足3.5kDa的位置检测到峰。这被认为是溶菌酶被片段化的片段。从而，图1B的结果显示，使用本发明的肽回收方法，也可回收溶菌酶本身，另外，也可回收溶菌酶的片段。
【比较例1】
除了作为氨基酸使用作为碱性氨基酸的精氨酸(5mM、2mM、或者0.5mM)或赖氨酸(5mM、2mM、或者0.5mM)以外，与实施例4同样地尝试肽的回收。
但是，这些氨基酸未使血中蛋白质凝集，无法进行肽的回收。

Claims (10)

1.肽的回收方法，其包括：
通过混合
含肽和血中蛋白质的复合物的液体样品、与
含中性氨基酸、酸性氨基酸或这两者的试剂
而使所述肽自所述血中蛋白质游离的工序，及
回收游离的所述肽的工序。
2.权利要求1所述的方法，其还包括加热处理所述液体样品和所述试剂的混合液的工序。
3.权利要求2所述的方法，其中所述加热处理在液体样品中的所述肽不因热而完全变性的条件下进行。
4.权利要求2所述的方法，其中所述加热处理通过微波照射进行。
5.权利要求2所述的方法，其中在所述加热处理中，所述液体样品被加热到120℃以上260℃以下。
6.权利要求1所述的方法，其还包括将混合后或加热处理后形成的沉淀物从混合液除去、并回收游离的所述肽的工序。
7.权利要求1所述的方法，其中所述液体样品是血液、血浆或血清。
8.权利要求1所述的方法，其中所述肽是由活体生成的肽或其片段。
9.肽的检测方法，其包括：
通过混合
含肽和血中蛋白质的复合物的液体样品、与
含中性氨基酸、酸性氨基酸或这两者的试剂
而使所述肽自所述血中蛋白质游离的工序，及
检测游离的所述肽的工序。
10.用于权利要求1～9之任一项所述的方法的试剂，其含中性氨基酸、酸性氨基酸或这两者。
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