CN1284131A

CN1284131A - 人类甲状腺蛋白zsig45及其编码dna

Info

Publication number: CN1284131A
Application number: CN98813254A
Authority: CN
Inventors: P·O·夏帕德; T·A·戴舍尔
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2001-02-14
Also published as: CA2312048A1; EP1042465A1; KR20010024690A; AU1540599A; WO1999028467A1; NO20002832D0; JP2001525172A; IL136477A0; NO20002832L

Abstract

本发明涉及甲状腺和垂体中大量表达的新型人类蛋白质－zsig45的多核苷酸和多肽分子。该多肽及其编码多核苷酸可用于检测人类疾病状态和染色体异常,并可作为治疗剂应用。本发明还包括针对zsig45多肽的抗体。

Description

人类甲状腺蛋白ZSIG45及其编码DNA

发明背景

多细胞生物的细胞增殖和分化均受激素和多肽生长因子控制。这些可扩散分子可使细胞间相互联系并协调一致地调控细胞增殖和器官发育；还可调节损伤组织的修复和再生。激素和生长因子通过与受体结合而影响细胞代谢。受体可以是与胞内信号传导途径有关的膜整合蛋白。受体的其它类型是可溶性分子，如转录因子。激素效应，包括激素与可溶性受体的相互作用，是甲状腺发挥有效功能所必需的。

甲状腺是健康人生长和发育中的主要内分泌腺。在成人体内，甲状腺的主要作用是维持代谢稳定，主要通过产生和调节甲状腺激素水平实现。事实上，体内每个器官均受甲状腺激素的影响。因此，甲状腺机能障碍与多种疾病状态相关。甲状腺疾病相对比较常见，主要表现为甲状腺大小和形状的异常(甲状腺肿)以及甲状腺激素分泌的异常。甲状腺机能障碍还可因非甲状腺疾病或可改变甲状腺生理情况的营养缺乏症而引起。常见的甲状腺疾病实例有甲状腺毒症、甲状腺机能减退、突眼性甲状腺肿、甲状腺机能亢进和甲状腺肿瘤。一般性回顾参见Felig，P，Baxter，J.D.& Frohman，L.A.(编)内分泌与代谢，McGraw Hill，NY，第三版，1995，第432-553页；Bennett，J.C.& Plum，F.(编)，医学教材，W.B.Saunders CoPhiladelphia，第20版，1996，第1227-1245页。

研究得最多的甲状腺激素是甲状腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)和促甲状腺素(TSH)。T4大量产生于甲状腺中，而T3既可以由甲状腺产生，也可以在甲状腺外经酶催化使T4发生5’脱碘产生。T3和T4均为分泌型，而且都是甲状腺球蛋白的酶裂解产物；甲状腺球蛋白，是甲状腺的主要蛋白质，它是T4和T3的胞内贮存形式。T4和T3的生物合成和分泌受脑垂体TSH的刺激；而脑垂体TSH又受循环中T3和T4水平的抑制并受下丘脑促甲状腺素释放激素(TRH)的刺激。

T3是甲状腺激素核受体的配体，这类核受体介导甲状腺激素的所有已知生理作用。这些受体是甾类核受体超家族的成员；它们与DNA结合并活化mRNA转录。甲状腺受体结合或未结合其酸性T3配体时具有不同活性。在循环中，T4和T3与几种不同的血清蛋白结合，直至它们到达不同器官和组织中其发挥作用的位点。

甲状腺激素通过调节多种酶的生成和活性，调节其它激素的生成和代谢，调节底物、维生素和矿物质的利用而调节很多代谢过程。这些效应并非都是T3转录调节的结果。例如，非核效应包括淋巴样细胞中的氨基酸和糖转运的刺激、红细胞和心脏细胞中的钙-ATP酶活性、以及其它膜相互作用。有关甲状腺激素的代谢作用和疾病的回顾，参见Braverman，L.E.(编)，甲状腺病，Humana出版社，Totowa，NJ，1997。已知有其它效应物可影响这种复杂的生理体系。目前所未知的效应物可能也很重要。

本领域内仍需进一步阐明甲状腺相关生理效应和提供新的调节分子。尤其感兴趣的是可影响甲状腺功能或由甲状腺分泌的具有胸腺外效应的调节蛋白，包括另外的甲状腺激素。这类激素将尤其可用于使各种甲状腺疾病患者恢复正常的甲状腺功能和作为开发小分子药物的靶。对已知甲状腺激素体内活性的证实说明其它甲状腺激素、它们的激动剂和拮抗剂具有巨大的临床应用前景和需求。本发明提供这类多肽，用于这些目的和本领域内技术人员由本文所述技术而显而易见的其它目的。

发明简述

第一方面，本发明提供分离的多核苷酸，它所编码多肽包含的氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列至少90％相同：(a)如SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列；(b)如SEQ ID NO：4中第1(Met)-85(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列；(c)如SEQ ID NO：3中第1(Met)-89(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列；(d)如SEQ ID NO：2中第1(Met)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供选自下组的分离的多核苷酸分子：(a)包含如SEQ ID NO：1中第219-422位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)包含如SEQID NO：1中第168-422位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(c)包含如SEQ ID NO：1中第156-422位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(d)包含如SEQ ID NO：1中第82-422位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(e)与(a)，(b)，(c)或(d)互补的多核苷酸分子。在另一个实施方案中，上述多核苷酸包含SEQ ID NO：15第1-342位的核苷酸。在另一个实施方案中，上述多核苷酸包含与SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114位(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，上述多核苷酸包含如SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列。在另一个实施方案中，上述多核苷酸编码一种多肽，其中该多肽包含基元1-5。

第二方面，本发明提供包含以下可操作连接在一起的元件的表达载体：转录启动子；编码与SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114位(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列至少90％相同的zsig45多肽的DNA片段；和转录终止子。在一个实施方案中，上述表达载体还包含与该DNA片段可操作连接的一个分泌信号序列。在另一个实施方案中，上述表达载体包含选自下组的分泌信号序列：(a)SEQ ID NO：2中第1-46位氨基酸；(b)SEQID NO：3中第1-21位氨基酸；和(c)SEQ ID NO：4中第1-17位氨基酸。

第三方面，本发明提供已导入上述表达载体的培养细胞，其中该细胞表达由所述DNA片段编码的多肽。

第四方面，本发明提供编码融合蛋白的DNA构建体，该DNA构建体包含：编码与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的多肽的第一DNA片段：(a)SEQ ID NO：2中第1-46位氨基酸；(b)SEQ ID NO：3中第1-21位氨基酸；和(c)SEQ ID NO：4中第1-17位氨基酸；以及编码另一多肽的第二DNA片段，其中第一和第二DNA片段符合读框地连接；并且编码该融合蛋白。

另一方面，本发明提供分离的多肽，它包含的一段氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列至少90％相同：(a)如SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列；(b)如SEQ ID NO：4中第1(Met)-85(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列；(c)如SEQ ID NO：3中第1(Met)-89(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列；(d)如SEQ ID NO：2中第1(Met)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列。在一个实施方案中，上述分离的多肽包含至少90％相同于SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列的序列。在另一个实施方案中，上述分离的多肽即如SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示。在另一个实施方案中，上述分离的多肽包含基元1-5。

另一方面，本发明提供生产zsig45多肽的方法，包括：培养其中已导入上述表达载体的细胞；及分离由该细胞产生的zsig45多肽。

另一方面，本发明提供生产抗zsig45多肽抗体的方法，包括：用选自下组的多肽接种动物：(a)一段由9至67个氨基酸组成的多肽，其中该多肽至少90％相同于SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸的毗连序列；和(b)由SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列组成的多肽；其中这些多肽可激发动物体内的免疫应答以产生抗体；从动物体内分离该抗体。

另一方面，本发明提供经上述方法产生的可与zsig45多肽结合的抗体。在一个实施方案中，上述抗体是一种单克隆抗体。另一方面，本发明提供可与上述多肽结合的抗体。

另一方面，本方面提供检测待检样品中有无zsig45蛋白活性的拮抗剂的方法，包括：用对zsig45刺激的细胞途径有反应的报道基因构建体转染zsig45反应性细胞；经上述方法产生zsig45多肽；在有和无待检样品时将zsig45多肽加至上述细胞；经生物学或生物化学试验比较有和无待检样品时对zsig45多肽的应答水平；通过比较，确定待检样品中是否存在zsig45活性的拮抗剂。

另一方面，本方面提供检测待检样品中有无zsig45蛋白活性的激动剂的方法，包括：用对zsig45刺激的细胞途径有反应的报道基因构建体转染zsig45反应性细胞；加入待检样品；经生物学或生物化学试验比较有和无待检样品时的应答水平；通过比较确定待检样品中是否存在zsig45活性的激动剂。

参照以下发明详述可明确本发明的这些以及其它方面。

发明详述

详细公开本发明之前，先规定以下术语将有助于理解本发明：

本文所用术语“亲和标记”表示能附着于另一多肽上以供其纯化或检测所用或为该多肽附着到底物上提供位点的多肽片段。原则上，可获得其抗体或其它特异结合剂的任何肽或蛋白质均可用作亲和标记。亲和标记包括多组氨酸束、蛋白A (Nilsson等人，EMBO J.4：1075，1985；Nilsson等人，酶学方法，198：3，1991)、谷胱甘肽S-转移酶(Smith和Johnson，基因67：31，1988)、Glu-Glu亲和标记(Grussermeyeer等人，美国国家科学院学报82：7952-4，1985)、P物质、Flag^TM肽(Hopp等人，生物技术学6：1204-10，1988)、链霉亲和素结合肽或其它抗原性表位或结合结构域。大体上参阅，Ford等人，蛋白质表达和纯化2：95-107，1991。编码亲和标记的DNA可获自商品供应商(如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。

术语“等位变体”是指一个基因占据相同染色体位置的两种或多种可替代形式中的任一种。等位变异通过突变自然发生，并可能导致种群内的基因型和表型多态性。基因突变可以是沉默的(所编码多肽无变化)或可能编码具有不同氨基酸序列的多肽。术语等位变体也用于本文以表示由基因的等位变体编码的蛋白质。

本文所用术语“氨基末端”和“羧基末端”是指在多肽中的位置。在上下文允许处，这些术语是参照多肽的特定序列或部分而使用的，以指示近似或相对位置。例如，位于多肽中参照序列羧基末端的某序列是位于接近该参照序列的羧基末端，但不一定是在整个多肽的羧基末端。

术语“互补物/反互补物对”表示在适当条件下形成非共价结合的稳定对的非相同部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或链霉亲和素)是互补物/反互补物对的典型成员。其它典型的互补物/反互补物对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、有义/反义多核苷酸对，等等。当需要互补物/反互补物对随后解离时，优选互补物/反互补物对的结合亲和力小于10⁹M^-1。

术语“多核苷酸分子的互补物”是与参照序列相比具反向互补碱基序列的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG 3′与5′CCCGTGCAT 3′互补。

术语“毗连序列”表示具有与另一多核苷酸完全相同或互补的一段连续序列的多核苷酸。连续序列被称为与多核苷酸序列的一段完全重叠，或与多核苷酸的一部分重叠。例如，多核苷酸序列5′-ATGGCTTAGCTT-3′具代表性的毗连序列是5′-TAGCTTgagtct-3′和3′-gtcgacTACCGA-5′。

术语“简并核苷酸序列”表示包括一个或多个简并密码子(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。简并密码子含不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体均编码Asp)。

术语“表达载体”表示线性或环状的DNA分子，它包含与可供其转录的附加区段可操作连接的编码目的多肽的区段。这样的附加区段可包括启动子和终止子序列，还可包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号，等等。表达载体通常来自质粒或病毒DNA，或可包括它们二者的基元在内。

当用于多核苷酸时，术语“分离的”表示多核苷酸已分离自其天然遗传环境并因此无其它外来的或不希望有的编码序列，且为适用于基因工程蛋白质生产系统的形式。这些分离分子是脱离自其天然环境的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子没有通常与之相关的其它基因，但可包括诸如启动子和终止子之类天然存在的5′和3′非翻译区。相关区域的鉴定对本领域普通技术人员来说将是明显的(见例如，Dynan和Tijan，自然316：774-78，1985)。

“分离的”多肽或蛋白质是发现于其自然环境之外的条件中的多肽或蛋白质，诸如脱离血液和动物组织。在一优选形式中，分离多肽基本上无其它多肽，尤其是动物来源的其它多肽。优选提供高度纯化形式的多肽，即，纯度超过95％，更优选纯度高于99％。用于本文中时，术语“分离的”不排除以不同物理形式存在的相同多肽，诸如二聚体或糖基化或衍生形式。

当用于指DNA区段时，术语“可操作连接”表示这些区段的排列方式使其功能与预期目的一致，例如，转录起始于启动子并通过编码部分进行至终止子。

术语“正同系物(ortholog)”表示获自一物种的多肽或蛋白质，它是来自不同物种之多肽或蛋白质的功能性对应物。正同系物中序列的差异是物种形成的结果。

“副同系物(paralog)”是由某生物体产生的截然不同但结构相关的蛋白质。副同系物被认为是通过基因复制产生的。例如，α-珠蛋白、β-珠蛋白和肌红蛋白互为副同系物。

术语“多核苷酸”表示从5′向3′末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之单链或双链多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA，可分离自天然来源、合成于体外或制备自天然及合成分子的联合体。多核苷酸的大小表示为碱基对(缩写为“bp”)、核苷酸(“nt”)或千碱基(“kb”)。在上下文允许处，后两个词可描述单链或双链多核苷酸。当该词用于双链分子时，表示的是全长分子，应理解为与“碱基对”一词相当。本领域技术熟练人员将认识到，双链多核苷酸的两条链在长度上可能有微小的差别，并且由于酶促断裂的结果，它们的末端可以是错开的；因此在双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可能不是全部配对的。

“多肽”是天然或合成产生的由肽键连接的氨基酸残基多聚体。少于约10个氨基酸残基的多肽通常被称为“肽”。

术语“启动子”按照其在本领域内认可的意义使用，表示基因中含有可供RNA聚合酶结合并起始转录之DNA序列的一部分。启动子序列通常存在于基因的5′非编码区，但并非总是如此。

“蛋白质”是含有一或数条多肽链的大分子。蛋白质中也可含有非肽成分，如糖基。糖类和其它非肽成分可能是由产生该蛋白质的细胞添加到蛋白质上的，并因细胞类型不同而不同。本文中蛋白质是以其氨基酸骨架结构确定的；通常不特别指出诸如糖基之类的取代基，但毫无疑问是可能存在的。

术语“受体”表示可与生物活性分子(即配体)结合并介导配体在细胞上作用的细胞相关蛋白质。一般来说，受体可以是膜结合的、胞质的或核的；单体的(如，促甲状腺激素受体、β-肾上腺素能受体)或多聚体的(如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、促红细胞生成素受体和IL-6受体)。膜结合受体的特征在于具有多重肽结构，其中含胞外配体结合区及通常参与信号转导的胞内效应子区。大多数核受体也表现为多区结构，其中包括氨基末端、反式激活区、DNA结合区和配体结合区。配体和受体的结合导致受体构象改变，从而引起效应子区和细胞内其它分子间的相互作用。该相互作用再引起细胞代谢的变化。与受体-配体相互作用有关的代谢活动包括基因转录，磷酸化作用，去磷酸化作用，环AMP产量的提高，细胞钙转移，膜脂转移，细胞粘附，肌醇脂水解和磷脂的水解。一般来说，受体可以是膜结合的、胞质的或核的；单体的(如，促甲状腺激素受体、β-肾上腺素能受体)或多聚体的(如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、促红细胞生成素受体和IL-6受体)。

术语“分泌信号序列”表示编码作为较大多肽的组分而指导该较大多肽穿过其合成细胞的分泌途径之多肽(“信号肽”)的DNA序列。在通过分泌途径转运过程中该较大肽通常断裂以去除分泌肽。

本文所用术语“剪接变体”表示转录自一个基因的两种或多种可替换RNA形式。剪接变异通过使用转录RNA分子内的、或较少见地在分别转录的RNA分子间的可替换性剪接位点而自然产生，可导致由相同基因转录不同mRNA。剪接变体可编码具改变氨基酸序列的多肽。术语剪接变体用于本文中也表示由转录自一个基因的mRNA剪接变体编码的蛋白质。

用不精确的分析方法(如凝胶电泳)确定的多聚体分子量和长度应理解为是近似值。当这样的值被表示为“大约”X或“近似”X时，所提到的X值应理解为精确至±10％。

此处所引用的所有文献均全文收入作为参考。

本发明部分基于所编码多肽具有分泌信号序列的新DNA序列的发现。对这一新cDNA之相应mRNA的组织分布分析显示，表达主要限于甲状腺。垂体和结肠中的表达也比较明显。这种组织特异性表达说明在甲状腺功能中有一定作用。此多肽命名为zsig45。本发明的zsig45新多肽最初是为选择分泌蛋白而在EST数据文库中查询分泌信号序列时鉴别出的。这些序列的特征是一个甲硫氨酸上游起点、一个近13个氨基酸的疏水区及一个断裂位点。将对应于符合这些标准的EST的多肽与已知序列比较，鉴别出与已知配体有同源性的分泌蛋白。分离出一个EST序列，可能是分泌蛋白。由全长cDNA编码的新多肽与已知蛋白质没有明显的同源关系，这暗示它是一种全新的蛋白质，可能属于一个全新的蛋白质家族。此外，本文公开的信号序列、估计分子量小(8kD，无翻译后修饰)、组织特异性表达、某些新基元，以及成熟蛋白质中长疏水片段的缺乏，说明这是一种小分泌分子，它很可能是一类新的、细胞因子样或蛋白质激素样分泌分子。

典型的zsig45编码DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其推导的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。对编码zsig45多肽的DNA(SEQ IDNO：1)的分析揭示有一个开放读框，它编码114个氨基酸(SEQ ID NO：2)，其中包含46个氨基酸残基的信号肽(SEQ ID NO：2中第1 (Met)-46(Ala)位残基)和68个氨基酸的成熟多肽(SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位残基)。

对编码zsig45多肽的DNA(SEQ ID NO：1)的分析还揭示有可起始翻译的三个甲硫氨酸残基潜在起点。第一个为氨基酸残基1，第二个为氨基酸残基26，第三个为氨基酸残基30(参见SEQ ID NO：2)。因此，除了上述第一个开放读框外，还有编码相同多肽的另两个开放读框(ORF)。这些ORF编码与上述相同的成熟多肽。对编码zsig45多肽(SEQ ID NO：2)的DNA的分析揭示了编码89个氨基酸(SEQ ID NO：3)中包含21个氨基酸残基的信号肽(SEQ ID NO：3中第1 (Met)-21(Ala)位残基)的第二开放读框，和编码85个氨基酸(SEQ ID NO：4)中包含17个氨基酸残基的信号肽(SEQ ID NO：4中第1 (Met)-17(Ala)位残基)的第三开放读框。

在蛋白质中，低变区(如疏水簇)在具有结构重要性的区内常常比较保守(Sheppard，P.等，基因150：163-167，1994)。这类低变区常包含少见或不常见的氨基酸，如色氨酸。对zsig45低变区的检查发现以下五个具有预计比较保守的氨基酸的小区，本文中称为基元1-5：基元l(SEQID NO：5；相应于SEQ ID NO：2中第50-56位氨基酸)；基元2(SEQ IDNO：6；相应于SEQ ID NO：2中第61-66位氨基酸)；基元3(SEQ ID NO：7；相应于SEQ ID NO：2中第71-76位氨基酸)；基元4(SEQ ID NO：8；相应于SEQ ID NO：2中第87-92位氨基酸)；基元5(SEQ ID NO：9；相应于SEQ ID NO：2中第95-100位氨基酸)。

保守或低变基元的存在常确定了蛋白质中重要结构区或与之有关。这些基元之间的区可能更易变化，但常具有重要功能，因为它们可能确定了重要结构和活性或与之有关，如结合区、生物活性和酶活性、信号转导、细胞与细胞间相互作用、组织定位区等等。

Zsig45基元1-5中的高度保守氨基酸可作为一种工具，用于鉴别新的家族成员。例如，可用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从各种组织或细胞系的RNA扩增编码这些保守基元的序列。具体地说，根据zsig45的基元1-5的以下氨基酸序列而设计的高度简并性寡核苷酸引物可用于这样的目的：

a)QEEGDP(基元1；SEQ ID NO：5)，相应于SEQ ID NO：10的简并多核苷酸以及它们的互补序列；

b)AMPYWP(基元2；SEQ ID NO：6)，相应于SEQ ID NO：11的简并多核苷酸以及它们的互补序列；

c)DFWNYV(基元3；SEQ ID NO：7)，相应于SEQ ID NO：12的简并多核苷酸以及它们的互补序列；

d)QIEDMA(基元4；SEQ ID NO：8)，相应于SEQ ID NO：13的简并多核苷酸以及它们的互补序列；

e)FFAHFP(基元5；SEQ ID NO：9)，相应于SEQ ID NO：14的简并多核苷酸以及它们的互补序列。

编码上述zsig45多肽区、结构域、基元、残基以及序列的相应多核苷酸示于SEQ ID NO：1。

SEQ ID NO：15是涵盖编码SEQ ID NO：2之zsig45多肽(1-114位氨基酸)的所有多核苷酸的简并多核苷酸序列。因此，SEQ ID NO：15中从1或141位核苷酸至342位核苷酸的编码zsig45多肽的多核苷酸也包括在本发明的范围内。其它包括在本发明范围内的还有本文中针对SEQID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4而述的片段和融合体，它们都由SEQ ID NO：15的类似区形成。SEQ ID NO：15中的符号总结于下表1。

表1

SEQ ID NO：15中所用的、涵盖特定氨基酸的所有可能密码子的简并密码子列于下表2。

表2

氨基酸字母密码子简并密码子

Cys C TGC TGT TGY

Ser S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN

Thr T ACA ACC ACG ACT ACN

Pro P CCA CCC CCG CCT CCN

Ala A GCA GCC GCG GCT GCN

Gly G GGA GGC GGG GGT GGN

Asn N AAC AAT AAY

Asp D GAC GAT GAY

Glu E GAA GAG GAR

Gln Q CAA CAG CAR

His H CAC CAT CAY

Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN

Lys K AAA AAG AAR

Met M ATG ATG

Ile I ATA ATC ATT ATH

Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN

Val V GTA GTC GTG GTT GTN

Phe F TTC TTT TTY

Tyr Y TAC TAT TAY

Trp W TGG TGG

Ter - TAA TAG TGA TRR

Asn|Asp B RAY

Glu|Gln Z SAR

Any X NNN

Gap - ---

本领域内一般技术人员应理解，确定代表编码每种氨基酸的所有可能密码子的简并密码子时引入了模糊用法。例如，丝氨酸的简并密码子(WSN)有时编码精氨酸(AGR)，而编码精氨酸的简并密码子(MGN)有时编码丝氨酸(AGY)。苯丙氨酸和亮氨酸的密码子之间也存在相似的关系。因此，简并序列所涵盖的某些多核苷酸可能编码氨基酸序列变体，但本领域内技术人员参照SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列能轻易鉴别这些变体序列。可检验这些变体序列有没有本文公开的功能。

本领域内技术人员还应该理解，不同物种中可以有“偏好密码子用法”。总见Grantham等，核酸研究8：1893-1912，1980；Haas等，现代生物学，6：315-324，1996；Wain-Hobson等，基因，13：355-364，1981；Grosjearn，H.&Fiers，W基因18：199-209，1982；Holm，L.核酸研究，14：3075-3087，1986；和Ikemura，T分子生物学杂志，158：573-597，1982。本文所用术语“偏好性密码子用法”和“偏好性密码子”是专业术语，表示在特定物种的细胞中最常用的蛋白质翻译密码子，因而偏好使用编码每种氨基酸的可能密码子(参见表2)中具有代表性的一或几种密码子。例如，苏氨酸可由ACA、AAC、ACG或ACT编码，但在哺乳动物细胞中ACC是最常用的密码子；在其它物种，如昆虫细胞、酵母、病毒或细菌中可能偏好不同的苏氨酸密码子。特定物种的偏好密码子可通过本领域内已知的各种方法导入本发明的多核苷酸。将偏好性密码子序列导入重组体DNA可以如通过使特定细胞类型或物种中的蛋白质翻译效率更高而增加蛋白质的产量。因此，SEQ ID NO：15中公开的简并密码子可作为优化多核苷酸在本领域内和本文中所常用的各种细胞类型和物种中的表达的模板。包含偏好性密码子的序列可接受检验并进行优化以利于在各物种中表达，还可检验本文所公开的功能。

在本发明的优选实施方案中，该分离的多核苷酸在严谨条件下能与SEQID NO：1的大小相似区域或其互补序列杂交。严谨条件一般选择为一定离子强度和pH条件下比特定序列的热解链温度(Tm)低约5℃的温度。Tm是(在一定离子强度和pH条件下)50％靶序列与完全配对的探针杂交上的温度。适当的严谨杂交条件相当于在下述溶液中约42℃时反应约5小时到反应过夜：约40-50％甲酰胺、高达约5X SSC、约5X Denhardt’s溶液、高达约10％硫酸葡聚糖和约10-20μg／ml市售的变性载体DNA；杂交后在高达约2X SSC中洗膜。例如，适当的洗涤严谨度相当于0.1X-2XSSC、0.1％SDS、55-65℃。严谨的杂交和洗涤条件取决于探针的长度(反映在Tm上)、所用杂交溶液和洗涤溶液，一般根据本领域内技术人员的经验而定。

如上述，本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。制备DNA和RNA的方法为本领域内已知。通常，RNA从产生大量zsig45 RNA的组织或细胞中分离。这样的组织和细胞可通过Northern印迹鉴别(Thomas，美国国家科学院学报77：5201，1980)，包括甲状腺，而DNA也可用来自其它组织或细胞系的RNA制备或以基因组DNA的形式分离。总RNA可经异硫氰酸胍提取再CsCl梯度离心分离而制备(Chirgwin等，生物化学18：52-94，1979)。poly(A)⁺RNA用Aviv和Leder(美国国家科学院学报69：1408-1412，1972)的方法从总RNA制备。互补DNA(cDNA)用已知方法从poly (A)⁺RNA制备。在另一方法中，可分离基因组DNA。然后编码zsig45多肽的多核苷酸通过如杂交或PCR鉴别和分离。

编码zsig45的全长克隆可通过常规克隆过程获得。优选互补DNA(cDNA)克隆，但某些应用(如转基因动物表达)时可能优选基因组克隆，或优选对cDNA克隆进行修饰使它包括至少一个基因组内含子。制备cDNA和基因组克隆的方法众所周知并为本领域内一般技术人员所掌握，包括应用本文公开的序列或它们的部分作为探针或引物而搜索一个文库。表达文库可用针对zsig45的抗体、受体片段或其它特异性结合伙伴作探针进行搜索。

本发明的多核苷酸还可利用DNA合成仪器合成。目前首选方法是亚磷酰胺法。如果诸如合成基因或基因片段这样的应用中需要化学合成的双链DNA，那么将分别合成每条互补链。短多核苷酸(60-80 bp)的合成采用的是直接合成技术，可通过合成互补链再使之退火而完成。但合成较长的多核苷酸(＞300 bp)时，常采用特殊方案，因为DNA化学合成期间每一循环的偶联效率一般达不到100％。为解决这一问题，合成的基因(双链)由长度为20-100个核苷酸的单链片段以模块形式装配起来。

构建合成基因的方法之一需要先产生一套重叠的互补寡核苷酸，它们每个的长度均在20-60个核苷酸之间。基因的每个内在部分均有为与邻近部分进行准确碱基配对而设计的互补性3’和5’末端延伸片段。因此，基因装配后，通过用T4 DNA连接酶沿着两条链的骨架封闭缺口可完成加工。合成的基因中除了有蛋白质编码序列外，还可包含有利于插入某克隆载体的限制性内切酶位点的末端序列。

制备全长基因的另一种方法是合成一套特定的重叠寡核苷酸(40-100个核苷酸)。当3’和5’短重叠互补区退火后，仍留下大缺口，但短碱基配对区的长度和稳定性均足以维持结构的完整。经大肠杆菌DNA聚合酶I的酶促DNA合成作用将缺口填充，得到DNA二倍体。酶促合成完成后封闭缺口。然后将双链构建体依次一一连接，形成完整基因序列，用DNA序列分析对其进行检验。参见Glick & Pasternak，分子生物技术学，重组体DNA的原理和应用，(ASM出版社，Washington，D.C.1994)；Itakura等，生物化学年鉴53：323-56，1984和Climie等，美国国家科学院学报87：633-7，1990。

本发明还提供来自人类的对应多肽和多核苷酸(副同系物)和来自其它物种的对应多肽和多核苷酸(正同系物)。这些物种包括，但不限于哺乳动物、鸟类、两栖类、爬行动物、鱼类、昆虫和其它脊椎动物和无脊椎动物。特别的兴趣在于zsig45的人类副同系物和来自其它哺乳动物的多肽，包括小鼠、大鼠、猪、绵羊、牛、犬、猫、马及其它灵长类动物的多肽。人类多肽的物种同系物。人类zsig45的正同系物可用本发明提供的信息和组合物结合常规克隆技术而克隆得到。例如，可用来自本文所述表达zsig45的组织和细胞类型的mRNA克隆获得cDNA。用根据本文公开序列设计的探针探查Northern印迹膜可鉴别出mRNA的合适来源。然后从阳性组织或细胞系的mRNA制备文库。再经各种方法分离编码zsig45的cDNA，如用完整或部分的人类cDNA或用基于公开序列的一或多套简并探针探查。也可用聚合酶链式反应或PCR克隆cDNA(Mullis美国专利第4，683，202号)，所用引物根据在此公开的具有代表性的人类zsig45序列而设计。在另一方法中，cDNA文库可用于转化或转染宿主细胞，而目的cDNA的表达可用针对zsig45多肽的抗体检测。类似的技术也可用于分离基因组克隆。

本领域内技术人员将认识到，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4中公开的序列代表了人类zsig45基因和多肽的一个等位基因形式，如果出现等位基因变体和另外的剪接也在预料之中。该序列的等位基因变体可通过按标准程序探查来自不同个体的cDNA或基因组文库而克隆。SEQ ID NO：1所示DNA序列的等位基因变体，包括带沉默突变的和突变导致了氨基酸序列变化的变体，均包括在本发明的范围内，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的等位基因变体形式的蛋白质也如此。

经另一方式剪接的mRNA产生的、保留了zsig45多肽的特点的cDNA包括在本发明的范围内，这类cDNA和mRNA所编码的多肽也一样。这些序列的等位基因变体和剪接变体可通过按本领域内已知标准程序探查来自不同个体或组织的cDNA或基因组文库，如人类甲状腺cDNA文库而克隆。

本发明还提供基本上与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的多肽以及它们的人类副同系物或物种正同系物同源的分离的zsig45多肽。术语“基本相似”在本文中表示与SEQ ID NO：2所示序列或它们的副同系物或正同系物有50％、优选60％、更优选至少80％序列相同性的多肽。这类多肽更优选与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其副同系物或正同系物至少90％、最优选至少95％或更多相同。序列相同百分率经常规方法确定。参见如Altschul等，数学生物学公告48：603-616，1986和Henikoff&Henikoff，美国国家科学院学报89：10915-10919，1992。简短地说，用缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为1，以及表3所示的Henikoff和Henikoff(同上)之“blosum 62”评分矩阵对比两氨基酸序列，以使对比评分最优。然后按下式计算相同百分率：

表3A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y VA 4R -1 5N -2 0 6D -2 -2 1 6C 0 -3 -3 -3 9Q -1 1 0 0 -3 5E -1 0 0 2 -4 2 5G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4用上述比率通过相似方法测定多核苷酸分子的序列相同性。

Zsig45多肽变体或基本同源的zsig45多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸的取代、删除或添加。这些改变优选是微小性质的改变，即为保守氨基酸取代(见表4)和其它不会严重影响多肽折叠或活性的取代；小的删除，一般约为1-30个氨基酸；及小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基，多达约20-25个残基的小连接肽，或有利于纯化的小延伸(亲和标志)，如多组氨酸束、蛋白A(Nilsson等，EMBO杂志4：1075，1985；Nilsson等，酶学方法198：3，1991)、谷胱苷肽S转移酶(Smith&Johnson，基因67：31，1988)、麦芽糖结合蛋白(Kellerman&Ferenci，酶学方法90：459-463，1982；Guan等，基因67：21-30，1987)、硫氧还蛋白、泛素、纤维素结合蛋白、T7聚合酶或其它抗原性表位或结合结构域。总见Ford等，蛋白质的表达和纯化2：95-107，1991。编码亲和标记的DNA可从供应商获得(如Pharmacia Biotech，Piscataway，HJ；New England Biolabs，Beverly，MA)。本发明因此包括长约60-150氨基酸残基，包含与SEQ ID NO：2中相应区有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％或更多相同性的序列的多肽。含亲和标记的多肽中可在zsig45多肽和亲和标签之间进一步包括一个蛋白水解断裂位点。这些位点优选包括凝血酶裂解位点和因子Xa裂解位点。表4

保守氨基酸取代

碱性氨基酸：精氨酸

赖氨酸

组氨酸

酸性氨基酸：谷氨酸

天冬氨酸

极性氨基酸：谷氨酰胺

天冬酰胺

疏水氨基酸：亮氨酸

异亮氨酸

缬氨酸

芳香族氨基酸：苯丙氨酸

色氨酸

酪氨酸

小氨基酸：甘氨酸

丙氨酸

丝氨酸

苏氨酸

甲硫氨酸

本发明的蛋白质也可包含非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括，但不限于，反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲撑脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基同型半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、同型谷氨酰胺、六氢吡啶羧基、四氢噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸，和4-氟苯丙氨酸。本领域已知几种将非天然氨基酸残基掺入蛋白质的方法。例如，可使用体外系统，其中用化学氨酰化抑制子tRNA抑制无义突变。合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法在本领域中是已知的。可以在包含大肠杆菌S30提取物和市售酶和其它试剂的无细胞体系中进行含无义突变之质粒的转录和翻译。用层析法纯化蛋白质。参阅，例如，Robertson等人，美国化学协会杂志113：2722，1991；Ellman等人，酶学方法，202：301，1991；Chung等人，科学259：806-809，1993；和Chung等人，美国国家科学院学报90：10145-9，1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变mRNA和化学氨酰化抑制子tRNA，可以在非洲爪蟾卵母细胞内进行翻译(Turcatti等人，生物化学杂志271：19991-8，1996)。在第三种方法中，在缺乏欲被替代的天然氨基酸(如苯丙氨酸)而存在所需的非天然氨基酸(如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的条件下培养大肠杆菌细胞。非天然氨基酸将掺入蛋白质中代替其天然相应物。参阅，Koide等人，生物化学33：7470-6，1994。用体外化学修饰法可将天然氨基酸残基转变为非天然类。可以将化学修饰法与定位诱变结合起来，以进一步拓宽取代的范围(Wynn和Richards，蛋白质科学2：395-403，1993)。

可以用有限数目的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸及非天然氨基酸取代zsig45氨基酸残基。

可以按本领域已知步骤，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变，鉴定本发明zsig45多肽中的必需氨基酸(Cunningham和Wells，科学244：1081-5，1989；Bass等人，美国国家科学院学报88：4498-502，1991)。在后一种技术中，在分子内每一残基处引入单个丙氨酸突变，如下述检验所得突变分子的生物学活性或生物化学活性(如zsig45的原位定位或表达；分泌，然后经抗体检测；或用信号转导型试验测量活性)以鉴定对分子活性起关键作用的氨基酸残基。也参阅，Hilton等人，生物化学杂志271：4699-4708，1996。配体-受体或其它生物学相互作用的位点也可用诸如对结构的物理分析，结合潜在接触位点氨基酸的突变而确定，如通过核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记之类的技术所确定。参阅，例如，de Vos等人，科学255：306-12，1992；Smith等人，分子生物学杂志224：899-904，1992；Wlodaver等人，FEBS Lett.309：59-64，1992。也可从与相关家族成员的同源性分析推断哪些是必需氨基酸。

用已知的诱变和筛选方法，如Reidhaar-Olson和Sauer(科学241：53-7，1988)或Bowie和Sauer(美国国家科学院学报86：2152-6，1989)所公开的方法，可造出多氨基酸替换并进行检验。简短地说，这些作者公开了使多肽中两个或多个位置同时随机化，选出功能多肽，然后对诱变多肽测序以确定每一位置处可允许取代的范围的方法。其它可用的方法包括噬菌体展示(如，Lowman等人，生物化学30：10832-7，1991；Ladner等人，美国专利第5，223，409号；Huse，WIPO申请文件WO 92/06204)和定区诱变(Derbyshire等人，基因46：145，1986；Ner等人，DNA 7：127，1988)。

通过如Stemmer，自然370：389-91，1994；Stemmer，美国国家科学院学报91：10747-51，1994和WIPO公开文件WO 97/20078所述的DNA重排可产生已公开的zsig45 DNA和多肽的变体。简短地说，通过亲代DNA随机断裂然后用PCR重新装配而体外同源重组造成随机引入点突变，可产生变体DNA。通过用亲代DNA家族，如等位变体或来自不同物种的DNA而在此过程中引入更多变异性，可改进该技术。选择或筛选所需活性，再反复进行诱变和检测，即可通过选择所需突变并同时抛弃有害基因改变而使序列快速“进化”。

上述诱变方法可与高通量的自动化筛选方法结合，以检测宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。编码活性多肽(如，分泌的及可经抗体检测的；或可用信号转导型试验测量的)的诱变DNA分子可从宿主细胞中回收并用现代化装置快速测序。这些方法可快速确定目的多肽中各个氨基酸残基的重要性，并可应用于未知结构的多肽。

本领域普通技术人员用上述方法可鉴定和/或制备与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或它们的等位变体基本同源并保留野生型蛋白质之功能和结构特征的多种多肽。例如，可用上述方法鉴定zsig45上的受体结合结构域；zsig45的受体的胞外配体结合结构域；异二聚体和同型二聚体结合结构域；其它功能性或结构性结构域；亲和标记；或其它对蛋白质与蛋白质之间相互作用或信号传导很重要的结构域。这样的多肽还可包括如上文一般性公开的附加多肽部分，如亲和标记。

本发明还提供各种其它多肽融合体以及含有一或多个多肽融合体的相关多聚体蛋白。例如，zsig45多肽可制成与如美国专利第5，155，027和5，567，584号所公开的二聚化蛋白的融合体。优选这类二聚化蛋白质包括免疫球蛋白恒定区结构域。免疫球蛋白zsig45多肽融合体可在基因工程化细胞中表达，产生zsig45的各种多聚体类似物。zsig45多肽可融合附加结构域使其靶向特异性细胞、组织或大分子(如胶原蛋白)。例如，zsig45多肽或蛋白可通过与能特异性结合于靶细胞表面受体的配体融合而靶向预定类型的细胞。多肽和蛋白质可通过这种方式进行靶向治疗或诊断。zsig45可与两个或多个部分，如用于纯化的亲和标记以及靶向结构域融合。多肽融合体还可包含一或多个断裂位点，尤其在各结构域之间。参见Tuan等，结缔组织研究34：1-9，1996。

本领域内一般技术人员针对任何zsig45多肽、包括变体及融合蛋白，可用上述表1和2所列信息轻易制备编码变体的完全简并性多核苷酸序列。

可按常规技术在基因工程化宿主细胞中生产本发明的zsig45多肽，包括全长多肽、生物活性片段及融合多肽。合适的宿主细胞是能用外源DNA转化或转染并可在培养中生长的那些细胞类型，包括细菌、真菌细胞和人工培养的高等真核细胞。优选真核细胞，尤其是多细胞生物的培养细胞。操作克隆的DNA分子和将外源DNA引入各种宿主细胞的技术公开于如下文献：Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989；和AuSubel等编辑，分子生物学最新方法，John Wiley and Sons，Inc纽约，1987。

一般地，在表达载体内，编码本发明zsig45多肽的DNA序列与其表达所需的其它遗传元件，通常包括转录启动子和终止子可操作连接。载体通常还含一个或多个可选择标记和一个或多个复制起点，尽管本领域技术熟练人员将认识到，在某些系统中选择标记可由另外的载体提供，而外源DNA可通过整合到宿主细胞基因组中而得到复制。启动子、终止子、可选择标记、载体和其它元件的选择是本领域普通技术水平上的常规设计问题。许多这样的元件被描述于文献中并可获自商品供应者。

为了指导zsig45多肽进入宿主细胞的分泌途径，可在表达载体中提供分泌信号序列(也称为信号肽、前导序列、前原序列或前序列)。分泌信号序列可以是zsig45多肽本身的，或可来自另一种分泌蛋白质(如，t-PA)或重新合成的。分泌信号序列与zsig45 DNA序列可操作连接，即这两个序列连接在正确的阅读框架中，所处位置可指导该新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常是位于编码目的多肽之DNA序列的5′端，但某些信号序列可以置于目的DNA序列中的其它位置(参阅，如，Welch等人，美国专利第5，037，743号；Holland等人，美国专利第5，143，830号)。

另外，本发明多肽中所含的分泌信号序列可用于指导其它多肽进入分泌途径。本发明也提供这类信号融合多肽。用本领域已知和本文公开的方法可制备编码信号融合多肽的DNA构建体，其中编码分泌肽的信号序列来自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中公开的三个ORF(SEQ ID NO：2中第1-46位氨基酸、SEQ ID NO：3中第1-21位氨基酸、SEQ ID NO：4中第1-17位氨基酸)中任一个，并与另一多肽可操作连接。本发明融合多肽中所含分泌信号序列优选与附加肽在氨基末端融合以指导该附加肽进入分泌途径。已知这样的构建体在本领域中有许多应用。例如，这些新分泌信号序列融合构建体能指导通常为非分泌蛋白质的活性组分的分泌。这样的融合体可用于体内或体外，以指导肽通过分泌途径。

在本发明中，人工培养的哺乳动物细胞也是合适的宿主。将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等人，细胞14：725，1978；Corsaro和Pearson，体细胞遗传学7：603，1981；Graham和Van der Eb，病毒学52：456，1973)、电穿孔(Neumann等，EMB0 J1：841-845，1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等，同上)、脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等人，焦点15：73，1993；Ciccarone等人，焦点15：80，1993)及病毒载体(A.Miller和G.Rosman，生物技术7：980-90，1989；Q.Wang和M.Finer，Nature Med.2：714-16，1996)。在培养的哺乳动物细胞中生产重组多肽的方法公开于例如下述文献中：Levinson等人，美国专利第4，713，339号；Hagen等人，美国专利第4，784，950号；Palmiter等人，美国专利第4，579，821号；和Ringold，美国专利第4，656，134号。合适的人工培养哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC No.CRL 1651)、BHK(ATCC No.CRL1632)、BHK570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCC No.CRL 1573；Graham等人，普通病毒学杂志36：59-72，1977)和中国仓鼠卵巢细胞系(如CHO-K1；ATCC No.CCL 61)。另外的合适细胞系在本领域中是已知的，并可获自诸如美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA之类的公共保藏机构。一般地，优选强转录启动子，如SV40或巨细胞病毒的启动子。参阅如美国专利第4，956，288号。其它合适启动子包括金属硫蛋白基因的启动子(美国专利第4，579，821和4，601，978号)和腺病毒主要晚期启动子。

药物选择常用于选择已插入外源DNA的人工培养哺乳动物细胞。这样的细胞通常被称为“转染子”。已在选择剂中培养并能将目的基因传给子代的细胞称为“稳定转染子”。优选的选择标记是编码新霉素抗性的基因。选择在新霉素型药物，如G-418等存在时进行。选择系统也可用于提高目的基因的表达水平，此过程被称为“扩增”。扩增这样进行：在低水平选择剂中培养转染子，随后逐步提高选择剂用量，选出高水平生产所引入基因之产物的细胞。优选的可扩增选择标记是二氢叶酸还原酶，它赋予氨甲喋呤抗性。也可使用其它药物抗性基因(如潮霉素抗性、多重抗药性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。另一类可使表型改变的标记，如绿色萤光蛋白，或者CD4、CD8、I类MHC之类的细胞表面蛋白，胎盘碱性磷酸酶，均可用来通过FACS分拣术或磁珠分离技术等方式从未转染细胞中挑出转染细胞。

其它较高等真核细胞也可用作宿主，包括植物细胞、昆虫细胞和禽类细胞。用毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为植物细胞中表达基因的载体已由Sinkar等人综述于生物科学杂志(Bangalore)11：47-58，1987及WIPO公开文件94/06463中。昆虫细胞的转化及其中外源多肽的产生公开于Guarino等人的美国专利第5，162，222号；Bang等，美国专利第4，775，624号；和WIPO公开文件WO 94/06463中。用毛根农杆菌作为植物细胞中表达基因的载体已由Sinkar等人综述于生物科学杂志(Bangalore)11：47-58，1987中。

真菌细胞，包括酵母细胞，尤其酵母属的细胞，也可用于本发明中，如用于产生zsig45多肽、zsig45多肽片段或多肽融合体。可以用通常来自苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒感染昆虫细胞。参阅King，L.A.和Possee，R.D.，杆状病毒表达系统：实验室指导手册，伦敦，Chapman和Hall；O’Reilly，D.R.等人，杆状病毒表达载体：实验室手册，纽约，牛津大学出版社，1994；和Richardson，C.D编辑，杆状病毒表达方案，分子生物学方法，Totowa，NJ，Humana Press，1995。制备重组zsig45杆状病毒的另一种方法利用了Luckow所述的基于转座子的系统(Luckow，V.A.等人，病毒学杂志67：4566-79，1993)。这一利用转移载体的系统在Bac-to-Bac^TM试剂盒(Life Technologies，Rockville，MD)中有售。该系统利用转移载体，即含Tn7转座子的pFastBacl^TM(Life Techno1ogies)将编码zsig45多肽的DNA移入作为一大质粒(称之为“杆粒”)保持于大肠杆菌中的杆状病毒基因组内。参阅，Hill-Perkin s，M.S.和Possee，R.D普通病毒学杂志71：971-6，1990；Bonning，B.C.等人，普通病毒学杂志75：1551-6，1994；和Chazenbalk，G.D.和Rapoport，B生物化学杂志270：1543-9，1995。此外，转移载体可包括编码位于所表达zsig45多肽C-或N-末端之表位标签(例如Glu-Glu表位标签)的DNA的框架内融合体(Grussenmeyer，T.等，国家科学院学报82：7952-4，1985)。用本领域已知技术将含zsig45的转移载体转化入大肠杆菌，并筛选含有被打断的Lac Z基因、指示为重组杆状病毒的杆粒。用常规技术分离含重组杆状病毒基因组的杆粒DNA，并用其转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞，如Sf9细胞。随后产生表达zsig45的重组病毒。用本领域常用方法制备重组病毒原种。

重组病毒可用于侵染宿主细胞，一般为来自秋粘虫，即草地夜蛾的细胞系。大体上参阅Glick和Pasternak，分子生物技术学：重组DNA的原理和应用，ASM Press，Washington D.C1994。另一合适细胞系是来自粉纹夜蛾的High Five O^TM细胞系(Invitrogen)(美国专利第5，300，435号)。用市售无血清培养基培养和维持此细胞。Sf9细胞的合适培养基是Sf900 Ⅱ^TM(Life Technologies)或ESF 921^TM(表达系统)；粉纹夜蛾细胞的合适培养基是Ex-Cell 0405^TM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)或Express FiveO^TM(Life Techno1ogies)。细胞从约2-5×1O⁵个细胞的接种密度生长至1-2×10⁶个细胞的密度，此时以0.1-10、通常为接近3的感染复数(MOI)加入重组病毒原种。所用步骤参见实验室手册(King，L.A.和Possee，R.D同上；O’Reilly，D.R.等人，同上；Richardson，C.D同上)。用本文所述方法可完成zsig45多肽从上清中的后续纯化。

真菌细胞，包括酵母细胞，也可用于本发明中。在此方面特别让人感兴趣的酵母种类包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。用外源DNA转化酿酒酵母细胞并从中产生重组多肽的方法公开于例如下述文献中：Kawasaki，美国专利第4，599，311号；Kawasaki等人，美国专利第4，931，373号；Brake，美国专利第4，870，008号；welch等人，美国专利第5，037，743号和Murray等人，美国专利第4，845，075号。用选择标记确定的表型，通常是药物抗性或在缺乏特殊营养成分(如亮氨酸)时生长的能力，选择转化细胞。用于酿酒酵母的载体系统优选Kawasaki等人公开的POT1载体系统(美国专利号第4，931，373号)，它可通过在含葡萄糖培养基中的生长来选择转化细胞。酵母中适用的启动子和终止子包括那些来自糖酵解酶基因(参阅，如Kawasaki，美国专利号第4，599，311号；Kingsman等人，美国专利第4，615，974号；和Bitter，美国专利第4，977，092号)和乙醇脱氢酶基因的启动子和终止子。也参阅美国专利第4，990，446；5，063，154；5，139，936和4，661，454号。用于其它酵母的转化系统，包括多形汉森酵母、非洲粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、玉蜀黍黑粉菌、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)均为本领域已知。参阅例如Gleeson等人，普通微生物学杂志132：3459-65，1986和Cregg，美国专利第4，882，279号。可按McKnight等人，美国专利第4，935，349号的方法利用曲霉属细胞。转化产黄枝顶孢(Acremonium chrysogenum)的方法公开于Sumino等人的美国专利第5，162，228号中。转化链孢菌属细胞的方法公开于Lambowitz的美国专利第4，486，533号中。

WIPO公开文件WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536和WO98/02565中公开了利用甲醇毕赤酵母作为宿主生产重组蛋白的方法。用于转化甲醇毕赤酵母的DNA分子通常被制备成双链环状质粒，转化前最好将其线性化。为了在甲醇毕赤酵母中生产多肽，优选质粒中的启动子和终止子是甲醇毕赤酵母基因的，如甲醇毕赤酵母醇利用基因(AUG1或AUG2)的。其它有用启动子包括二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的启动子。为了便于DNA整合进入宿主染色体，优选质粒的整个表达区段两侧为宿主DNA序列。可用于甲醇毕赤酵母中的优选选择标记是甲醇毕赤酵母ADE2基因，它编码使ade2宿主细胞在缺乏腺嘌呤时仍可生长的磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC4.1.1.21)。进行大规模工业生产时，希望最低限度地使用甲醇，因此优选使用甲醇利用基因(AUG1和AUG2)均被删除的宿主细胞。生产分泌蛋白时，优选液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)缺陷的宿主细胞。电穿孔法有助于将带有编码目的多肽之DNA的质粒引入甲醇毕赤酵母细胞。优选用指数衰减的脉冲电场通过电穿孔转化甲醇毕赤酵母细胞，其中场强为2.5-4.5kV/cm，优选约3.75kY/cm，时间常数(τ)为1-40毫秒，最优选约20毫秒。

在含所选宿主细胞生长必需的养分和其它组分的培养基中按常规步骤培养转化或转染的宿主细胞。包括合成培养基和复合培养基在内的各种合适培养基在本领域中是已知的，通常含有碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。必要时，培养基中也可含诸如生长因子或血清之类的组分。生长培养基常可通过例如药物选择或必需养分(由携带于表达载体上的或共转染入宿主细胞的选择标记弥补)的缺乏选出含外源导入DNA的细胞。甲醇毕赤酵母细胞在含有适当碳源、氮源和微量营养物的培养基上，在约25℃-35℃培养。对培养液，用常规方法如小烧瓶振荡或发酵罐喷气提供充足的通气条件。甲醇毕赤酵母培养基优选YEPD(2％D-葡萄糖、2％Bacto^TM蛋白胨(Difco Laboratories，Detroit，MI)、1％Bacto^TM酵母浸膏(Difco Laboratories)、0.004％腺嘌呤和0.006％L-亮氨酸)。

包括大肠杆菌、芽孢杆菌和其它属菌株在内的原核宿主细胞也可用作本发明的宿主细胞。转化这些宿主并表达克隆于其中的外源DNA序列的技术在本领域是众所周知的(参阅如Sambrook等人，同上)。在诸如大肠杆菌之类的细菌中表达zsig45多肽时，多肽可能保留在细胞质中，常为不溶性颗粒体，或可能由细菌分泌序列引导到壁膜间隙。在前一种情况中，溶解细胞，并用例如异硫氰酸胍或尿素将颗粒体回收和变性。然后通过稀释变性剂，如通过对尿素溶液透析及联合使用还原型和氧化型谷胱甘肽，随后对缓冲盐溶液透析，可使变性多肽重折迭和二聚体化。在后一种情况中，通过破裂细胞(用例如超声处理或渗透压休克)释放壁膜间隙内容物并回收蛋白质的方法将多肽以可溶及有功能形式自壁膜间隙回收，这样不需要变性和再折迭。

优选将本发明之多肽纯化为≥80％纯度，更优选≥90％纯度，甚至更优选≥95％纯度，尤其优选药用纯，即≥99.9％纯度(就大分子、特别是其它蛋白质和核酸污染而言)，且无传染原和热原质。纯化多肽优选实质上无其它多肽，尤其动物来源的其它多肽。

用分级分离和/或常规纯化方法和介质可纯化所表达的重组zsig45多肽(包括zsig45的嵌合或融合多肽)。硫酸铵沉淀和酸或离液剂抽提可用于样品的分级分离。典型的纯化步骤可包括羟基磷灰石层析、大小排阻层析、FPLC和反相高效液相层析。合适的层析介质包括衍生化葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特化硅胶，等等。优选PEI、DEAE、QAE和Q衍生物。典型的层析介质包括那些用苯基、丁基或辛基基团衍生化的介质，如Phenyl-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、Octyl-Sepharose(Pharmacia)等等；或聚丙烯类树脂，如Amberchrom CG 71 (Toso Haas)等等。合适的固相支持物包括玻璃珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂等等，它们在将要使用的条件中是不溶的。这些支持物可用使蛋白质借氨基、羧基、巯基、羟基和/或碳水化合物部分附着其上的反应基团改性。偶联化学法的例子包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、肼活化和用于碳二亚胺偶联化学法的羧基和氨基衍生物。这些和其它固相介质在本领域里是众所周知并广泛应用的，均可市售。将配体或受体多肽结合到支持介质上的方法在本领域中是已知的。具体方法的选择是常规设计的问题，部分由所选支持物的特性确定。参阅，如，亲和层析：原理和方法，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1988。

本发明多肽可利用它们的结构和生物学特性分离。例如，单纯离子交换层析和反相HPLC和/或凝胶渗透层析可用于纯化这一大小和pI的蛋白质。也可用其它方法。例如，固定化金属离子吸附(IMAC)层析可用于纯化富含组氨酸的蛋白质，包括带多聚组氨酸标签的蛋白质。简短地说，首先用二价金属离子使凝胶带电，以形成螯合物(E.sulkowski，生化动态3：1-7，1985)。富含组氨酸的蛋白质将根据所用金属离子而以不同亲和力吸附于此基质上，可用竞争性洗脱、降低pH、或用强螯合剂将其洗脱。其它的纯化方法包括用凝集素亲和层析和离子交换层析纯化糖基化蛋白质(酶学方法，卷182，“蛋白质纯化指南”，M.Deutscher，(编辑)，Acad.Press，San Diego，1990，529-39页)。在本发明的其它实施方案中，可构建目的多肽与亲和标签(如多聚组氨酸、麦芽糖结合蛋白、免疫球蛋白结构域)的融合体以便于纯化。

此外，可采用本领域中公开的方法，利用所发明的zsig45多肽的区或结构域，结合人类2-19家族蛋白中的其它蛋白(如人2-19、D87120、和鼠EF-7)、或异源蛋白构建多肽融合体或zsig45杂合蛋白(Sambrook等，同上，Altschul等，同上，Picard.D.Cur.Opin.Biology，5：511-515，1994，及其中的参考文献)。用这些方法可确定目的多肽中大结构域或区的重要生物学意义。这类杂合体有可能改变反应动力学、结合特性、缩小或扩大特异性底物范围、或改变多肽的组织和细胞定位，它们可应用于改变结构不明的多肽。

用本领域内技术人员已知的方法，通过制备融合蛋白中各组分并将它们用化学法偶联，可制备融合多肽。或者，可用已知技术产生以正确的读码框顺序编码融合蛋白之一或多个成分的多核苷酸并按本文所述方法表达。例如，本发明zsig45中赋予生物学功能的结构域的部分或全部可与另一家族成员或异源蛋白中功能等价的结构域进行交换。这类结构域包括但不限于已公开的三个分泌信号序列、成熟蛋白及保守基元。根据所构建之融合体的不同，预期这类融合蛋白可具有与本发明多肽或与参与其融合的蛋白质相同或相似的生物功能特征。而且，这类融合蛋白可表现本文所述的其它特性。

可用标准分子生物学技术和克隆技术交换zsig45多肽及与之融合的多肽的等价结构域。通常，如本文所述，将编码目的结构域如本文所述zsig45结构域的DNA片段与至少一个编码附加多肽(如人2-19蛋白的类似结构域或区)的其它DNA片段可操作连接于同一读码框内，再插入适当表达载体。一般构建DNA构建体时，将编码多肽相应区的几个DNA片段可操作连接于同一读码框内，以形成编码完整融合蛋白或其功能部分的单一构建体。例如，DNA构建体可编码从N-末端到C-末端包含信号多肽及紧随其后的成熟多肽的融合蛋白；或DNA构建体可编码从N-末端到C-末端包含信号多肽及紧随其后、含基元1-5的区(按它们在zsig45多肽中的出现顺序)，或异源蛋白如人2-19蛋白的等价区的融合蛋白。这类融合蛋白可按本文所述表达、分离并分析其活性。

也可经化学法合成zsig45多肽或其片段。zsig45多肽可以是单体或多聚体；被糖基化或未被糖基化；被PEG化或未被PEG化；可以包括或不包括最初的甲硫氨酸残基。

本发明分子的活性可用测量甲状腺、心血管和骨骼功能的各种试验进行测量。特别是新陈代谢、甲状腺或垂体激素的分泌、骨的吸收和形成试验。这类试验均为本领域内已知。

鉴于观察所得zsig45多肽的组织分布，激动剂(包括天然受体/底物/辅因子/等等)和拮抗剂具有巨大的体外和体内应用前景。zsig45多肽、其片段、或鉴定为zsig45激动剂、拮抗剂的化合物可用于体外刺激各种类型细胞的生长、增殖或分化以及体内治疗甲状腺外或甲状腺的疾病。例如，这类化合物可作为已知成分细胞培养基的成分，可单独或与其它细胞因子和激素一起取代细胞培养基中通常使用的血清。

另一个实施方案提供了鉴别zsig45多肽拮抗剂的方法，包括提供可与zsig45多肽反应的细胞，在有待检化合物时培养一份细胞，在没有待检化合物时培养第二份细胞，检测第一份细胞比第二份细胞的细胞应答水平的提高。另一个实施方案提供了鉴别zsig45多肽拮抗剂的方法，包括提供可与zsig45多肽反应的细胞，在有zsig45多肽时培养一份细胞，在有zsig45多肽和待检化合物时培养第二份细胞，检测第二份细胞比第一份细胞的细胞应答水平的降低。

本发明的分子可用于鉴定和分离与甲状腺、垂体、心脏或其它功能相关、zsig45体内与之结合的受体。例如，可将本发明的蛋白质和肽固着在层析柱上，而使膜制剂流经层析柱(固定化亲和配体技术，Hermanson等编，Academic Press，San Diego，CA，1992，195-202)。蛋白质和肽也可进行放射性标记(酶学方法，卷182，“蛋白质纯化指南”，M.Deutscher编，Academic Press，San Diego，CA，1990，721-737)或进行光亲和标记(Brunner等，生物化学年鉴62：483-514，1993和Fedan等，生化药理学33：1167-1180，1984)，从而鉴定出特异性细胞表面蛋白。

作为配体，zsig45多肽的活性可用硅基生物传感器微型生理机能测量仪(microphysiometer)测量，该仪器测量与受体结合以及随后的生理性细胞应答相关的胞外酸化率或质子排出。这样的设备如MolecularDevices，Sunnyvale，CA出品的Cytosesor^TM Microphysiometer。各种细胞应答，如细胞增殖、离子转运、能量产生、炎性应答、调节和受体活化等等均可用此方法测量。参见如McConnell，H.M.等，科学257：1906-1912，1992；Pitchford，S.等，酶学方法228：84-108，1997；Arimilli，S.等，免疫学方法杂志212：49-59，1998；Van Liefde，I.等，欧洲药理学杂志346：87-95，1998。微型生理机能测量仪可用于分析粘附或未粘附的真核或原核细胞。微型生理机能测量仪通过测量细胞培养中胞外酸化作用随时间的变化，可直接测量针对各种刺激，包括zsig45多肽、其激动剂或拮抗剂的细胞应答。优选用微型生理机能测量仪测量zsig45反应性真核细胞的应答，与真核细胞对照(对zsig45多肽无应答)比较。zsig45反应性真核细胞包含因转染zsig45受体而产生的可对zsig45应答的细胞；或天然对zsig45有应答的细胞，如衍生自甲状腺、心脏、垂体、下丘脑、骨、骨髓和骨骼肌组织的细胞等等。相对于未接触zsig45的对照，接触zsig45多肽的细胞的应答差异(测量为变化值，例如胞外酸化增加或减少)，是对zsig45调节的细胞应答的直接测量。此外，这类zsig45调节应答可在各种刺激下进行分析。应用微型生理机能测量仪，可提供鉴定zsig45多肽激动剂的方法，包括提供对zsig45多肽有反应性的细胞，在无待检化合物时培养一份细胞，在有待检化合物时培养第二份细胞，检测第二份细胞相对第一份细胞的细胞应答变化，如增加或减少。细胞应答的变化以胞外酸化速率的可测量变化表示。此外，在有zsig45多肽而无待检化合物时培养第三份细胞，作为zsig45反应性细胞的阳性对照，以及作为比较待检化合物与zsig45多肽的激动剂活性时的对照。此外，应用微型生理机能测量仪，可提供鉴定zsig45多肽拮抗剂的方法，包括提供可对zsig45多肽反应的细胞，在有zsig45而无待检化合物时培养一份细胞，在有zsig45和待检化合物时培养第二份细胞，检测第二份细胞相对第一份细胞的细胞应答变化，如增加或减少。细胞应答的变化以胞外酸化速率的可测量变化表示。zsig45多肽的拮抗剂和激动剂可用此方法进行快速鉴定。

zsig45还可用于鉴定对zsig45刺激的途径发生应答的细胞、组织或细胞系。上述微型生理机能测量仪可用于快速鉴定配体应答性细胞，如对本发明之zsig45有反应性的细胞。可在有或没有zsig45多肽时培养细胞。那些有zsig45时胞外酸化发生可测变化的细胞是对zsig45有反应性的细胞。这样的细胞系可用于如上述鉴定zsig45多肽的拮抗剂和激动剂。

本发明之多肽、核酸和/或抗体可用于治疗与甲状腺机能障碍相关的疾病。本发明之分子可用于治疗或预防诸如甲状腺、心脏和骨骼等各种组织中的病情进展。尤其是疾病的某些综合征，如甲状腺机能障碍、多次灌注导致的局部缺血损伤、炎性疾病，以及本文公开的其它疾病适于这类诊断、治疗或预防。

本发明分子的活性可用各种试验测量，例如测量结合受体后的信号传导的试验、测量甲状腺激素体外和体内分泌的试验、测量骨损失的试验、测量TSH活性的试验、或测量抗体结合的试验。例如，可标记zsig45多肽并检验其与特定细胞系或细胞的特异性结合和饱和结合。鉴定zsig45可与之结合的阳性细胞，可通过注射放射性标记或荧光标记的zsig45多肽，用本领域内公认的免疫组化方法使细胞或组织中zsig45结合处显色而完成。与zsig45结合的阳性细胞得到鉴定后，可用本领域内已知方法检验zsig45介导活化信号传导途径的能力。例如，可将含报道基因(如SRE-萤光素酶、STAT-萤光素酶、甲状腺激素应答因子(THRE)-萤光素酶等等)的载体构建体导入阳性细胞系；当这类细胞系被置于含分泌的zsig45蛋白的条件培养基中时，将通过可测型受体的活化证实zsig45介导的信号传导活性。这类试验是本领域内众所周知的。具体试验包括，但不限于测量信号传导的生物试验。

本发明的分子可在甲状腺中或甲状腺外发挥它们的效应。因此，zsig45多肽、激动剂或拮抗剂的活性可能影响甲状腺的功能，并可以通过评估体外甲状腺激素的分泌或体内的甲状腺功能而测量。甲状腺激素，以及有或无zsig45时甲状腺激素分泌的变化可用本领域内已知的各种方法检测。例如，TSH和其它甲状腺激素常通过放射免疫分析(RIA)、“夹心”型免疫测量试验或ELISA测量。激素，包括T3和T4，可通过本领域内已知的各种方法体内测量(Elkins，R.内分泌评论(Endocr.Rev.)11：5-46，1990)。例如，T4可用¹²⁵I结合放射性测量试验、透析和超滤测量。参见Braverman，L.E.(编)，同上，第35-48页。

此外，本发明的zsig45多肽、激动剂或拮抗剂可调节使T4在胞外转换成T3的质膜蛋白-碘化甲状腺氨酸5’单脱碘酶Ⅱ型(iodothyrone5’-monodeiodinase type-Ⅱ，5’D-Ⅱ)。这类效应可通过如上述评估T4或T3而间接体内测量，或通过测量5’D-Ⅱ酶活性而直接体外测量。而且，肝脏中5’脱碘酶Ⅰ型(5’D-Ⅰ)对T3的清除效应可体内评估。参见Braverman，L.E.(编)，同上，第49-68页。

zsig45多肽对甲状腺功能的体内效应也可在实验动物或人体内经超声、放射性碘吸收以及极细针抽取活组织检查而评估(Braverman，L.E.(编)，同上，第35-48页)。

甲状腺机能失调及目前采用的某些相关治疗会在体内对骨骼造成有害影响。因此，本发明的甲状腺和垂体定位，测量骨生成和/或吸收的试验对于评估zsig45活性很重要。一个实例是可以快速鉴定对降钙素受体表达细胞有选择性降钙素受体活性的物质的试验体系。降钙素受体是G蛋白受体家族的成员，可通过活化腺苷酸环化酶、导致细胞cAMP水平升高而传递信号(Lin等，科学254：1022-24，1991)。这一试验体系利用受体使cAMP水平升高的能力，检测能刺激降钙素受体并启动信号传递的其它分子。测量骨生成或吸收的其它试验包括颅顶试验、QCT、和测量成骨细胞大小和数目的试验。这类试验均为本领域内已知且如下述。

检测受体活化可通过：(1)测量腺苷酸环化酶活性(Salomon等，Anal.Biochem.58：541-48，1974；Alvarez&Daniels，Anal.Biochem.187：98-103，1990)；(2)用常规放射免疫分析方法测量胞内cAMP水平的变化(Steiner等，生物化学杂志247：1106-13，1972；Harper & Brooker，J.Cyc.Nucl.Res.1：207-18，1975)；或(3)通过应用cAMP闪烁近似分析(SPA)方法(Amersham CorpArlington Heights，IL)。尽管这些方法既灵敏又精确，但开始试验前需对样品进行深加工、试验过程耗时长、涉及放射性同位素的应用、大批量筛选试验也十分繁琐。

另一个试验体系涉及对因cAMP水平升高而在降钙素受体表达细胞(而非缺乏降钙素受体表达的细胞)中诱导环AMP效应元件(CRE)-萤光素酶报道基因表达的多肽进行选择，正如美国专利第5，622，839、5，674，689和5，674，981号所述。

已有成熟的动物模型可用于检验与降钙素受体相互作用的zsig45多肽、激动剂或拮抗剂的体内效力。而且，这些模型可用于检验zsig45通过除降钙素受体以外的其它途径对骨骼的影响。例如，低血钙大鼠或小鼠模型可用于测定对血清钙的影响，切除卵巢的大鼠或小鼠可作为骨疏松症的模型。这些模型动物在雌激素水平不足的早期阶段骨的改变与人类在此阶段的改变性质相似。降钙素是阻止卵巢切除妇女和大鼠的骨损失的有效制剂(Mazzuoli等，Calcif.Tissue Int.47：209-14，1990；Wronski等，内分泌学129：2246-50，1991)。高水平雌激素可抑制卵巢切除小鼠模型的骨吸收并刺激骨形成(Bain等，J.Bone Miner.Res.8：435-42，1993)。

因此本发明中与降钙素受体相互作用，或对骨有其它影响的zsig45生物活性多肽、激动剂或拮抗剂有望在使用降钙素有效的治疗应用中发挥一定作用。这类应用如对骨疏松症、佩吉特病、甲状旁腺机能亢进、骨软化、婴儿特发性血钙过多症及其它疾病的治疗。除此以外的应用还有在急性胰腺炎和肠胃病的治疗中抑制胃分泌，以及作为镇痛剂，尤其是针对骨骼疼痛的镇痛剂使用。

测量骨形成速率变化的体内试验包括进行骨组织学试验(参见，Recker，R.编，骨组织形态测定法：技术及说明，Boca Raton：CRC Press，Inc1983)和定量计算X线断层照相术(QCT；Ferretti，骨17：353S-364S，1995；Orphanoludakis等，放射学研究14：122-130，1979；和Durand等，医学物理学19：569-573，1992)。用于测量骨形成变化的体外试验实例如颅顶试验(Gowen等，免疫学杂志136：2478-2482，1986)或颅顶吸收试验(Linkhart，T.A.和Mohan，S内分泌学125：1484-1491，1989)。

此外，可分析本发明的多肽并利用其能力缓解炎症。确定zsig45的促炎症(proinflammatory)和抗炎症特性的方法本领域内已知，本文亦有述。例如，cAMP生成的抑制可指示抗炎症效应(Nihei，Y.等，皮肤病学研究文献，287：546-552，1995)。角质细胞中IFN-Y诱导的cAMP抑制和ICAM、HLA-Dr抑制可用于评估炎症抑制作用。或者，该体系中cAMP产量的增加及ICAM和HLA-Dr的诱导可用于测量蛋白质的促炎症效应。Zsig45也能表现类似的炎症效应，如体内所示(实施例8)，并可在其表达组织或其它组织中发挥这些效应。例如，zsig45可表达在结肠中，并可用于促进该组织中的伤口愈合，或表现抗细菌或抗病毒效应。而且，zsig45或其拮抗剂可用于治疗肠炎症、憩室炎、肠道手术中和术后炎症等等。此外，甲状腺中表达的zsig45在甲状腺外的诸如心、脑、肝、肾等组织中可具有伤口愈合或抗微生物或抗病毒作用。而且，对zsig45多肽和zsig45抗体的直接测量可用于诊断诸如黑色素瘤、炎性肠疾病、憩室炎、哮喘、骨盆炎性疾病(PID)、牛皮癣、关节炎、再灌注局部缺血以及其它炎症。Zsig45、拮抗剂还可用于治疗心肌炎、动脉硬化症、骨盆炎性疾病(PID)、牛皮癣、关节炎、湿疹、硬皮病及其它炎症。

就此而言，zsig45多肽、激动剂或其拮抗剂具有应用于哮喘和关节炎之类炎性疾病治疗的前景。例如，如果zsig45具有促炎性，则拮抗剂对哮喘治疗或淋巴细胞转移受损的其它抗炎治疗将很有价值。此外，在肺部感染和损伤时，zsig45在肺功能方面，例如支气管扩张、组织弹性、淋巴细胞募集中有其它重要作用。评估肺细胞中zsig45活性的试验述于Laberge，S.等，美国呼吸系统细胞分子生物学杂志(Am.J.Respir.CellMol.Biol.)17：193-202，1997；Rumsaeng，V.等，免疫学杂志159：2904-2910，1997；和Schluesener，H.J.等，神经科学研究杂志44：606-611，1996。确定zsig45、其激动剂或其拮抗剂的促炎症特性和抗炎特性的方法为本领域内已知。而且，本领域内已知及本文中述及的其它分子生物学、免疫学和生物化学技术也可用于确定zsig45活性及分离激动剂和拮抗剂。

基于zsig45在甲状腺中的高水平表达，它还可能通过经由宿主细胞(如T细胞)上它的受体进行特异性信号传导而抑制病毒复制，从而表现抗病毒活性。Zsig45可表现免疫细胞增殖活性(参见实施例8)，可如本文述分析这一活性，它可能刺激免疫系统抵抗病毒感染。此外，zsig45可结合CD4或另一种淋巴细胞受体，表现抗病毒效应，如抗人类免疫缺陷病毒(HIV)或人嗜T细胞病毒(HTLV)。或者，zsig45可竞争病毒受体或它们的共同受体而阻止病毒感染。可经胃肠外方式施与zsig45以预防病毒感染或减少病毒复制和再感染(Gayowski，T.等，移植64：422-426，1997)。因此，zsig45可作为抗病毒治疗剂用于治疗如病毒性白血病(HTLV)、AIDS(HIV)，或由如轮状病毒、杯状病毒(如NorwalkAgent)以及致病性腺病毒的某些毒株引起的胃肠道病毒感染。

Zsig45直接和间接调节的炎症作用均可用本领域内已知方法分析。如参见Hamada，T.等实验医学杂志188：539-548，1998；和Liu，L等，免疫学杂志161：3064-3070，1998。例如，zsig45多肽的促炎症效应可在应用Transwell^TM(Costar)的试验中直接检验，其中将内皮细胞铺于半透膜上，将zsig45多肽置于transwell较靠下部的槽内，将Cr⁵¹或荧光标记的嗜中性粒细胞(PMN)、淋巴细胞、HL60细胞、K562细胞等加在transwell靠上部的槽内。PMN等细胞在有zsig45多肽时向transwell内靠下部的槽中转移，但无zsig45多肽(阴性对照)时不转移，说明zsig45多肽是PMN的直接化学引诱剂。此外，IL-8可作为该试验的阳性对照。为检验zsig45是否炎症应答的间接刺激物，可采用类似的方法。例如，可如上述设计实验，其中transwell靠下部的槽内除了有zsig45以外还有成纤维细胞或脂肪细胞。由此可测量Zsig45多肽诱导这些细胞分泌可促进PMN转移(即炎症)的因子的效应。bFGF可作为间接试验的阳性对照。也可用本领域内已知的类似transwell试验将zsig45多肽加入已有PMN的上部槽内而测量zsig45的抗炎症效应。

本发明分子的活性可用以下各种试验测量，如依据zsig45的甲状腺外活性潜在效应测定心脏细胞的再生或增生(增殖)。与本发明之多肽可能相关的其它活性包括直接或间接通过其它生长因子使内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞增殖；作为内皮细胞、成纤维细胞和/或吞噬细胞的趋化因子；成骨因子；间充质干细胞及前体细胞群体扩展因子。

增殖可用培养的心脏细胞测量或体内通过给予适当动物模型以本发明的分子而测量。可见的增殖效应常为细胞数量的增加，可能还包括抑制凋亡以及刺激有丝分裂。这些试验中所用培养细胞包括心脏成纤维细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、和来自原代培养物的人类脐带静脉内皮细胞。适当的已建立细胞系包括：NIH 3T3成纤维细胞(ATCCNo.CRL-1658)、CHH-1 chum心脏细胞(ATCC No.CRL-1680)、H9c2大鼠心肌细胞(ATCCNo.CRL-1446)、Shionogi乳腺癌细胞(Tanaka等，美国国家科学院学报89：8928-8932，1992)、以及LNCap,FGC腺癌细胞(ATCC No.CRL-1740)。细胞增殖测定试验为本领域内已知。例如，增殖测定试验包括诸如对中性红染料的化学敏感性试验(Cavanaugh等，新药研究(InvestigationalNew Drugs)8：347-354，1990)、放射性核苷酸掺入试验(Cook等，生化分析(Analytical Biochem)179：1-7，1989)、5-溴-2’-脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入增殖细胞DNA中的试验(Porstmann等，免疫学方法杂志82：169-179，1985)、以及四唑鎓盐利用试验(Mosmann，免疫学方法杂志65：55-63，1983；Alley等，癌症研究48：589-601，1988；Marshall等，生长调节5：69-84，1995；和Scudiero等，癌症研究48：4827-4833，1988)。

分化是一个渐进、动态过程，始于多能干细胞而止于终末分化细胞。未定型为谱系而能再生的多能干细胞表达一组分化标志，当定型为细胞谱系后这些标志消失。始祖细胞表达一组分化标志，当细胞沿谱系dmj发生的进程走向成熟时这些标志可能继续表达也可能不再表达。专由成熟细胞表达的分化标志通常是有一定功能的特征，如细胞产物、产生细胞产物的酶及受体。细胞群体分化的阶段可通过对群体内所存在的分化标志进行鉴定而监测。肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞和网状细胞均被认为来自共同的间充质干细胞(Owen等，Ciba Fdn.Symp.136：42-46，1988)。间充质干细胞的标志尚未完全被鉴定出来(Owen等，细胞科学杂志87：731-738，1987)，因此通常在细胞的始祖期和成熟期鉴定细胞。据推测成人心脏组织中存在早期心肌始祖细胞(常称为心肌干细胞)，但未证实。本发明的新多肽可用于进行体内和离体分离间充质干细胞和心肌始祖细胞的研究。

有证据表明刺激特定细胞类型沿一定方向完成最终分化或去分化的因子对来源于共同前体或干细胞的整个细胞群体都有影响。因此，本发明包括对肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和内皮细胞的增殖进行刺激或抑制。本发明的分子可能通过影响它们的共同前体/干细胞，而在刺激心肌细胞增殖或分化的同时，抑制脂肪细胞的增殖或分化。因此，本发明的分子有可能用于抑制软骨肉瘤、动脉硬化症、再狭窄及肥胖症。

分化测定试验包括，如，检测与组织的阶段特异性表达相关的细胞表面标志、酶活性、功能活性或形态变化(Watt，FASEB，5：281-284，1991；Francis，分化57：63-75，1994；Raes，动物细胞生物学技术及生物加工进展(Adv.Anim.Cell Biol．Technol.Bioprocesses)，161-171，1989；全部引入本文作为参考)。

评估心脏新生或增生的体内试验包括用本发明的分子处理新生大鼠和成熟大鼠。通过测定动物的心率、血压和心输出等确定左心室功能，以评估心脏功能。评估心脏衰弱或改善的死亡后方法包括：心脏重量的增加或减少、细胞核/细胞质体积、心脏组织切片染色以确定增殖细胞核抗原(PCNA)与胞质肌动蛋白水平的比较(Quaini等，循环研究75：1050-1063，1994和Reiss等，美国国家科学院学报93：8630-8635，1996)。

Zsig45多肽也可用于制备可特异性结合zsig45表位、肽或多肽的抗体。Zsig45多肽或其片段可作为抗原(免疫原)接种至动物，激发免疫应答。本领域内技术人员可以理解，抗原或免疫原表位可由较长多肽内从少于约10个氨基酸或稍长，直至长达约为全长多肽或更长多肽(取决于多肽)的氨基酸链组成。适当抗原包括SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸编码的zsig45多肽、或其9-67氨基酸的连续片段。作为抗原的肽优选亲水肽，如本领域内技术人员根据亲水性图谱(从例如，基于六残基滑动窗并忽略隐藏的G、S和T残基及暴露的H、Y和W残基的Hopp/Woods亲水图所确定的图谱)推测的肽，或根据本文公开的亲水结构域，基元1-5或基元1-5之间的区预测的肽。此免疫应答产生的抗体可如本文述分离和纯化。制备和分离多克隆和单克隆抗体的方法为本领域内已知。参见如，免疫学最新方法，Cooligan等(编)，National Institutes of Health，John Wiley & Sons，Inc1995；Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港，NY，1989；和Hurrell，J.G.R.编，单克隆杂交瘤抗体：技术和应用，CRC Press，IncBoca Raton，FL，1982。

对本领域内技术人员显而易见的是，可用zsig45多肽或其片段接种各种温血动物如马、牛、山羊、绵羊、狗、小鸡、兔、小鼠和大鼠产生抗体。Zsig45多肽的免疫原性可用佐剂，如铝(氢氧化铝)或者弗氏完全或不完全佐剂加强。能用于免疫接种的多肽还包括融合多肽，如zsig45或其部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白的融合多肽。多肽免疫原可为全长分子或其部分。如果多肽部分为“半抗原样”，免疫接种时该部分最好加入或连接至大分子载体(如匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)上。

如本文中所用，术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和纯化多克隆抗体、单克隆抗体，及抗原结合片段，如F(ab′)2和Fab蛋白水解片段。还包括基因工程化完整抗体或片段，如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体等等，以及合成的抗原结合肽和多肽。通过移植非人CDR至人的构架和恒定区中，或通过掺入完整的非人可变区(任选地通过取代暴露残基而用类人表面“包藏”它们，结果产生“镶盖”抗体)，可将非人抗体人源化。在某些例子中，人源化抗体可在人可变区构架结构域中保留非人源残基以增强正确结合的特性。通过使抗体人源化，可延长生物学半衰期，并降低施用于人时产生不利免疫反应的可能性。

产生或筛选本文适用抗体的其它技术包括在体外将淋巴细胞暴露于zsig45蛋白质或多肽，以及对噬菌体或相似载体中的抗体展示文库进行选择(例如，通过使用固定化或标记的zsig45蛋白质或肽)。通过筛选展示于噬菌体(噬菌体展示)或大肠杆菌之类细菌上的随机肽文库，可获得编码具潜在zsig45多肽结合结构域之多肽的基因。可用多种方式获得编码该多肽的核苷酸序列，如通过随机诱变和随机多核苷酸合成。这些随机肽展示文库可用于筛选与已知靶相互作用的肽，所说的靶可以是蛋白质或多肽，如配基或受体，生物或合成大分子，或者有机或无机物质。构建和筛选这些随机肽展示文库的技术在本领域中是已知的(Ladner等人，美国专利号5，223，409；Ladner等人，美国专利号4，946，778；Ladner等人，美国专利号5，403，484和Ladner等人，美国专利号5，571，698)，随机肽展示文库和用于筛选这些文库的试剂盒可购买得到，例如购自Clontech(Palo Alto，CA)、Invitrogen Inc.(San Diego，CA)、NewEngland Biolabs，Inc,(Beverly，MA)和Pharmacia LKB BiotechnologyInc。(Piscataway，NJ)。可以用本文所公开的zsig45序列筛选随机肽展示文库，以鉴定能与zsig45结合的蛋白质。这些能与zsig45多肽相互作用的“结合蛋白质”可用于标记细胞；通过亲和纯化分离同系物多肽；直接或间接地与药物、毒素、放射性核素等等偶联。这些结合蛋白质也可用于诸如筛选表达文库和中和活性之类的分析方法中。结合蛋白质也可用于诊断检验中以测定多肽的循环水平、检测或定量测定作为潜在病理或疾病标志的可溶性多肽。这些结合蛋白质也可作为zsig45“拮抗剂”用于体外和体内阻止zsig45结合和信号传递。这些抗zsig45结合蛋白可用于抑制炎症或其它zsig45活性。

如果抗体：1)结合活性有一个阈值水平，和/或2)不会与相关多肽分子显著进行交叉反应时，则被定义为能够特异性结合。首先，若本文中的抗体与zsig45多肽、肽或表位以高于与对照(非zsig45)多肽之结合亲和力至少10倍以上的结合亲和力结合，则为特异性结合。优选抗体表现10⁶M^-1或更高、优选10⁷M^-1或更高、更优选10⁸M^-1或更高、最优选10⁹M^-1或更高的结合亲和力(Ka)。本领域普通技术人员可容易地测定抗体的结合亲和力，例如，用斯卡查德分析法(Scatchard，GAnn.NYAcad.Sci.51：660-672，1949)。

其次，抗体若不与相关多肽发生显著交叉反应，则也是特异结合的。例如，抗体用标准的Western印迹分析(Ausubel等人，同上)可检测到zsig45多肽，而不能检测到已知的相关多肽时，则抗体不与相关多肽分子显著发生交叉反应。已知相关多肽的例子包括正同系物、来自相同物种的蛋白质家族的成员(如IL-16)、zsig45多肽及非人zsig45。此外，抗体可“筛选”掉已知相关多肽以分离特异性结合本发明多肽的种类。例如，将针对zsig45多肽的抗体吸附至粘附于不溶性基质的相关多肽上；zsig45特异性抗体将在适当缓冲条件下流过此基质。这样的筛选可分离不与密切相关多肽交叉反应的多克隆和单克隆抗体(抗体：实验室手册，Harlow和Lane(编)，冷泉港实验室出版社，1988；免疫学最新方法，Cooligan，等人(编)，国家健康研究所，John Wiley和Sons，Inc1995)。特异抗体的筛选和分离在本领域中是众所周知的(参阅，基础免疫学，Paul(编)，Raven Press，1993；Getzoff等，免疫学进展43：1-98，1988；单克隆抗体：原理和实践，Goding，J.W.(编)，Academic Press Ltd.1996；Benjamin等，免疫学年鉴2：67-101，1984)。

本领域内技术人员已知的各种试验可用于检测能特异性结合zsig45蛋白或肽的抗体。试验实例详述于抗体：实验室手册，Harlow和Lane(编)，冷泉港实验室出版社，1988。这类试验的代表性例子包括：并行免疫电泳、放射免疫试验、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附试验(ELISA)、点印迹或蛋白质印迹分析、抑制或竞争试验，及夹心试验。此外，可筛选能与野生型而不与突变型zsig45蛋白或多肽结合的抗体。

zsig45的抗体可用于标记表达zsig45的细胞；用于通过亲和纯化分离zsig45；用于测定zsig45多肽循环水平的诊断试验；用于检测或定量测定作为潜在病理或疾病标志的可溶性zsig45；用于应用FACS的分析方法中；用于筛选表达文库；用于产生抗独特型抗体；及作为中和抗体或作为拮抗剂在体内和体外阻断zsig45多肽活性。合适的直接标志或标签包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制物、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等等；间接的标志或标签可以使用生物素-抗生物素蛋白或其它互补物/反互补物对作为中间物质。也可将此处的抗体直接或间接地与药物、毒素、放射性核素等偶联，这些偶联物可用于体内诊断或治疗应用中。此外，抗zsig45或其片段的抗体可用于体外试验中以检测变性zsig45或其片段，例如，用于蛋白印迹或本领域已知的其它试验中。

本发明的分子可用于鉴定和分离与甲状腺、垂体、心脏或其它功能相关、zsig45多肽体内可与之结合的受体。例如，可将本发明的蛋白质和肽固定在层析柱上，使膜制品流过层析柱(固相亲和配体技术，Hermanson等编，Academic Press，San Diego，CA，1992，第195-202页)。蛋白质和肽也可进行放射性标记(酶学方法，卷182，“蛋白质纯化指南”，M.Deutscher，编，Acad.Press，San Diego，1990，第721-737页)或光亲和标记(Brunner等，生物化学年鉴62：483-514，1993和Fedan等，生化药理学33：1167-1180，1984)，从而可鉴定出特异性细胞表面蛋白。

此外，上述方法可用于分离抗zsig45结合蛋白。这类拮抗剂可分离出来并单独或与其它疗法联合用于治疗如横纹肌肉瘤、心脏粘液瘤、成骨细胞起源的骨癌，以及侏儒症、关节炎、韧带和软骨修复。

本发明的分子可用于阐明和预防各种甲状腺疾病、骨疾病、月经问题、心脏疾病、骨、结肠、垂体和甲状腺癌。本发明的多肽、核酸和/或抗体可用于治疗与甲状腺机能障碍相关的疾病。本发明的分子可用于调节甲状腺活性或者治疗甲状腺、心脏和骨等多种组织中的病理性紊乱或阻止其发展。尤其某些综合征和疾病适于进行这类诊断、治疗或预防。

本发明还提供研究哺乳动物细胞代谢的方法。本发明的这类方法包括温育待研究细胞，如人类血管内皮细胞、±zsig45多肽、单克隆抗体、其激动剂或拮抗剂，然后观察脂肪形成、葡糖异生、糖酵解、脂肪生成、葡萄糖吸收等的变化。

本发明另一方面提供包含纯化的zsig45多肽与药用可接受的载体组合的药物组合物。这一药物组合物可用于调节哺乳动物体内的能量平衡或保护内皮细胞免受损伤。

本文的抗体或多肽还可直接或间接偶联药物、毒素、放射性核素等，这些偶联物可用于体内诊断或治疗。例如，本发明的多肽或抗体可用于鉴定或治疗表达相应反互补分子(如分别为受体或抗原)的组织或器官。更具体地，可将zsig45多肽或抗zsig45抗体、或它们的生物活性片段或部分与可检测分子或细胞毒分子偶联，运送至具有表达反互补分子之细胞、组织或器官的哺乳动物中。

合适的可检测分子可直接或间接地附着至多肽或抗体上，它们包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制物、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等等。合适的细胞毒分子可直接或间接地附着至多肽或抗体上，它们包括细菌或植物毒素(例如，白喉毒素、假单胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白等等)，以及治疗性的放射性核素，如碘-131、铼-188或钇-90(直接附着至多肽或抗体上，或者通过如螯合部分之类的方式间接附着)。也可将多肽或抗体与细胞毒药物如阿霉素偶联。为使可检测分子或细胞毒分子间接附着，可将该可检测分子或细胞毒分子与互补物/反互补物对中的一个成员偶联，而另一成员结合到多肽或抗体部分上。对于这些目的，生物素/链霉抗生物素蛋白是互补物/反互补物对的实例。

在另一实施方案中，多肽-毒素融合蛋白或抗体-毒素融合蛋白可用于定向的细胞或组织抑制或摘除(如治疗癌症细胞或组织)。或者，当多肽有多个功能结构域(即活化结构域或配体结合结构域，外加一个靶向结构域)时，只含靶向结构域的融合蛋白可能适于将可检测分子、细胞毒分子或互补分子导向目的细胞或组织类型中。在仅含该结构域的融合蛋白包含互补分子时，则可将抗互补分子与可检测分子或细胞毒分子偶联。因而这样的结构域互补性分子融合蛋白代表了一般性靶向载体，它们可将一般性反互补物-可检测分子/细胞毒分子偶联物运送至特定的细胞/组织。

在另一个实施方案中，若zsig45多肽或抗zsig45抗体靶向至过度增殖的血细胞或骨髓细胞，可应用zsig45-细胞因子融合蛋白或抗体-细胞因子融合蛋白增强对靶组织(例如血癌和骨髓癌)的体内杀伤(大体上参见，Hornick等，血液89：4437-47，1997)。Hornick等人描述，融合蛋白可使细胞因子靶向到目的作用位点，从而使细胞因子的局部浓度升高。合适的zsig45多肽或抗zsig45抗体可靶向不希望有的细胞或组织(即肿瘤或白血病)，融合的细胞因子介导效应细胞增强对靶细胞的裂解。适于此目的的合适细胞因子包括如白细胞介素-2和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

在另一个实施方案中，zsig45多肽或抗zsig45抗体可靶向血管细胞或组织。这类多肽或抗体可偶联放射性核素，尤其偶联放射β射线的放射性核素，以减轻再狭窄。这种治疗方式对实施放射治疗的医师危害较小。例如，将浸有铱-192的带子置于病人扩张的血管中，直至运送的放射剂量达到要求时，与接受安慰剂带子的对照组相比，处理组显示血管中组织生长减少，鲁米诺直径更大。而且，处理组的血管再形成和斯腾特血栓形成显著减少。预计用本文所述含放射性核素的生物活性偶联物靶向可得到类似结果。

本文所述生物活性多肽或抗体偶联物可经静脉内、动脉内或导管内运送，或直接在目的作用部位局部应用。

此外，上述方法可用于分离抗zsig45结合蛋白。可分离这类拮抗剂，并单独或与其它疗法联合用于治疗如横纹肌肉瘤、心粘液瘤、成骨细胞起源的骨癌，以及侏儒症、关节炎、韧带和软骨修复。

本发明的分子可用于阐明和预防各种甲状腺疾病、骨疾病、经期问题、心脏疾病、骨、结肠、垂体和甲状腺癌症。可用于调节甲状腺。

编码zsig45多肽的多核苷酸可用于需要提高或抑制zsig45活性的基因治疗应用中。若哺乳动物zsig45基因突变或缺失，则可将zsig45基因引入该哺乳动物的细胞中。在一个实施方案中，经病毒载体将编码zsig45多肽的基因引入体内。这样的载体包括减毒或缺陷DNA病毒，如，但不局限于，单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、EB病毒(EBY)、腺病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒(AAV)，等等。优选完全或几乎完全缺失病毒基因的缺陷病毒。缺陷病毒引入细胞后无感染性。使用缺陷病毒载体可进行特定局部区域内细胞的给药，而不用担心载体会侵染其它细胞。特殊载体的例子包括，但不局限于，缺陷型单纯疱疹病毒1型(HSV1)载体(KaPlitt等，分子与细胞神经科学(Molec,Cell.Neurosci.)2：320-30，1991)；减毒腺病毒载体，如由Stratford-Perricaudet等在临床研究杂志90：626-30，1992中所述的载体；及缺陷型腺伴随病毒载体(Samulski等，病毒学杂志61：3096-101，1987；Samulski等，病毒学杂志63：3822-8，1989)。

在另一实施方案中，可在逆转录病毒载体中引入zsig45基因，如下述：Anderson等，美国专利第5，399，346；Mann等，细胞33：153，1983；Temin等，美国专利第4，650，764；Temin等，美国专利第4，980，289；Markowitz等，病毒学杂志62：1120，1988；Temin等，美国专利第5，124，263；Dougherty等于1995年3月16日公布的国际专利公开文件WO 95/07358；及Kuo等，血液82：845，1993。或者，可以用脂质体通过体内脂转染法引入载体。可用合成型阳离子脂质制备用于体内转染标志编码基因的脂质体(Felgner等，美国国家科学院学报84：7413-7，1987；Mackey等，美国国家科学院学报85：8027-31，1988)。利用脂转染法将外源基因引入体内特定器官的方法具有一定的实用优点。将脂质体分子定向至特定细胞代表了其优势的一方面。更具体地说，指导针对特定细胞的转染代表了优势的一方面。例如，在诸如胰、肝、肾和脑之类具细胞异质性的组织中，指导针对特定类型细胞的转染将是尤其有利的。可将脂类与其它分子化学偶联以达到定向的目的。可将定向肽(如激素或神经递质)、蛋白质如抗体或非肽分子与脂质体化学偶联。

有可能将靶细胞从机体中分离；引入裸露DNA质粒形式的载体；然后将转化细胞再植入机体内。可以用本领域已知方法将用于基因治疗的裸露DNA载体引入所需宿主细胞中，如通过转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、基因枪的使用或DNA载体转运蛋白的使用。参阅如Wu等，生物化学杂志267：963-7，1992；Wu等，生物化学杂志，263：14621-4，1988。

反义方法学可用于抑制zsig45基因转录，如抑制体内细胞增殖。设计与编码zsig45的多核苷酸一个区段(如，SEQ ID NO：1中所述多核苷酸)互补的多核苷酸，用以结合编码zsig45的mRNA并抑制这些mRNA的翻译。这类反义多核苷酸可用于抑制细胞培养物或受试者体内zsig45多肽编码基因的表达。

也可构建被加工而表达zsig45基因的小鼠-转基因小鼠，和zsig45基因功能完全缺失的小鼠-“基因敲除小鼠”(Snouwaert等，科学257：1083，1992；Lowell等，自然366：740-42，1993；Capecchi，M.R科学244：1288-1292，1989；Palmiter，R.D.等，遗传学年鉴20：465-499，1986)。例如，过表达zsig45的转基因小鼠，不管是普遍地还是受控于组织特异性或组织限制性启动子的表达，均可用于研究过表达是否产生表型。例如，野生型zsig45多肽、多肽片段或其突变体的过表达可能改变正常的细胞过程，导致一种表型，可用来鉴定出其中zsig45表达具功能相关性的组织，并可能指示zsig45、其激动剂或拮抗剂的治疗靶。例如，需改造的转基因小鼠优选过度表达zsig45成熟多肽的小鼠。而且，这类过表达可能产生与人类疾病相似的表型。类似地，zsig45基因敲除小鼠可用于确定体内是否确实需要zsig45。基因敲除小鼠的表型可预测zsig45拮抗剂，如本文所述的拮抗剂，可能具有的体内效应。人类zsig45 cDNA可用于分离小鼠zsig45 mRNA，cDNA和基因组DNA，这些小鼠核酸随后可用于产生基因敲除小鼠。这些小鼠可用于在体内系统中研究zsig45基因及其编码蛋白，并可作为相应于人类疾病的体内模型。此外，如本文所述，针对zsig45的zsig45反义多核苷酸或核酶的转基因小鼠表达可类似地应用于基因敲除上述小鼠。

使用zsig45的其它诊断用法也可应用。例如，zsig45基因、含zsig45DNA或RNA或它们的亚序列的探针可应用于测定疾病组织中zsig45基因的表达是否不同。例如，zsig45可能在某些胰腺癌、前列腺癌、小肠癌、喉癌和肺癌，或与那些组织相关的其它疾病以及其它疾病中有表达。或者，相对于正常状况，在某些疾病状态下特定组织中的zsig45表达可能下降。

关于调节能量平衡，zsig45多肽可用于调节细胞代谢反应。这类代谢反应包括脂肪形成、葡糖异生、糖酵解、脂肪生成、葡萄糖摄取、蛋白质合成、生热作用、氧利用等等。Zsig45多肽的表达模式指示其在重要代谢器官甲状腺中表达，并可能对内皮细胞组织具有甲状腺内和甲状腺外效应。这类效应包括甲状腺或其它组织的保护、再生、生长和发育。

关于内皮细胞保护作用，zsig45多肽可用于器官保存，冷冻保存，为防止因局部缺血和/或炎症所致损伤而进行的术前预处理，或用于类似过程。从这一点来说，zsig45多肽可能用于通过如脑内2-脱氧-葡萄糖的摄取等而调节营养物摄取，如已证实的。

Zsig45多肽可调节哺乳动物能量平衡。Zsig45的甲状腺表达模式说明zsig45可能对葡萄糖摄取有一定影响(如通过GLUT-1)，并对生热作用有影响(热调节)。除了本领域已知或本文所述的其它方法外，还可通过检验一种或多种以下代谢功能评估哺乳动物能量平衡：脂肪形成、葡糖异生、糖酵解、脂肪生成、葡萄糖摄取、蛋白质合成、生热作用、氧利用等。可用本领域一般技术人员已知技术(试验或动物模型)监测这些代谢功能，如下文详述。例如，胰岛素的葡糖调节作用主要发生在肝、骨骼肌和脂肪组织中。胰岛素与这三种组织中其相应细胞受体结合，起始组织特异性活动，导致例如抑制葡萄糖产生和刺激葡萄糖利用。在肝中，胰岛素刺激葡萄糖摄取并抑制葡糖异生和糖酵解。在骨骼肌和脂肪组织中，胰岛素刺激葡萄糖的摄取、贮存和利用。

Zsig45多肽在甲状腺中表达，但可作用于影响代谢功能的器官而发挥其甲状腺外活性。因此，本发明的药物组合物可用于预防或治疗胰腺疾病。例如，zsig45可能与胰脏中神经分泌细胞和外分泌细胞扩展的病理性调节有关，这类调节在IDDM、胰脏癌或类似疾病中很明显。本发明的药物组合物还可参与预防或治疗以血糖水平病理性调节、胰岛素耐受性或消化功能相关机能障碍为特征的胰脏疾病。

对于上述所有代谢功能的监测本领域都存在公认的方法。因而，本领域一般技术人员能评估zsig45多肽、片段、融合蛋白、抗体、激动剂和拮抗剂的代谢调节功能。调节技术实例如下所述。

脂肪生成、葡糖异生和糖酵解是哺乳动物能量平衡的相互关联成分，可以通过已知技术，用例如ob/ob小鼠或db/db小鼠进行评估。ob/ob小鼠是近交小鼠，为ob(肥胖)基因位点失活突变的纯合子。这类ob/ob小鼠表现贪食和代谢减退症状，并被认为循环OB蛋白的产生不足。db/db小鼠是近交小鼠，它是db(糖尿病)基因位点失活突变的纯合子。db/db小鼠显示与ob/ob小鼠相似的表型，只是db/db小鼠显示更为严重的糖尿病表型。这类db/db小鼠被认为可抵抗循环OB蛋白的作用。评估这些参数的多种体外方法在本领域中也是已知的。

例如，通过测定掺入甘油三酯的¹⁴C-乙酸量(Mackall等，生物化学杂志251：6462-6464，1976)或甘油三酯的累积(Kletzien等，分子药理学41：393-398，1992)，可检验胰岛素刺激的脂肪生成。

可在例如分析胰岛素刺激的葡萄糖转运的试验中评估葡萄糖摄取。将未转染的分化L6肌管(保持在缺乏G418的条件中)放入含1g/l葡萄糖、0,5或1．0％BSA、20mM Hepes及2mM谷氨酰胺的DMEM中。培养2-5小时后，用含0,5或1．0％BSA、20mM Hepes、1mM丙酮酸盐和2mM谷氨酰胺的新鲜无葡萄糖DMEM替换原培养基。加入合适浓度的胰岛素或IGF-1或连续稀释的待检物质，并将细胞温育20-30分钟。加入³H或¹⁴C标记的脱氧葡萄糖至终浓度约50 1M，将细胞温育约10-30分钟。然后用冷缓冲液(如PBS)快速漂洗细胞，之后用合适的裂解试剂(如1％SDS或1N NaOH)将细胞溶解。随后通过闪烁计数器计数评估细胞裂解物。细胞相关放射活性减去非特异结合(通过将细胞与葡萄糖转运抑制剂细胞松弛素b共保温测定)后可作为葡萄糖转运的衡量尺度。其它方法包括如Manchester等，美国生理学杂志266(内分泌学与代谢29)：E326-E333，1994(胰岛素刺激的葡萄糖转运)所述的方法。

通过例如将待检细胞与35S-甲硫氨酸以及与35S-甲硫氨酸和蛋白质合成的假定调节物共温育，随后比较35S-甲硫氨酸标记的蛋白质的沉淀，可评估蛋白质合成。

生热作用可如下述评估：B.Stanley，神经肽Y及相关肽的生物学，W.Colmers & C.Wahlestedt(编)，Humana Press，Ottawa，1993，第457-509页；C.Billington等，美国生理学杂志260：R321，1991；N.Zarjevski等，内分泌学133：1753，1993；C.Billington等，美国生理学杂志266：R1765，1994；Heller等，美国生理学杂志252(4pt2)：R661-7，1987；Heller等，美国生理学杂志245(3)：R321-8，1983。可用各种技术测定的代谢速率也是生热作用的间接衡量指标。

氧利用可如下述评估：Heller等，Pflugers Arch 369(1)：55-9，1977。这一方法还涉及对下丘脑温度及代谢热产生的分析。人体的氧利用及热调节也可如Haskell等，应用生理学杂志51(4)：948-54，1981所述进行评估。

本发明的zsig45多肽可能在神经内分泌/外分泌细胞命运决定途径中发挥作用，并因此能调节胰中神经内分泌和外分泌细胞的扩展。这类调节应用之一是对胰岛细胞再生的调节。此外，有假设认为引起IDDM的自身免疫源于子宫，而zsig45多肽是参与细胞分化的发育基因。本领域内已知有方法和动物模型可用于监控外分泌/神经内分泌细胞谱系发生，用于观察胰细胞平衡，和用于评估本发明的zsig45多肽、片段、融合蛋白、抗体、激动剂或拮抗剂对上述疾病的预防或治疗。

对哺乳动物内皮细胞组织保护作用的评估，除了本领域内已知或本文所述的方法之外，还可通过对内皮组织功能的监测而进行。例如，心脏(动脉)的功能可通过监测乙酰胆碱释放、去甲肾上腺素释放等参数而评估。这些参数均通过本领域内技术人员已知、并在下文中详述的技术(试验或动物模型)进行监测。

乙酰胆碱释放和去甲肾上腺素释放可用HPLC监测。Levy，窦房结和房室结电生理学(Electrophysiology of the Sinoatrial andAtrioventricular nodes)，Alan，R.Liss，Inc187-197，1998，描述了对冠状窦流出物中去甲肾上腺素的测量。此外，也可对动物进行电起搏，并如Elsner，欧洲心脏杂志16(增刊N)52-8，1995；和Reiffel&Kuehnert，起搏(PACE)17(第一部分)：349-65，1994所述监测结果。

Zsig45多肽还表达在结肠中。因此，本发明的zsig45多肽药物组合物还可用于预防和治疗胃肠道消化性疾病，如与分泌细胞病理性扩展或分化相关的疾病。本领域内已知用于监测这类扩展或分化以及用于评估zsig45多肽，包括多肽片段、融合蛋白、抗体、激动剂和拮抗剂对这类扩展或分化进行预防或治疗的试验和动物模型。

而且，已知肠道中的三叶因子(trefoil factors)涉及肠粘膜稳定作用和与急性损伤相关的修复过程，尤其上皮细胞的重建(Poulsom，RBail.Clin.Gastro10：113-134，1996；Sand，B.E&Podolsky，D.K生理学年鉴，58：253-273，1996)。此外，三叶蛋白很可能在肠道炎性疾病所致损伤的恢复，以及通过粘膜分泌活动抵抗微生物入侵的过程中有一定作用(Palut，A.G新英格兰医学杂志，336：5-6-507，1997；Playford，R.JJ.Royal Coll.Phys.London，31：37-41，1997)。表皮生长因子(EGF)受体配体可能对提高肠道中三叶蛋白活性有一定作用；但粘膜损伤的修复不依赖于肠道中主要内源性EGF受体配体TNF-α，这说明另有尚未发现的配体(Cook，G.A.等，美国生理学协会，G1540-61549，1997)。例如，zsig45多肽可能作为三叶途径中的这类配体、调节蛋白或其它因子，因此对肠道和粘膜上皮相关的疾病及损伤具有重要治疗作用。

EGF也表达在甲状腺中，并且可体外调节甲状腺细胞的生长和分化(Dagogo-Jack，S.非洲医学科学杂志，24：211-217，1995)。因此，zsig45与EGF受体的相互作用可能也影响甲状腺功能并因此具有治疗甲状腺疾病或与甲状腺机能障碍相关之疾病的作用。甲状腺组织中可检测到多种生长因子(Dagogo-Jack，S,同上)；zsig45可能对这些因子中一或多个的活性或生理途径产生影响。

Zsig45的甲状腺表达说明，本发明多肽可能与已知的甲状腺激素类似，作用于甲状腺外组织的细胞膜。因此，本发明的多肽可对细胞膜发挥非核效应并可应用于对诸如心脏和淋巴样组织等组织的治疗中。例如，膜效应可包括使心肌Na⁺离子通道失活或激活红细胞的Ca²⁺-ATP酶活性。因此，本发明的zsig45肽可用于治疗心脏病或心肌收缩功能障碍、或与溶质转运和离子通道相关的其它疾病，诸如与遗传或其它人类疾病状态有关的肾脏、骨髓、肌肉、心脏和或神经病理状态，如糖尿病、骨疾病、造血性疾病、免疫病、白血病、高血压、心脏肥大、其它心脏疾病和神经疾病。

有关甲状腺功能对心脏功能的影响已有详尽报道(Lompre，A.等，分子细胞心脏学杂志(J.Mol.Cell Cardiol.)，26：1109-1121，1994)。动物中，收缩速率与舒张速率的提高与甲状腺机能亢进有关，而收缩力降低与甲状腺机能减退有关。这些效应可能通过心肌肌质网中的Ca²⁺-ATP酶介导。这类效应可用下述试验方便地测量。

本发明分子的心脏活性可用Langendorff试验测量。这一优选试验可测量实验动物的离体心脏功能，为本领域内众所周知。实验动物是例如，但不限于，大鼠、兔和豚鼠。对心脏组织的慢性效应可在zsig45多肽处理实验动物1-7天或更长时间后进行测量。对照动物只接受缓冲液。处理后，取出心脏，通过动脉倒灌。灌注期间测量几种生理参数：单位时间的冠状动脉血流量、左心室(LV)血压、及心率。这些参数直接反映心脏功能。经Langendorff实验测得，用zsig45多肽体内处理后，相对于对照动物，这些参数的改变说明多肽对心脏功能的慢效应。而且，Langendorff实验还可用于测量zsig45多肽对心脏的急性效应。其中，使用未处理动物的心脏，将zsig45多肽加入试验的灌注液中。测量上述评估参数并与对照心脏(灌注液中没有zsig45多肽)的结果比较。心率、单位时间内的血压改变和/或冠状动脉血流量的差异说明本发明分子对心脏功能的急性效应。

本发明分子的活性还可用测量离子通道活性的各种试验测量。特别感兴趣的是测量跨细胞膜的离子转移。这类试验为本领域内已知。评估新离子通道或其调节物活性的特异试验包括，但不限于，测量爪蟾卵母细胞中电压依赖性电导的生物试验(参见Rudy，BIverson，L.E编，酶学方法，卷207，Academic Press，San Diego，CA，1992；Hamill，O.P等，Pfluegers Arch391：85-100，1981；Moorman，J.R.等，生物化学杂志267：14551-14554，1992；Durieux，M.E等，美国生理学杂志263：C896-C900，1992)。这些方法包括将体外表达的mRNA注射至分离的卵母细胞并用膜片钳术评估电压依赖性电导。离子通道或其调节物在该试验系统可能提高电压依赖性电导。该系统可应用于其它类型的细胞，如昆虫和哺乳动物细胞(参见Rudy，BIverson，L.E.编，同上)。其它试验包括用如Fura2之类的螯合剂染料间接测量哺乳动物或其它类型细胞中的离子通道活性(参见如，James-Kracke M.R普通生理学杂志99：41-62，1992；Raghu，P.等，基因190：151-156，1997)。离子通道活性也可用放射性标记的离子检测，如¹²⁵I流出试验(Xia，Y.等，膜生物学杂志151：269-278，1996)。其它试验包括测量因离子流或离子通道磷酸化作用而指示的哺乳动物细胞基因表达的变化；例如，通过由本文所述适当启动子驱动可测性报道基因如萤光素酶表达。

本发明的分子可用于心脏组织细胞如心肌细胞或心脏成肌细胞；骨骼肌细胞或骨骼肌成肌细胞和平滑肌细胞；软骨细胞；内皮细胞；脂肪细胞和成骨细胞的体外增殖。例如，本发明的分子可作为已知成分的细胞培养基的成分，并可单独或与其它细胞因子和激素联合用于取代细胞培养基中常用的血清。本发明的分子尤其可用于特异性促进培养物中肌细胞的生长和/或发育，而且已证实可用于研究心肌细胞增生和再生。

本发明的多肽、核酸和/或抗体可在与心肌梗塞、充血性心力衰竭、肥大型心肌病和扩张型心肌病有关的疾病治疗中应用。本发明的分子还可用于限制心肌梗塞的范围、帮助心脏移植后的恢复、促进血管成形术或动脉内膜切除术后的血管生成和伤口愈合、形成冠脉侧支循环，用于眼内血管再形成，用于不良循环相关综合征如糖尿病所致足部溃疡，用于用药理学方法进行冠脉重灌注引起的中风，以及因血管生成而引起的其它指征。本发明的分子可通过诱导心肌细胞新生和/或增生，通过诱导灌脉侧支的形成，或通过诱导心肌坏死区的再造而用于改善心脏功能。本发明的其它药学应用包括诱导骨骼肌新生和/或增生、肾脏再生和/或用于治疗全身性和肺动脉性高血压。

Zsig45诱导的冠脉侧支形成用兔、狗或猪的慢性冠脉闭塞模型测量(Landau等，美国心脏杂志29：924-931，1995；Sellke等，外科120(2)：182-188，1996；和Lazarous等，1996，同上)。Zsig45治疗中风的效力用双侧颈动脉闭塞的大鼠模型进行体内检验并测量组织学变化，以及迷宫表现(Gage等，神经生物学与衰老(Neurobiol.Aging)9：645-655，1988)。Zsig45对高血压的作用用自发性高血压大鼠(SHR)进行体循环高血压的体内检验(Marche等，临床与实验药理学及生理学，增刊1：S114-116，1995)。

本发明的多核苷酸还可用于检测人类第2号染色体上与疾病或其它人类性状相关的异常表现。本发明的多核苷酸位于人类第2号染色体的2q37.3区。Zsig45基因位于WICGR放射杂交图谱上自人类第2号染色体连锁群顶端的1086.2 cR 3000处。近端和远端框架标记分别为WI-6310(D2S2704)和D2S2585。利用周边标记将zsig45基因定位于2号染色体完整LDB图谱中2q37.3区。

本发明还提供可用于诊断的试剂。例如，zsig45基因、含zsig45 DNA或RNA的探针、或其亚序列可用于确定zsig45基因是否存在于2号染色体上或是否发生了突变。Zsig45基因位点处可检测的染色体畸变包括，但不限于非整倍体、基因拷贝数改变、插入、缺失、限制性位点改变和重排。这类畸变可应用本发明的多核苷酸经分子遗传学技术，如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、应用PCR技术的短串联重复(STR)分析、以及本领域内已知的其它基因连锁分析技术进行检测(Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；Marian，A.JChest，108：255-265，1995)。

zsig45多核苷酸探针可用于检测与2q37.3相关或位于2q37.3处、可在人类疾病状态下产生表型以及作图定位于人类基因组上这一区的异常或基因型。有关2号染色体上的该区，参见公用的WWW服务器(http：//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/omim/getmap？chromosome=2q37.3)人类在线孟德尔氏遗传(OMIM)基因图谱及其中的参考文献。于人类疾病状态中有表型的所有这些异常或基因型可作为遗传性疾病(显示与zsig45基因连锁位于相同染色体区)可能的候补基因。

同样，zsig45位点中的缺陷自身可导致人类遗传病。本发明的分子，如本发明的多肽、拮抗剂、激动剂、多核苷酸和抗体将有助于与zsig45遗传缺陷相关的检测、诊断预防和治疗。

可采用使用zsig45的其它诊断应用。例如，包含zsig45DNA或RNA或其亚序列的zsig45基因探针可用于确定zsig45基因在疾病组织中是否不同地表达。因此，这样一种zsig45探针可用于评估甲状腺功能。例如，zsig45可于某些甲状腺、垂体、结肠、骨和内分泌癌症，或与这些组织有关的其它疾病中表达。另一方面，某些组织中zsig45的表达可能在特定疾病状态下比正常情况时降低。

药学应用时，本发明的多肽经配制可按常规方法经非胃肠道途径，尤其静脉内或皮下途径给药。静脉给药可以是在通常为一或几小时的时间段内通过静脉注射或灌注给予。对于优选达到局部效应的应用，如影响自局部(如甲状腺)干细胞形成特定类型成熟细胞的应用，优选设计用于局部给药的制剂。这类药物组合物均适于如埋植或其它局部给药方法，并且还可配制成适于缓释。适用于各种给药途径的药学组合物配方在本领域内一般技术人员的水平范围内是可以实现的。

一般地，药用配方包括zsig45多肽并联合药学可接受的载体如生理盐水、缓冲生理盐水、5％葡萄糖水溶液等等。配方中还可包括一或多种赋形剂、防腐剂、助溶剂、缓冲剂、白蛋白以防止蛋白质损失在瓶表面等。制剂配制方法为本领域内已知，并述于如Reminton：药剂学原理与实践(The Science and Practice of Pharmacy)，Gennaro，MackPublishing CoEaston，PA，第19版，1995。治疗剂量通常由临床医生根据公认标准，并考虑待治病情的特点和严重程度以及患者状况等而定。剂量的确定可由本领域内一般技术人员实现。该多肽可用于急性治疗，时间一周以上或略少，常常1-3天；或可用于慢性治疗，时间超过数月或数年。

以下非限制性实施例将对本发明进一步阐述。

实施例

实施例1 zsig45的鉴定

A.用EST序列获得全长zsig45

用信号捕集物作为查询系统筛选翻译的内部垂体文库DNA数据库，由此鉴定出与人类分泌信号序列同源的表达序列标记(EST)序列。根据所鉴定的EST序列设计寡核苷酸引物。这些引物用于在EST内部引发，以便从人类垂体cDNA文库分离全长克隆。

B.分离全长zsig45 cDNA：

为获得全长cDNA，利用了3’RACE。以人类垂体cDNA文库为模板，用寡核苷酸ZC694(SEQ ID NO：16)和ZC 14，030(SEQ ID NO：17)为引物产生3’RACE产物。这第一轮3’RACE PCR反应如下进行：95℃5分钟进行一个循环；94℃30秒、然后55℃30秒、然后72℃3分钟进行35个循环。

所得DNA产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，在约650 bp处可见一条明显的带。此DNA带经凝胶纯化，并亚克隆至PCR-blunt^TM载体(Invitrogen，San Diego，CA)。对亚克隆的序列分析显示，该DNA产物包括EST DNA序列。

此650 bp插入片段从载体中经EcoRI限制性酶切产生，并在1％琼脂糖凝胶上电泳。片段用市售凝胶提取试剂盒(QiaexII^TM；Qiagen IncChatsworth，CA)纯化，然后用随机引物标记系统Prime-It Ⅱ(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)按说明书标记放射性³²p-dCTP。然后用Nuc-Trap^TM层析柱(Stratagene)按说明书纯化探针。用ExpressHyb^TM(Clontech，Palo Alto，CA)溶液预杂交并作为人类垂体文库菌落浸提物的杂交溶液。用5×10⁶cpm／ml标记探针在65℃杂交过夜。然后在2X SSC/1％SDS中65℃洗涤菌落浸提物，再在0,1X SSC/0.1％SDS中55℃洗涤。分离杂交克隆并发现包括编码zsig45蛋白的全长cDNA。

实施例2

组织分布

用Human Multiple Tissue Blots(MTN Ⅰ，MTN Ⅱ，MTN Ⅲ)(Clontech)进行Northern印迹分析。含实施例1所述650bp克隆插入片段的载体经限制性酶切及1％琼脂糖凝胶电泳。用市售试剂盒(QiaexⅡ^TM；Qiagen)纯化该650bp片段，然后用随机引物标记系统Prime-ItⅡ(Stratagene Cloning Systems，)按说明书标记放射性³²p-dCTP。然后用Nuc-Trap^TM层析柱(Stratagene)按说明书纯化探针。用ExpressHyb^TM(Clontech)溶液预杂交并作为Northern印迹的杂交溶液。用5×10⁶cpm／ml标记探针在65℃杂交过夜。然后在2X SSC/1％SDS中65℃洗涤印迹膜，再在0.1X SSC/0.1％SDS中55℃洗涤。测得一种转录产物大小约650bp。甲状腺的信号最强。印迹膜上任何其它组织在650bp处未出现信号。

还用Human RNA Master Blots^TM(Clontech)进行点杂交。点杂交的方法和条件与上述Multiple Tissue Blots的相同。甲状腺和垂体中表现出强信号。结肠中有强度较弱的信号。

实施例3

基于PCR的zsig45基因染色体作图

用市售“GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel”(ResearchGenetics，IncHuntsville，AL)对zsig45作图，定位于2号染色体。GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel包含来自93个放射杂交克隆中每一个的DNA，外加两个对照DNA(HFL供体和A23受体)。公开的WWW服务器(http：//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)使得可以相对于基因组研究的Whitehead Institute/MIT中心中用GeneBridge 4Radiation Hybrid Panel构建的人类基因组放射杂交图谱(“WICGR”放射杂交图谱)而作图。

为了用“GeneBridge 4 RH Panel”对zsig45作图，在96孔板(Stratagene，La Jolla，CA)中加入20μl反应液并应用于“RoboCyclerGradient 96”热循环仪(Stratagene)中。95个PCR反应液中各包括1OX KlenTaq PCR反应缓冲液(Clontech)2μl，dNTP混合物(每种2.5mM，Perkin-Elmer，FosterCity，CA)1.6μl，有义引物ZC 15，414(SEQID NO：18)1μl，反义引物ZC15，413(SEQ ID NO：19)1μl，“RediLoad”(Research Genetics，Inc.)2μl，50X Advantage KlenTaq聚合酶混合物(Clontech)0.4μl，单个杂交克隆或对照的DNA 25ng，加双蒸水至终体积为20μl。反应液用等体积矿物油覆盖并封闭。PCR循环仪条件如下：首先一个95℃5分钟的变性循环，然后95℃1分钟变性、62℃1分钟退火、72℃1．5分钟延伸的40个循环；最后72℃7分钟延伸的一个循环。反应液经2％琼脂糖凝胶(Life Technologies，Gaithersburg，MD)电泳分离。

结果显示，zsig45作图到WICGR放射性杂交图谱上自人类第2号染色体连锁群顶端的1086,2 cR_3000处。近端和远端框架标记分别为WI-6310(D2S2704)和D2S2585。利用周边标记将zsig45定位于2号染色体完整LDB图谱中2q37,3区(Genetic Location数据文库，Southhampton大学，www服务器：http：//cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/)。

实施例4

zsig45氨基末端Glu--Glu标记的和羧基末端Glu-Glu标记的酵母表达载体的构建及表达

甲醇毕赤酵母中zsig45的表达利用共同转让的WIPO公开文件97/17450所述表达系统。经同源重组构建含编码zsig45的所有或部分多核苷酸的表达质粒。从pCZR204构建表达质粒以便表达C末端Glu-Glu标记的(CEE)，或N末端Glu-Glu标记的(NEE)zsig45多核苷酸。pCZR204含AUGl启动子，αFpp前导序列紧随其后，接着是N末端Glu-Glu标记、SmaⅠ限制性钝端位点、羧基末端肽标记(Glu-Glu)、翻译终止密码子、AUG1终止子、ADE2选择性标记，最后是AUG1 3’非翻译区。该载体中还包括在酿酒酵母中筛选和复制所必需的URA3和CEN-ARS序列，在大肠杆菌中筛选和复制所必需的AmpR和colE1 ori序列。插入这些载体中的zsig45序列从zsig45氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的第47位(Lys)残基开始。

对于每一构建体，准备两个接头，与zsig45一起经同源重组整合至上述酵母表达载体。未标记N末端接头(SEQ ID NO：20)一端跨越α因子前原区(prepro)(αFpp)编码序列的70个碱基对，并通过另一端与成熟zsig45序列的氨基末端编码序列70碱基对连接。NEE标记接头(SEQID NO：21)在αFpp编码序列与zsig45序列之间连接上Glu-Glu标记(SEQID NO：22)。未标记C末端接头(SEQ ID NO：23)一端跨越zsig45羧基末端编码序列约70个碱基对与AUGl终止子序列的70个碱基对。CEE标记的接头(SEQ ID NO：24)在zsig45 C末端与AUG1终止子区之间插入Glu-Glu标记(SEQ ID NO：22)。为产生NEE标记的zsig45，在同源重组中应用NEE标记的接头和未标记的C末端接头；为产生CEE标记的zsig45，在同源重组中应用未标记的N末端接头和CEE标记的接头。

NEE标记的zsig45质粒的构建

100 ng SmaⅠ消化的pCZR204接受者载体、1μg Eeo RI-BamHⅠ消化的zsig45 eDNA供体片段、1μg NEE标记的zsig45接头(SEQ ID NO：21)和1μgC末端未标记接头(SEQ ID NO：23)在酿酒酵母(SF838-9D)中经同源重组产生NEE标记的zsig45质粒(Rothman，J.等，EMBO J.8：2057-2065，1989)。

NEE-zsig45接头经PCR反应合成。反应液最终为100ml，其中分别加入有义和反义中心寡核苷酸ZC13，731(SEQ ID NO：25)和ZC15，264(SEQ ID NO：26)各1 pmol；有义和反义寡核苷酸引物ZC13，497(SEQID NO：27)和ZC15，272(SEQ ID NO：28)各100 pmol；10X PCR缓冲液(Boehringer Mannheim)10μ1、Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)1μl，0.25mM核苷三磷酸混合物(Perkin Elmer)10μl以及蒸馏水。PCR反应在94℃30秒、50℃1分钟和72℃1分钟进行10个循环，最后在72℃延伸6分钟。所得338bp双链、NEE标记的接头公开于SEQ ID NO：21。

如所述分别用有义和反义中心寡核苷酸ZC15，725(SEQ ID NO：29)和ZC15，633(SEQ ID NO：30)；以及分别用有义和反义寡核苷酸引物ZC15，271(SEQ ID NO：31)和ZC13，734(SEQ ID NO：32)经PCR反应产生C末端未标记zsig45接头。所得290 bp双链、C末端未标记接头公开于SEQ ID NO：23。

CEE-zsig45质粒的构建

100 ng SmaⅠ消化的pCZR204接受者载体、1μg Eco RI-BamHⅠ消化的zsig45 eDNA供体片段、1μgN末端未标记zsig45接头(SEQ ID NO：20)和1μg CEE标记的接头(SEQ ID NO：24)在酿酒酵母中经同源重组产生CEE-zsig45质粒。

如所述分别用有义和反义中心寡核苷酸ZC15，14，821(SEQ ID NO：33)和ZC15，265(SEQ ID NO：34)；以及分别用有义和反义寡核苷酸引物ZC14，822(SEQ ID NO：35)和ZC15，272(SEQ ID NO：28)经PCR反应产生N末端未标记zsig45接头。所得244 bp双链、N末端未标记的接头公开于SEQ ID NO：20。

如所述分别用有义和反义中心寡核苷酸ZC15，763(SEQ ID NO：36)和ZC15，633(SEQ ID NO：30)；以及分别用有义和反义寡核苷酸引物ZC15，271(SEQ ID NO：31)和ZC13，734(SEQ ID NO：32)经PCR反应产生CEE标记的接头。所得约288 bp双链、CEE标记的接头公开于SEQ IDNO：24。

将100μl酵母(酿酒酵母)感受态细胞分别与上述各种DNA混合物10ml组合，转移至0.2cm电穿孔小槽中。以0.75 kY(kY/cm)、∞ohms，25μF电脉冲处理酵母/DNA混合物。每管加入1.2M山梨醇600μl，将酵母分成两个300μl铺板于两块URA D平板并在30℃温育。

约48小时后，单个平板上的Ura⁺酵母转化子重新悬浮于2.5ml水中，略微离心以使酵母细胞成团。将细胞团块重新悬浮于裂解缓冲液(2％Triton X-100，1％SDS，100mM NaCl，10mM Tirs，pH8.0，1mM EDTA)1ml中。在含300μl酸洗玻璃珠和200μl苯酚-氯仿的Eppendorf试管中加入500μl裂解混合物，间隔1分钟旋转2-3次，然后在Eppendorf离心机中以最大速度转5分钟。取300μl水相转移至新试管，用600μl乙醇沉淀DNA，然后4℃离心10分钟。DNA团块重新悬浮于100μl水中。

用1μl酵母DNA制备物转化50μl电感受态大肠杆菌MC1061细胞(MC1061；Casadaban，M.& S.Cohen，分子生物学杂志138：179-207，1980)。细胞以2.0 kV，25μF和400 ohms电穿孔。之后，将1ml SOC(2％Bacto^TM蛋白胨(Difco，Detroit，MI)，0,5％酵母浸膏(Difco)，10mM NaCl，2,5mM KCl，10mM MgCl₂，10mM MgSO₄，20mM葡萄糖)按每等份250μl铺板于4个LB AMP平板(LB肉汤(Lennox)，1.8％Bacto^TM琼脂(Difco)，100mg/l氨苄青霉素)上。

携带正确的NEE标记和CEE标记的zsig45表达构建体的单个克隆经PCR和限制性消化鉴定，用序列分析检验zsig45插入片段的存在并证实各DNA序列相互间已正确连接。用Qiagen Maxi试剂盒(Qiagen)按说明书分离大批量质粒DNA，DNA经NotⅠ消化而由该载体骨架释放毕赤酵母-zsig45表达盒。然后将NotⅠ限制性消化的DNA片段转化至甲醇毕赤酵母表达宿主PMAD16。该步骤通过将制备的感受态PMAD16细胞100μl与NotⅠ限制性消化的zsig45 10μg混合并转移至一个0.2cm的电穿孔小槽中而进行。酵母/DNA混合物经0.75 kV，25mF(欧姆数不定)电脉冲处理。小槽中加入1.2M山梨醇1ml，按每等份500μl铺板于两个用于筛选的ADE DS(0.056％-Ade-Trp-Thr粉末，0.67％无氨基酸的酵母氮碱，2％D-葡萄糖，0.5％200X色氨酸、苏氨酸溶液和18.22％D-山梨醇)平板上，30℃温育。挑取克隆并通过Western印迹筛选高水平表达zsig45的克隆。所得含NEE标记之zsig45质粒的酵母细胞命名为PMAD16∷pCZR207，含CEE标记之zsig45的质粒的酵母细胞命名为PMAD16∷pCZR210。随后用这些克隆发酵。

为表达zsig45 NEE进行的甲醇毕赤酵母PMAD16∷pCZR207的发酵以6.0升分批加料发酵进行。发酵始于3.0升添加葡萄糖的基础培养基。罐中接种来自30℃于YEPD中振荡烧瓶内培养20小时的培养物(8.0％v/v)。葡萄糖从12小时时开始加入，并根据发酵剩余量以不同速度添加。驱动ZSIG45NEE蛋白表达的AGU1启动子通过在已发酵时间(EFT)为40小时的时候添加甲醇而诱导开启。发酵进行72小时，离心收集。从5.5升发酵液中，经除去细胞后得到约3.0升细胞液。用针对N末端glu-glu标记的单克隆抗体探测Western印迹膜，检测到一种非糖基化蛋白。

为表达ZSIG45CEE而发酵甲醇毕赤酵母PMAD16：pCZR210.1的过程按上述各步骤进行。用针对C末端glu∶glu标记的单克隆抗体在Western印迹膜上检测到一种非糖基化蛋白。

实施例5

从甲醇毕赤酵母所感染的细胞中纯化zsig45CEE和zsig45NEE多肽

除非另有指明，所有操作均在4℃进行。以下过程用于纯化含C末端或N末端GluGlu(EE)标记的zsig45多肽。向3000ml毕赤酵母条件培养基(见实施例4)中加入蛋白酶抑制剂溶液至终浓度为2.5mM乙二胺四乙酸(EDTA，Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)、0.001mM亮抑酶肽(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)、0,001mM抑胃酶肽(Boehringer-Mannheim)、和0.4mM Pefabloc(Boehringer-Mannheim)。样品在Beckman Avanti J25I离心机(Beckman Instruments)的BeckmanJLA-10.5转头(Beckman Instruments，Palo Alto，CA)上经10，000rpm4℃离心30分钟去除细胞残渣。向上清中加入抗EESepharose(如下述制备)50.0ml，混合物在Wheaton(Millville，NJ)摇床上4℃轻微振荡处理18.0小时。

将混合物倾倒于5.0×20.0cm Econo层析柱(Bio-Rad，Laboratories，Hercules，CA)中，抗EE Sepharose凝胶用30倍柱体积的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤。测量未滞留流过液的280nm吸收值直至低于0.05。弃去流过液。一旦流过液的吸收值低于0.05就将柱流速降至0。然后在4℃用含0.2mg/ml EE肽(Anaspec，San Jose，CA)的PBS 2.0倍柱体积洗涤抗EE Sepharose凝胶1.0小时。所用EE肽具有N-GluTyrMetProValAsp-C(SEQ ID NO：37)的序列。洗涤后，柱流重新开始，收集所洗脱的含zsig45CEE(或zsig45NEE)多肽和EE肽的多肽。这一级分被称为“多肽洗脱级分”。抗EE Sepharose凝胶用2.0倍柱体积的0.1M甘氨酸，pH2.5洗涤，分开收集甘氨酸洗涤物。通过加入少量10X PBS将甘氨酸洗脱级分的pH调至7.0，贮于4℃以便必要时进行分析。

用分子量截留值为3000的膜浓缩仪(Millipore，Bedford，MA)按说明书将多肽洗脱级分浓缩至5.0ml。为了将EE肽与zsig45CEE或zsig45NEE多肽分离，将所浓缩的多肽洗脱级分上样于PBS预平衡的1.5×50cm Sephadex G-50(Pharmacia，Piscataway，NJ)层析柱，用BioCadSprint HPLC(PerSeptive BioSystems，Framinghan，MA)以1.0ml/min的流速层析。按2ml的级分收集，监控280nm光吸收值。收集第一个280nm吸收峰并在柱外水体积附近洗脱的物质。此物质即纯化的zsig45CEE或zsig45NEE多肽，经SDS-PAGE和抗EE抗体的Western印迹分析进行鉴定。

在考马斯亮兰染色的SDS-PAGE凝胶上，zsig45NEE制备物有一条表现分子量为8000的明显带。此带的迁移率在有或无还原剂时相同，并在用抗EE抗体探测的Western印迹膜上可见。Zsig45 CEE纯化蛋白在考马斯亮兰染色的SDS-PAGE凝胶上也显示一条8000 Da的主带。用抗EE抗体进行Western印迹，显示在8000 Da处有一条交叉反应性物质的主带，在18，000 Da处有次要成分。8000 Da带在SDS-PAGE凝胶或western印迹膜上的迁移率不因有或无还原剂而改变。

纯化蛋白的浓度经BCA分析(Pierce，Rockford，IL)确定，按我们的标准过程分装，贮于-80℃。纯化zsig45NEE多肽的浓度为0.35mg/ml，zsig45CEE多肽的浓度为0.17 mg/ml。

为制备抗EE Sepharose，100 ml床体积的蛋白G-Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)用500ml Nalgene 0.45微米滤器装置经含0.02％叠氮钠的PBS 100 ml洗3遍。凝胶用6.0倍体积的200mM三乙醇胺，pH8.2(TEA，Sigma，St.Louis，MO)洗涤，加入含900mg抗体的等体积EE抗体溶液。4℃温育过夜后，用5倍体积的200mM TEA如上述洗涤树脂以去除未结合抗体。将树脂重新悬浮于2倍体积的TEA中，转移至适当容器，加入溶解于TEA的dimethylpimilimidate-2HCl(Pierce，Rockford，IL)至终浓度为每ml蛋白G-Sepharose凝胶36mg。凝胶在室温摇动45分钟，用上述滤器装置除去液体。然后用20mM乙醇胺的200mM TEA溶液5倍体积经室温温育10分钟封闭非特异性位点。然后用含0.02％叠氮钠的PBS 5倍体积洗涤凝胶，并用该溶液于4℃贮存凝胶。

实施例6

未标记zsig45重组腺病毒的产生

zsig45的蛋白编码区用分别在5’和3’末端添加FseⅠ和AscⅠ限制性位点的引物经PCR扩增。PCR反应以ZC17536(SEQ ID NO：38)和ZC17537(SEQ ID NO：39)为引物、含全长zsig45 cDNA(实施例1)的BluescriptSKⅡ^TM(Stratagene)质粒为模板，反应如下进行：95℃5分钟一个循环；接着95℃1分钟、58℃1分钟、72℃1.5分钟的15个循环；接着72℃7分钟；接着4℃浸泡。将PCR反应产物上样于TAE缓冲液中的1.2％(低熔点)SeaPlaque GTG(FMC，Rockland，ME)凝胶。从凝胶中切出zsig45 PCR产物，用QIAquick^TMPCR纯化试剂盒gel cleanup试剂盒按各自说明书(Qiagen)纯化。然后PCR产物经FseⅠ-AscⅠ消化、苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀、再溶于20mlTE(Tris/EDTA pH8)中。然后将344bp zsig45片段连接至转基因载体pTG12-8(见实施例7)的FseⅠ-AscⅠ位点并经电穿孔转化至DH10B感受态细胞。含zsig45的克隆经质粒DNA小量制备再用FseⅠ-AscⅠ消化鉴定。将其中一个阳性克隆送至测序部门以确保构建体无缺失或其它异常。Zsig45 cDNA序列得到证实。用QiagenMaxi Prep方案(Qiagen)制备DNA以继续我们的下述过程。

制备用于腺病毒生产的DNA构建体

用FseⅠ和AscⅠ酶从TG12-8载体中释放344 bp zsig45 cDNA。在1％低熔点SeaPlaque GTG^TM(FMC，Rockland，ME)凝胶上分离cDNA并切出，70℃熔化凝胶条，用等体积Tris缓冲的苯酚抽提2次，然后乙醇沉淀。将DNA重新悬浮于10μl水中。

将zsig45 cDNA克隆至pAdTrack CMV(其天然多接头已被FseⅠ、EcoRV、和AscⅠ位点取代)的FseⅠ-AscⅠ位点(He，T-C.等，PNAS 95：2509-2514，1998)。连接过程用Fast-Link^TM DNA连接和筛选试剂盒(Epicentre Technologies，Madison，WI)进行。为使质粒线性化，pAdTrack CMV zsig45质粒约5μg用PmeⅠ消化。线性化质粒约1μg与超螺旋pAdEasy(He等，同上)200 ng共转化BJ5183细胞。共转化过程用Bio-Rad Gene Pulser以2,5kV，200 ohms和25 mFa进行。全部共转化产物铺板于4块含25μg/ml卡那霉素的LB平板上。挑取最小菌落，在LB/卡那霉素平板上增菌培养，经标准DNA小量制备过程鉴定重组腺病毒DNA。重组腺病毒DNA经FseⅠ-AscⅠ消化证实存在zsig45。将重组腺病毒小量制备DNA转化至DH10B感受态细胞，用Qiagen maxi prep试剂盒按说明书制备DNA。

用重组DNA转染293a细胞

重组腺病毒DNA约5μg经PacⅠ酶(New England Biolabs)于37℃在含PacⅠ 20-30 U的反应液100μl中消化3小时。用等体积苯酚/氯仿两次抽提消化的DNA并用乙醇沉淀。将DNA团块重新悬浮于10μl蒸馏水。T25烧瓶中已于前一天接种、并培养至60-70％铺满的QBI-293A细胞(Quantum Biotechnologies，Inc.Montreal，QcCanada)用上述PacⅠ消化的DNA转染。PacⅠ消化的DNA用无菌HBS(150mM NaCl，20mM HEPES)稀释至总体积多达50μl。在另一试管中，DOTAP(BoehringerMannheim，1mg／ml)20μl用HBS稀释至总体积为100μl。将DNA加入D0TAP，经上下移液操作轻轻混合，置于室温15分钟。去除培养液而留下293A细胞，用含1mM丙酮酸钠(GibcoBRL)、0.1mM MEM非必需氨基酸(GibcoBRL)和25mM HEPES缓冲液(GibcoBRL)的无血清MEMα(GibcoBRL)5ml洗涤。向293A细胞中加入无血清MEM 5ml，维持在37℃。向T25烧瓶中的293A细胞滴加DNA/脂质混合物，轻轻混合，37℃温育4小时。4小时后，吸出含DNA/脂质混合物的培养液，代之以含5％胎牛血清的完全MEM 5ml。监控转染细胞的绿色荧光蛋白(GFP)的表达以及病灶即病毒空斑的形成。

用重组腺病毒DNA转染293A细胞7天后，细胞表达GFP蛋白并开始形成病灶。这些病灶均为病毒“空斑”，用细胞刮取器收集所有293A细胞而得到病毒粗裂解物。将裂解物转移至一个50ml的锥型管。为了使大多数病毒颗粒从细胞中释放，在干冰/乙醇浴和37℃水浴中进行3个冻/融循环。

重组腺病毒(rAdV)的扩增

扩增粗裂解物(初级(1°)扩增)以获得zsig45 rAdV裂解物工作“原液”。10个已培养20小时、几乎全铺满(80-90％)293A细胞的10cm平板，每个中加入rAdV粗裂解物200ml，监控48-72小时，在普通光学显微镜下观察CPE，在荧光显微镜下观察GFP的表达。当所有293A细胞均显示CPE(细胞病变效应)时，收集此1°裂解物原液，如对rAdV粗裂解物所述进行反复冻/融。

zsig45 rAdV的二级(2°)扩增如下：制备20个15cm的293A细胞组织培养平板，使细胞铺满80-90％。每个平板吸去5％MEM培养液至20ml，接种1°扩增的rAdV裂解物300-500ml。48小时后，病毒将293A细胞裂解，将此裂解物收集在250ml聚丙烯离心瓶中，纯化rAdV。

AdV/cDNA纯化

粗裂解物瓶中加入0.5％终浓度的NP-40去污剂以裂解所有细胞。将瓶置于旋转平台上以不使瓶倾倒的最快速度摇动10分钟。20，000XG离心15分钟使细碎片沉淀成团。将上清转移至250ml聚碳酸酯离心瓶中，加入0.5倍体积的20％PEG8000/2.5M NaCl溶液。瓶子冰浴振荡过夜。20，000XG离心瓶子15分钟，上清液弃至漂白剂中。沿瓶壁旋转标志两侧的两条垂直线上的白色沉淀即为沉淀的病毒/PEG。用无菌细胞刮取器将2个瓶子的沉淀取出，重新悬浮于2,5ml PBS中。将病毒溶液加入2ml微量离心管中，微量离心机中14，000XG离心10分钟去除任何残余细胞碎片。将2ml微量离心管中的上清转移至15ml带帽聚丙烯小管中，用氯化铯(CsCl)将密度调整至1.34g／ml。估计病毒溶液的体积并加入0.55g/ml CsCl。溶解CsCl，1ml该溶液重1.34g。将溶液转移至3.2ml的聚碳酸酯厚壁离心管(Beckman编号362305)，在Beckman Optima TLX微量超速离心机中用TLA-100.4转头于25℃、80，000rpm(348，000XG)离心3-4小时。病毒形成白色带。用宽嘴移液头收集病毒带。

来自该梯度的病毒含有大量CsCl，应用于细胞前必需除去。用预装了Sephadex G-25M(Pharmacia)的Pharmacia PD-10层析柱使病毒制备物脱盐。层析柱用20ml PBS平衡。上样病毒，使之流入柱中。加5ml PBS至柱中，按8-10滴的级分收集。各级分的1∶50稀释液在分光光度计上260nm处测光密度。一个清晰的吸收峰出现在7-12级分之间。汇集这些级分，测定1∶50稀释液的光密度(OD)。应用公式将OD转换成病毒浓度：(260nm处的OD)(50)(1.1×10¹²)=病毒体/ml。Zsig45 rAdV的1∶50稀释液的0D为0.057，对应于病毒浓度为3,1×10¹²病毒体/ml。

为贮存病毒，纯化病毒中加甘油至终浓度为15％，轻轻但有效地混合，分装后贮存于-80℃。

50％CPE(TCZD)病毒滴定试验中的组织培养物感染剂量

按Quantum Biotechnologies，Inc.(Montreal，Qc.Canada)开发的方案测量重组病毒的感染性。简述为，为每种待检重组病毒准备两个96孔组织培养平板，板上每孔接种1×10⁴个293A细胞的含2％胎牛血清之MEM培养液。24小时后，用含2％胎牛血清的MEM将每种病毒从1×10^-2按10倍稀释至1×10^-14。每个稀释度取100μl加入20孔之一中。37℃5天后，检查每孔是否有细胞病变效应(CPE)并计算“空斑形成单位/ml”(PFU)值。

所用TCID50公式按上述Quantum Biotechnologies，Inc.中所述。滴度(T)根据用10^-2-10^-14稀释的病毒感染的平板在5天后读取的数值确定。确定每个稀释度的CPE阳性孔对总孔数的比率(R)。

为计算未稀释病毒样品的滴度，使用因子“F”=1+d(S-0.5)；其中S为比率(R)的总和；而“d”为稀释倍数的Log10，如对于10倍稀释而言“d”相当于1。未稀释样品的滴度为T=10^(1+F)=TCID₅₀／ml。为了将TCID₅₀/ml转换成pfu/ml，在滴度(T)计算中从指数减去0.7。

zsig45腺病毒滴度为1.1×10¹⁰pfu/ml。

实施例7

zsig45转基因小鼠

设计寡核苷酸以产生包含Kozak共有序列及整个zsig45编码区的PCR片段。这些寡核苷酸设计成在5’端带有FseⅠ位点，3’端带有AscⅠ位点，以便有利于克隆至我们的标准转基因载体pMT12-8中。pMTl2-8包含小鼠MT-1启动子，并在FseⅠ位点上游有5’大鼠胰岛素Ⅱ内含子。

PCR反应以200ng人类zsig45模板和寡核苷酸ZC17，536(SEQ ID NO：38)和ZC17，537(SEQ ID NO：39)进行。PCR反应条件如下：95℃5分钟；95℃60秒、62℃60秒、72℃90秒的15个循环；和72℃7分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离并用QiaQuick^TM(Qiagen)凝胶提取试剂盒纯化。分离的344 bp DNA片段经FseⅠ和AscⅠ(Boerhinger Mannheim)消化、乙醇沉淀，并与已用FseⅠ和AscⅠ消化的pMT12-8连接。设计用于在转基因小鼠中表达目的基因的pMT12-8质粒包含一个表达盒，其两侧分别为10kb的MT-1 5’DNA和7kb的MT-13’DNA。该表达盒包括MT-1启动子、大鼠胰岛素Ⅱ内含子、用于插入所需克隆的多接头、以及人类生长激素poly A序列。

将约1μl连接反应液按说明书电穿孔到DH10B ElectroMax^TM感受态细胞(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)中，铺板于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，温育过夜。挑取菌落并培养于含100μg／ml氨苄青霉素的LB平板上。从挑取的克隆小量制备DNA，经EcoRⅠ限制性消化以及随后琼脂糖凝胶电泳筛选zsig45插入片段。大量制备正确的pMT-zsig45构建体。制备含5’和3’侧翼序列、MT-1启动子、大鼠胰岛素Ⅱ内含子、zsig45 cDNA以及人类生长激素poly A序列的SaiⅠ片段，用于微量注射至受精的小鼠卵母细胞中。

从54只幼鼠中鉴定出15只转基因小鼠。对所有15只转基因小鼠进行肝活检，经RT-PCR定量测定肝zsig45转基因mRNA。表达情况如下：3只高水平表达鼠(约2400-5100个mRNA分子/肝细胞)；3只中水平表达鼠(约1600-1900个mRNA分子/肝细胞)；4只低水平表达鼠(约200-400个mRNA分子/肝细胞)；5只鼠检测不到转基因表达。

实施例8

zsig45的体内活性

连续14天每天给正常小鼠皮下注射纯化的蛋白制剂以检验zsig45蛋白的潜在体内活性。实验使用34只开始实验时为8周龄的C57BL6雄性小鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN)。将小鼠分成4组：10只小鼠用包含在有0.1％牛血清白蛋白(BSA)(ICNPharmaceuticals)的0.1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的10μg纯化zsig45NEE多肽(见实施例5)进行注射；10只小鼠用含于内有0.1％BSA之0.1ml PBS中的10μg纯化zsig45CEE多肽(见实施例5)进行注射；9只小鼠只用含0.1％BSA的PBS(载体)注射；5只小鼠不接受注射。在第0、7、和14天称小鼠体重。第7和14天给小鼠放血以便进行全血细胞计数，并用Everett中心实验室(Everett WA)的小鼠化学筛选法评估小鼠的临床化学指标。第14天时处死小鼠，将组织收集在福尔马林中以便进行组织学分析(见下文)。

血液化学指标完全正常，并显示各组小鼠之间无显著性差异。各组小鼠体重的增加无明显差异。相似地，血细胞计数均在正常范围内，各组间无显著性差异。

皮肤的显微镜检评估

从皮下注射zsig45CEE、zsig45NEE或载体、牛血清白蛋白(BSA)对照的小鼠分离并制备可用于组织学分析的皮肤样品(以及其它组织)。在实验性处理开始约2周后收获皮肤。样品在10％缓冲的福尔马林中固定、石蜡包埋、切成3μm的切片、用苏木精和曙红染色。由不了解具体处理的执业兽医病理学家对切片进行检查并评出表示炎症严重程度的分数(0为无炎症，1为轻度炎症，2为中度炎症，3为严重炎症)。测定每个处理组的平均严重性评分并用GraphPad InStata软件包(GraphPadSoftware，San Diego，CA)进行分析。经Kruskal-Wallis检验，zsig45-NEE组的平均严重性分数显著不同于只给予载体的动物组(p＜0.05)。zsig45-CEE组的平均严重性分数(为2.1)类似于zsig45-NEE组(为2.3)，但却显著不同于对照组(平均值为1.2)。

然后将皮肤切片随机分类，由不了解具体处理的病理学家检查，并根据从最轻到最重的炎症严重程度评级。除了一只对照小鼠(可能在尸检时因疏忽而标记错误)，所有对照小鼠均在严重性评级的最低一半中。炎症主要发生于注射部位的皮下组织中。炎症部位也有在深部真皮上层和肌肉系统下层中，但不太常见。该部位的炎性细胞由淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞和数量略少的中性粒细胞组成，提示有慢性活动性炎症反应。在注射部位的纤维结缔组织中炎症也有轻度至中度的加深。处理组所见炎症反应和纤维变性比对照组严重，而联合给予zsig45NEE的处理组所观察到的炎症反应比联合给予zsig45CEE的略重。BSA处理组和zsig45处理组的主要区别在炎症反应和纤维变性的严重性和波及范围上，对照组(BSA处理组)中一般从无反应到轻度反应，zsig45处理组中为中度至严重程度的反应。

从上文中可以理解，尽管本文为举例说明而描述了本发明的特定实施方案，但在不违背本发明精神和脱离本发明范围的前提下，还可作各种修改。因此本发明仅由所附权利要求书作出限定。

序列表&#60110&#62ZymoGenetics公司

1201 Eastlake Avenue East

西雅图，华盛顿98102

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Claims

1．一种分离的多核苷酸，它所编码的多肽包含的氨基酸序列与选自下组的一个氨基酸序列至少90％相同：

(a)如SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列；

(b)如SEQ ID NO：4中第1(Met)-85(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列；

(c)如SEQ ID NO：3中第1(Met)-89(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列；

(d)如SEQ ID NO：2中第1(Met)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列。

2．选自下组的分离的多核苷酸分子：

(a)包含如SEQ ID NO：1中第219-422位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；

(b)包含如SEQ ID NO：1中第168-422位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；

(c)包含如SEQ ID NO：1中第156-422位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；

(d)包含如SEQ ID NO：1中第82-422位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；以及

(e)与(a)，(b)，(c)或(d)互补的多核苷酸分子。

3．权利要求1的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含SEQ ID NO：15中第1-342位的核苷酸。

4．权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多肽由与SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列至少90％相同的氨基酸残基序列组成。

5．权利要求1的分离的多核苷酸，其中该多肽由SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸残基序列组成。

6．权利要求1的分离的多核苷酸，其中该多肽包含基元1-5。

7．包含以下可操作连接在一起的元件的表达载体：转录启动子；

编码与SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列至少90％相同的zsig45多肽的DNA片段；以及转录终止子。

8．权利要求7的表达载体，其中进一步包含与该DNA片段可操作连接的分泌信号序列。

9．权利要求8的表达载体，其中所述分泌信号序列编码选自下组的一个氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2中第1-46位氨基酸；

(b)SEQ ID NO：3中第1-21位氨基酸；和

(c)SEQ ID NO：4中第1-17位氨基酸；

10．一种导入了权利要求7之表达载体的培养细胞，其中该细胞表达该DNA片段编码的多肽。

11．编码融合蛋白的DNA构建体，其中该DNA构建体包括：

编码与选自下组之氨基酸序列至少90％相同的多肽的第一DNA片段：

(a)SEQ ID NO：2中第1-46位氨基酸；

(b)SEQ ID NO：3中第1-21位氨基酸；和

(b)SEQ ID NO：4中第1-17位氨基酸；以及

编码另一多肽的第二DNA片段，

其中第一和第二DNA片段符合读框地连接在一起；并编码该融合蛋白。

12．一种分离的多肽，它包含与选自下组的一个氨基酸序列至少90％相同的氨基酸残基序列：

(a)如SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列；

(b)如SEQ ID NO：4中第1(Met)-85(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列；

(c)如SEQ ID NO：3中第1(Met)-89(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列；

(d)如SEQ ID NO：2中第1(Met)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列。

13．权利要求12的分离的多肽，其中该多肽由与SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列至少90％相同的氨基酸残基序列组成。

14．权利要求12的分离的多肽，其中所述氨基酸残基序列为SEQ IDNO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示氨基酸序列。

15．权利要求12的分离的多肽，其中所述氨基酸残基序列包含基元1-5。

16．制备zsig45多肽的方法，该方法包括：

培养已导入权利要求7之表达载体的细胞；和分离该细胞所产生的zsig45多肽。

17．制备针对zsig45多肽的抗体的方法，包括：

用选自下组的多肽接种动物：

(a)一种由9-67个氨基酸组成的多肽，其中该多肽与SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位所示氨基酸的连续序列至少90％相同；和

(b)具有SEQ ID NO：2中第47(Lys)-114(Asp)位氨基酸所示序列的多肽；和

其中该多肽激发动物体内的免疫应答以产生抗体；以及

从动物体内分离该抗体。

18．权利要求17的方法产生的抗体，其可与zsig45多肽结合。

19．权利要求18的抗体，其中该抗体为单克隆抗体。

20．一种可与权利要求12的多肽结合的抗体。

21．检测待检样品中有无zsig45蛋白质活性的拮抗剂的方法，该方法包括：

用对zsig45所刺激的细胞途径有反应性的报道基因构建体转染zsig45反应性细胞；

根据权利要求16的方法制备zsig45多肽；

在有或无待检样品时将zsig45多肽加入细胞；

通过生物学或生物化学试验比较有和无待检样品时对zsig45多肽的应答水平；和

根据比较确定待检样品中zsig45活性的拮抗剂的存在情况。

22．检测待检样品中有无zsig45蛋白质活性的激动剂的方法，该方法包括：

加入待检样品；

通过生物学或生物化学试验比较有和无待检样品时的应答水平；以及

根据比较确定待检样品中zsig45活性的激动剂的存在情况。