CN104800270A - 一种西兰花芽苗提取物胶囊的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种西兰花芽苗提取物胶囊的制备方法，步骤为：⑴西兰花种子无土栽培后，取出芽3天的芽苗低温烘干粉碎过筛；⑵芽苗粉末加入Vit.C，用去离子水调节料液比为1:3，调节PH为5，经超声波振荡使其细胞破碎；⑶加丙酮，磁力搅拌下振荡，充分酶解；⑷经超声波振荡提取、抽滤、旋转蒸发浓缩后冻干即得到西兰花芽苗提取物粉末；⑸西兰花芽苗提取物粉末按1(粉末)：4(淀粉)：4(蔗糖)：1(微晶纤维素)比例，用酒精为润湿剂制成颗粒；⑹进行胶囊填充，即得西兰花芽苗提取物胶囊。与现有技术相比，本发明操作简单、成本低廉，且提取物胶囊中含2mg有效成分莱菔硫烷，具有抗癌、抗氧化等功能，具有良好的应用前景。

Description

一种西兰花芽苗提取物胶囊的制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域,具体涉及一种西兰花芽苗提取物胶囊的制备方法。

背景技术

西兰花含有大量的硫代葡萄糖苷(Glucosinolates)，在有水分的情况下，细胞受到破坏后，芥子酶(Myrosinase)可以与硫代葡萄糖苷接触并发生水解反应，产生异硫氰酸盐(Isothiocyanates，简称ITCs)。完整的硫代葡萄糖苷几乎没有抗癌活性，当西兰花采收、加工、咀嚼或植物水解时，植物细胞破碎，内源性芥子酶释放出来，将硫代葡萄糖苷水解为ITCs。ITCs的主要成分是莱菔硫烷(Sulforaphane，简称SFN)。SFN在西兰花中含量多，但是SFN在嫩芽中的含量最高。SFN可以抑制Ⅰ相代谢酶的表达，减少致癌物前体被代谢激活，还可以通过上调Ⅱ相代谢酶(GST、GSH、HO-1等)的表达，减少外来毒物、致癌物及一些活性物质(ROS等)对机体的侵害，从而保护细胞。

莱菔硫烷是一种不稳定的物质，如何有效地保存莱菔硫烷是现阶段需要解决的问题之一。目前，国内市场上西兰花芽苗提取物主要依赖进口，售价十分昂贵，因此研发国产的西兰花芽苗提取物制剂，满足我国日益增加的抗氧化、抗癌需求十分必要。

申请号为201310073393.4的中国发明专利一种富含萝卜硫素的西兰花芽菜粉及生产方法，公开日2013年12月4日，公开了一种采用芸薹属蔬菜为原材料制备莱菔硫烷的方法。该方法将种子、花、茎和叶等组织粉碎后，采用乙酸乙酯萃取除杂、硅胶吸附，异丙醇、乙醇、石油醚等混合溶液洗脱莱菔硫烷。申请号为200910037363.1的中国发明专利，公开日2009年8月26日，公开了一种从西兰花芽苗菜中提取多功能莱菔硫烷的方法，该方法取生长6～10天的西兰花芽苗，干燥粉碎后加入二氯甲烷、Vit.C、Na2S酶解，经洗涤过滤提纯后得到莱菔硫烷。但是上述两种方法都只是针对莱菔硫烷单体，而且上述两种提取方法均未考虑到莱菔硫烷单体常温下极容易降解，因此提取产率低。

发明内容

本发明提供了一种西兰花芽苗提取物胶囊的制备方法，制备方法简单，成本低，而且有效成分含量高。

本发明提供的一种西兰花芽苗提取物胶囊的制备方法，包括以下步骤：

将西兰花芽苗提取物粉末、淀粉、蔗糖、微晶纤维素按照质量比1：4：4：1混合，用30％酒精3mL为润湿剂制成颗粒，进行胶囊填充，即得西兰花芽苗提取物胶囊。

每10克西兰花芽苗提取物粉末、淀粉、蔗糖、微晶纤维素的总量用酒精3mL。

所述西兰花芽苗提取物粉末的制备方法，包括以下步骤：

A、取出芽3天的芽苗40℃烘干粉碎后过60目筛，得芽苗粉末；

B、取步骤A制备的芽苗粉末，混合维生素C，用去离子水调节料液质量比为1:2-4，加入Na₂S，调节pH为5，超声，使芽苗的细胞壁能充分破碎释放更多的芥子酶；得到混合溶液；

C、在步骤B所得混合溶液中加丙酮，震荡使其酶解；

D、经超声波振荡提取、抽滤、40℃旋转蒸发浓缩后，冻干机中冻干即可得到西兰花芽苗提取物粉末。

步骤B中，每20g芽苗粉末加入维生素C 0.04mg，加入Na₂S0.2g。

步骤B中，调节pH的溶液为是磷酸缓冲液，PH为5.8。

步骤B中，所述超声条件控制为：超声功率320W、超声频率70KHz、超声温度40℃，超声时间45min。

步骤C中酶解温度为20-30℃，在180rpm磁力搅拌下振荡4-8h；每20g芽苗粉末加入丙酮20ml。

步骤D超声条件与步骤B相同。

步骤A中所述芽苗的培养方法为：

(1)、将西兰花种子放置于浸种袋里，将种子和水以1:3质量比浸泡4-12h；有利于种子发芽；

(2)、在育苗盘的底部铺一层育苗纸，将浸泡好的种子均匀铺洒在育苗纸上，保持种子不重叠，遮盖苗床；以保护和促使西兰花芽苗生长；将洁净的纱布裁成比育苗盘大一些，用水润湿到不滴水，盖在铺满种子的育苗盘上，使种子避光正常发芽；

(3)、将育苗盘放置于温度为25℃与相对湿度为60％的环境中，保持空气流通，每天喷水3次，3天即可收获芽苗；

步骤(2)中所述育苗盘在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡1小时，冲洗干净后晾干，防止细菌、真菌等污染使芽苗生长过程中感染导致腐烂；

步骤(3)中每次喷水量为：使育苗纸湿润但是无积水，以防止积水过多使种子根部腐烂，待出芽后去掉纱布见光生长3天即可得到西兰花芽苗。

本发明中西兰花芽苗的育苗方法采用无土栽培，没有污染、操作简单，节约成本。用Vit.C水溶液，超声波辅助丙酮进行提取，无需添加外源芥子酶也可使细胞内莱菔硫烷充分被水解出来，提高生产效率。而且利用西兰花芽苗提取物作为莱菔硫烷的依附体制成胶囊，经30d大鼠毒性试验验证，该胶囊无明显毒副作用。且胶囊常温方便贮藏，解决了莱菔硫烷容易降解的问题。与现有技术相比，本发明通过制备西兰花芽苗提取物胶囊，有效解决了现阶段市场上西兰花芽苗提取物产品供应稀少、价格高昂等的问题。

附图说明

图1为制备的西兰花芽苗提取物HPLC图谱；

图2为莱菔硫烷标准品HPLC图谱；

图3为西兰花芽苗提取物制剂对大鼠肝脏组织学影响；(A)空白对照组；(B)90mg/kg组；(C)30mg/kg组；(D)10mg/kg组；(E)溶媒对照组。

具体实施方式

实施例1

一种西兰花芽苗提取物胶囊的制备方法，包括以下步骤：

⑴将育苗盘表面杂质洗净，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡一个小时，然后冲洗干净，晾干备用；

⑵将西兰花种子放置于浸种袋里，将种子和水以1:3质量比例浸泡12h，在此期间更换两次水以保持种子的洁净，种子浸泡好后用纯水冲洗捞出沥干水备用；

⑶在消毒晒干后的育苗盘底平铺一层育苗纸，用喷壶打湿育苗纸，将西兰花种子均匀铺洒在育苗纸上，保持种子不重叠，铺好后再次用喷壶将种子和育苗纸喷湿；

⑷将洁净的纱布裁成比育苗盘大一些，用水润湿到不滴水后盖在铺满种子的育苗盘上，用夹子固定；

⑸放置于温度为25℃与相对湿度为60％的地方，保持空气流通，每天喷水3次，每次均为育苗纸湿润但是无积水，待出芽后去掉纱布见光生长3天；

⑹取生长3天新鲜的西兰花芽苗，经鼓风低温烘干后粉碎过60目筛。

⑺精密称取20g提取物粉末于500mL烧杯中，加入0.04mg的Vit.C水溶液，使得料液质量比分别为1:3，加入0.2g Na₂S，用盐酸溶液调节PH为5，放入超声波清清洗仪中超声，设定超声功率320W、超声频率70KHz、超声温度40℃，超声时间45min；

⑻加入20ml丙酮，设定酶解温度为26℃，在180rpm磁力搅拌下振荡6.45h；

⑼按上述超声条件再次超声，用滤纸抽虑收集滤液，滤渣再用丙酮浸提两次，合并3次滤液后用旋转蒸发仪浓缩，温度为40℃，将浓缩液放入冻干机中冻干即可得到西兰花芽苗提取物粉末，提取物中有效成分莱菔硫烷的HPLC图谱见图1，莱菔硫烷标准品HPLC图谱见图2；

⑽将西兰花芽苗提取物粉末与辅料按1(粉末)：4(淀粉)：4(蔗糖)：1(微晶纤维素)比例，用30％酒精3mL为润湿剂制成颗粒，进行胶囊填充，即得西兰花芽苗提取物胶囊。

试验实施例1：单因素方法分析不同育苗条件对西兰花芽苗发芽过程的影响

具体试验步骤如下：

⑴将育苗盘表面杂质洗净，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡一个小时，然后冲洗干净，晾干备用；

⑵将西兰花种子放置于浸种袋里，将种子和水以1:3比例分别浸泡4、8、12h，在此期间更换两次水以保持种子的洁净，种子浸泡好后用纯水冲洗捞出沥干水备用；

⑶在消毒晒干后的育苗盘底平铺一层育苗纸，用喷壶打湿育苗纸，将西兰花种子均匀铺洒在育苗纸上，保持种子不重叠，铺好后再次用喷壶将种子和育苗纸喷湿；

⑷将洁净的纱布裁成比育苗盘大一些，用水润湿到不滴水后盖在铺满种子的育苗盘上，用夹子固定；

⑸放置于温度分别为20、25、30℃，相对湿度分别为30、50、70％的地方，保持空气流通，每天喷水1、3、5次，每次均为育苗纸湿润但是无积水，待出芽后去掉纱布见光生长3天；

⑹取生长3天新鲜的西兰花芽苗，经鼓风低温烘干后粉碎过60目筛。

⑺西兰花芽苗的提取过程条件和胶囊处方的制作同实施例1。

通过单因素实验证实西兰花芽苗菜最佳生长条件为:浸种时间为12h，环境温度为25℃、相对湿度为60％，每天喷水3次。

实施例2：响应面优化法分析不同提取条件对西兰花芽苗提取率的影响

选用Design-Expert 8.050b响应面分析软件，根据Box-behnken的中心组合为实验设计原理，通过单因素实验，最优取值点为中心，上下区域各取一个水平值作为响应面实验设计水平，选取西兰花芽苗提取物的提取率为响应值，选择对提取率有显著影响的三个因素：料液比(X1)为1:2、1:3、1:4；酶解温度(X2)为20、25、30℃；酶解时间(X3)为4、6、8h作三因素三水平的响应面分析试验。

具体试验步骤如下：

⑴西兰花芽苗的育苗过程条件同实施例1。

⑵取生长3天新鲜的西兰花芽苗，经鼓风低温烘干后粉碎过60目筛。

⑶精密称取20g提取物粉末于500mL烧杯中，加入0.04mg的Vit.C水溶液，使得料液比分别为1：2、1：3、1:4，加入0.2g Na₂S，用盐酸溶液调节PH为5，放入超声波清清洗仪中超声，设定超声功率320W、超声频率70KHz、超声温度40℃，超声时间45min；

⑷加入适量丙酮，设定酶解温度分别为20、25、30℃，在180rpm磁力搅拌下分别振荡4、6、8h；

⑸按上述超声条件再次超声，用滤纸抽虑收集滤液，滤渣再用丙酮浸提两次，合并3次滤液后用旋转蒸发仪浓缩，温度为40℃，将浓缩液放入冻干机中冻干即可得到西兰花芽苗提取物粉末；

⑹将西兰花芽苗提取物粉末与辅料按1(粉末)：4(淀粉)：4(蔗糖)：1(微晶纤维素)比例，用30％酒精3mL为润湿剂制成颗粒，进行胶囊填充，即得西兰花芽苗提取物胶囊。

响应面分析结果回归模型P＜0.0001，说明回归模型水平极显著；方程复相关系数的平方R2＝0.9755，说明该方程拟合度比较高，响应值的变化有97.55％来源于三个变量；模型预测的最佳条件为：料液比为1:2.94；酶解温度为26.38℃；酶解时间为6.28h；预测值最大提取率为17.57％；对最佳提取工艺条件进行三次重复验证试验，结果西兰花芽苗提取物的平均提取率为17.56±1.24％。

西兰花芽苗提取物胶囊的30d大鼠毒性试验

具体试验步骤如下：

⑴西兰花芽苗提取物胶囊颗粒由实施例1制备。实验所用动物为5～8周处于生长敏感期阶段的SPF级SD大鼠，体重200±20g，共30只,雌雄各半。雌雄分开饲养，每笼3只。根据预实验设定灌胃给药最低剂量为10mg/kg，中剂量为30mg/kg，高剂量为90mg/kg。药物均溶于1mL蒸馏水中。溶媒对照组为无主药并且经过制粒的辅料溶于1mL蒸馏水中。空白对照组为1mL蒸馏水。实验过程中保持饲养条件恒温恒湿，温度25±1.5℃,湿度50％。每天灌胃一次，动物进食、饮水自由，每天更换垫料一次，实验周期为30d。

⑵大鼠试验前适应性喂养7天，试验期间观察大鼠外观体征、腺体分泌、行为活动、摄食量、粪便、体重、给药后反应和死亡情况，每天记录一次。

⑶末次给药后撤食不撤水，12h后用7％水合氯醛麻醉腹主动脉取血，并且防止凝血。制备的血清按实验要求进行分样后，用全自动血液分析仪检测血液中的血常规指标。主要包括红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板计数(PLT)等血常规指标。

⑷取血后将血样放入高速离心机3000r/min离心10min，取上清液检测血清中天门冬氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、血糖(GLu)、总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、等血液生化学指标。

⑸大鼠处死后，剖取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、睾丸(附睾)、子宫、卵巢等主要脏器，精密称重，计算脏/体比值。

⑹取大鼠肝组织做HE染色进行病理学检查，方法如下。

用福尔马林固定后经石蜡包埋→使用显微切片并控制厚度在4～6mm→进行脱蜡水化→HE染色→梯度酒精脱水→二甲苯透明→中性树胶封固后，在光学显微镜下进行病理组织学观察，见图3。

⑺测定结果：通过30d的毒性试验，各组大鼠的一般活动均正常、毛色光亮、腺体分泌和进食饮水均正常，且未见到粪尿异常和改变。无一呈现给药后不良反应及死亡且和空白对照组比较无明显差异。西兰花芽苗提取物胶囊高中低剂量组对大鼠的体重和进食量均未见明显的影响，和对照组比较无显著性差异。大鼠血常规测定结果显示西兰花芽苗提取物高、中、低剂量组和溶媒对照组血液学指标无明显影响，与空白对照组比较无显著性差异，大鼠各组血液生化学各项指标水平均在正常范围内。西兰花芽苗提取物制剂对大鼠的脏体比值指标无明显影响，组织病理学检查结果，与对照组相比均无显著性差异，说明西兰花芽苗提取物对SD大鼠长期灌胃无毒性。

西兰花芽苗提取物胶囊的对A549人肺癌细胞的抑制作用研究：

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在活细胞中。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。采用MTT法检测A549人肺癌细胞的抑制率，具体试验步骤如下：

⑴西兰花芽苗提取物胶囊颗粒由实施例1制备。

⑵收集对数期细胞并调整细胞悬液浓度为5×105/mL，在96孔板上每孔加入100μL。边缘孔均用无菌的PBS填充。

⑶在CO2孵育箱中5％CO2，37℃条件下，培养24h至细胞单层铺满96孔板。

⑷将培养液弃去，设置6个复孔，加入2.5、5.0、10、20、40、80μg/mL浓度梯度的药物，每孔100μL。

⑸在CO₂孵育箱中5％CO2，37℃条件下，培养24h，倒置显微镜下观察细胞形态。

⑹每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。

⑺终止培养，小心的吸去孔内上清液。每孔加入150μL的DMSO，置摇床上低速振荡10min使结晶物充分溶解后，在酶联免疫检测490nm处测量各孔的吸光值，计算A549人肺癌细胞的抑制率。抑制率＝(1﹣实验孔OD值/阴性对照孔OD值)。

⑻测定结果：从MTT实验结果中可见，西兰花芽苗提取物对A549人肺癌细胞的生长抑制作用明显，随着西兰花芽苗提取物浓度的增加，西兰花芽苗提取物对A549人肺癌细胞的抑制作用逐渐增强，呈现浓度依赖性。用SPSS 11.5统计软件计算得出西兰花芽苗提取物的半数抑制浓度IC₅₀值为52.54μg/mL。当西兰花芽苗提取物浓度为80μg/mL时，对A549人肺癌细胞的抑制率达到最高61.92％。

Claims (9)

1.一种西兰花芽苗提取物胶囊的制备方法，其特征在于，所述包括以下步骤：

将西兰花芽苗提取物粉末、淀粉、蔗糖、微晶纤维素按照质量比1：4：4：1混合，用30％酒精3mL为润湿剂制成颗粒，进行胶囊填充，即得西兰花芽苗提取物胶囊。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述西兰花芽苗提取物粉末的制备方法，包括以下步骤：

A、取出芽3天的芽苗40℃烘干粉碎后过60目筛，得芽苗粉末；

B、取步骤A制备的芽苗粉末，混合维生素C，用去离子水调节料液质量比为1:2-4，加入Na₂S，调节pH为5，超声，使芽苗的细胞壁能充分破碎释放更多的芥子酶；得到混合溶液；

C、在步骤B所得混合溶液中加丙酮，震荡使其酶解；

D、经超声波振荡提取、抽滤、40℃旋转蒸发浓缩后，冻干机中冻干即可得到西兰花芽苗提取物粉末。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤B中，每20g芽苗粉末加入维生素C 0.04mg，加入Na₂S 0.2g。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤B中，调节pH的溶液为是磷酸缓冲液，PH为5.8。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述超声条件控制为：超声功率320W、超声频率70KHz、超声温度40℃，超声时间45min。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤C中，酶解温度为20-30℃，在180rpm磁力搅拌下振荡4-8h。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤A中所述芽苗的培养方法为：

(1)、将西兰花种子放置于浸种袋里，将种子和水以1:3质量比浸泡4-12h；有利于种子发芽；

(2)、在育苗盘的底部铺一层育苗纸，将浸泡好的种子均匀铺洒在育苗纸上，保持种子不重叠，遮盖苗床；以保护和促使西兰花芽苗生长；将洁净的纱布裁成比育苗盘大一些，用水润湿到不滴水，盖在铺满种子的育苗盘上，使种子避光正常发芽；

(3)、将育苗盘放置于温度为25℃与相对湿度为60％的环境中，保持空气流通，每天喷水3次，3天即可收获芽苗。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述育苗盘在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡1小时，冲洗干净后晾干。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中每次喷水量为：使育苗纸湿润但是无积水，以防止积水过多使种子根部腐烂，待出芽后去掉纱布见光生长3天即可得到西兰花芽苗。