CN104798616B - 基于褐飞虱蜜露的转基因抗除草剂水稻安全性的评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于褐飞虱蜜露的转基因抗除草剂水稻安全性的评价方法，包括以下步骤：收集比较样本水稻的褐飞虱蜜露；用载体分别吸收褐飞虱蜜露，然后将载体装入喂食容器中；将喂食容器放入试验箱中，将黑肩绿盲蝽成虫装入到试验箱中，定时检查黑肩绿盲蝽成虫的存活数，直到成虫死亡；将带有褐飞虱卵的稻茎放入喂食容器中，并将黑肩绿盲蝽雌成虫装入到试验箱中，24h后，解剖稻株；分析比较样本间黑肩绿盲蝽的成虫寿命以及捕食褐飞虱卵量的差异显著性。该方法在室内测定，易于控制，准确性高，周期性短，可以准确快速地研究取食转基因水稻的褐飞虱所分泌的蜜露对黑肩绿盲蝽的影响，可以为转基因水稻对天敌昆虫的安全性评价提供新的方法。

Description

基于褐飞虱蜜露的转基因抗除草剂水稻安全性的评价方法

技术领域

本发明属于转基因作物生态风险评价技术领域，具体涉及基于褐飞虱蜜露的转基因抗除草剂水稻安全性的评价方法，特别是基于褐飞虱蜜露的转基因抗除草剂水稻对捕食性天敌黑肩绿盲蝽安全性评价方法。

背景技术

褐飞虱Nilaparvata lugens (Stål)（Brown planthopper，简称BPH）是我国及许多亚洲国家当前水稻生产上的首要害虫。褐飞虱取食水稻后会排泄蜜露，蜜露排泄的多少与取食量成正比，取食越多，排泄的蜜露也相应增多，因此，褐飞虱蜜露排泄量常作为其对水稻致害性的指标，现也广泛应用于施用农药、肥料后，或气候变化后褐飞虱与水稻的互作关系研究上。

黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis Reuter是水稻害虫褐飞虱的重要天敌，在控制褐飞虱自然种群数量上发挥了很大作用。现有关转基因水稻对黑肩绿盲蝽的安全性评价的研究主要是在基因传递上和对黑肩绿盲蝽生物学特性的影响上，如转Bt（Bacillus thuringiensis，苏云金杆菌）基因水稻被褐飞虱取食后，黑肩绿盲蝽又取食褐飞虱卵，Bt基因在这一食物链中的传递；又如褐飞虱先取食转基因水稻，黑肩绿盲蝽再捕食在转基因水稻上生长发育的褐飞虱所产的卵，从而研究转基因水稻对黑肩绿盲蝽生物学特性的影响。现有资料中收集褐飞虱蜜露的是用膜将褐飞虱套在稻杆上，过一段时间再收集，每次收集到的蜜露很少，需在多根稻杆上套上膜，再将收集到的蜜露汇集，工序繁琐、效率低；另一方面，膜内常常有水蒸气，容易影响所收集的蜜露的纯度；稻杆竖着放置，收集的蜜露也容易漏出来。

褐飞虱取食水稻后，排泄的蜜露富含多种营养物质，天敌昆虫会取食褐飞虱蜜露，但是褐飞虱取食转基因水稻后分泌的蜜露对捕食性天敌黑肩绿盲蝽安全性评价，对于转基因抗除草剂水稻环境释放的生态风险评估也非常重要，目前还未见此类报道。

发明内容

本发明针对上述现状，提供了一种基于褐飞虱蜜露的转基因抗除草剂水稻安全性的评价方法，对黑肩绿盲蝽直接取食褐飞虱取食转基因水稻后分泌的蜜露对黑肩绿盲蝽寿命和捕食能力等方面的影响进行评价，从而更全面、科学的评价抗除草剂转基因水稻的生态安全性。

对此，本发明提供了一种基于褐飞虱蜜露的转基因抗除草剂水稻的环境安全性评价方法，包括以下步骤：

步骤S1：确定比较样本的水稻品种得到各比较样本，分别收集所述各比较样本水稻上饲养的褐飞虱分泌的蜜露，得到各比较样本水稻的褐飞虱蜜露；

步骤S2：用载体分别吸收比较样本水稻的褐飞虱蜜露，然后将吸收了褐飞虱蜜露的载体分别装入喂食容器中得到各比较样本褐飞虱蜜露的喂食容器，所述喂食容器的侧壁设有通孔；准备与样本数量相同的试验箱，将所述各比较样本褐飞虱蜜露的喂食容器分别放入各试验箱中；所述各试验箱包括两组，分别为第一组试验箱和第二组试验箱，第一组试验箱和第二组试验箱的设置相同；

步骤S3：将24 h内羽化的黑肩绿盲蝽成虫分别装入到所述步骤S2装有比较样本褐飞虱蜜露喂食容器的第一组试验箱中，定时检查黑肩绿盲蝽成虫的存活数，直到成虫死亡；

步骤S4：准备带有褐飞虱卵的各比较样本的水稻稻茎；将带有褐飞虱卵的各比较样本的水稻稻茎放入到所述步骤S2装有对应的比较样本褐飞虱蜜露喂食容器的第二组试验箱中，将24 h内羽化的黑肩绿盲蝽雌成虫也装入到所述第二组试验箱中，24h后，解剖稻株，得到褐飞虱卵被黑肩绿盲蝽捕食的数量；

步骤S5：分析比较取食了各比较样本褐飞虱蜜露的黑肩绿盲蝽的成虫寿命，以及褐飞虱卵捕食量的差异显著性，分析转基因抗除草剂水稻对黑肩绿盲蝽生物学特性和捕食能力的影响。

上述技术方案，将载体装入带孔的喂食容器内，可以避免虫与载体直接接触，减少了影响因素。如果用载体吸收稻株伤流液直接来喂虫子，虫子接触液体的面积大，容易沾湿翅膀、身体，影响实验效果。

作为本发明的进一步改进，所述比较样本水稻品种为三个，分别为转基因抗除草剂水稻、非转基因亲本对照水稻和非转基因感虫对照水稻。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S1中收集褐飞虱蜜露的方法为：将水稻稻杆放置在收集容器中，所述收集容器底部设有通孔，然后将褐飞虱放入所述收集容器中，用吸水透气材料片或膜覆盖收集容器的口部，从收集容器底部的通孔收集褐飞虱蜜露。所述吸水透气材料片或膜优选滤纸。采用此种方案，将褐飞虱放入后，便于集中收集褐飞虱蜜露，操作简单、效率高，且不容易漏出；采用滤纸覆盖收集容器的口部，减少了水蒸气的影响。

作为本发明的进一步改进，所述收集容器为漏斗形，所述收集容器的口部设有对称的凹槽，所述水稻稻杆水平放入到对称的凹槽中；所述收集容器在漏斗形的上部与倾斜部之间采用隔断物分开，所述隔断物上设有通孔。采用此技术方案，便于水稻稻杆的固定，避免褐飞虱跑出，同时又收集了蜜露。

作为本发明的进一步改进，所述水稻稻杆与凹槽之间设有所述水稻稻杆与凹槽之间设有棉花、棉球或者棉布中至少一种。即将所述将水稻稻杆放置在收集容器中时，先在所述凹槽内垫上棉花、棉球或者棉布，然后将水稻稻杆水平放入到收集容器对称的凹槽内；或者先在与凹槽对应的水稻稻杆的位置先用棉花、棉球或者棉布裹住稻杆，然后再水稻稻杆水平放入到收集容器对称的凹槽内。采用此技术方案，棉花、棉球或者棉布裹住凹槽内的稻杆，减少了对稻杆的挤压，同时能更好地固定水稻稻杆和密封收集容器，避免褐飞虱跑出。

作为本发明的进一步改进，所述收集容器的口部为方形。采用此技术方案，相对圆形口部的漏斗更容易固定稻杆，而且可以放长度相等的稻杆，实现定量收集。

作为本发明的进一步改进，所述隔断物为纱网。采用此技术方案，避免褐飞虱跑出，同时便于更好地收集褐飞虱蜜露。

作为本发明的进一步改进，步骤S2中，所述喂食容器为圆柱形中空管。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S3中，将24 h内羽化的黑肩绿盲蝽成虫装入到试验箱后，定时用胶头滴管给载体补充各比较样本的褐飞虱蜜露，保证载体湿润。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S4中，准备带有褐飞虱卵的各比较样本水稻稻茎的方法为，将怀卵褐飞虱雌虫分别在各比较样本的稻茎上产卵24h，得到带有褐飞虱卵的各比较样本的水稻稻茎。

作为本发明的进一步改进，还包括以蒸馏水代替褐飞虱蜜露喂食作为对照，重复步骤S2到步骤S5的步骤，即还包括：

将浸泡蒸馏水的载体，装入另外一个喂食容器中；将含有浸泡蒸馏水载体的喂食容器放入另外一个试验箱中，定时检查黑肩绿盲蝽成虫的存活数，直到成虫死亡；将带有褐飞虱卵的任一比较样本的水稻稻茎放入到所述装有浸泡蒸馏水载体喂食容器的试验箱中，将24h内羽化的黑肩绿盲蝽雌成虫也装入到试验箱中，24h后，解剖稻株，得到褐飞虱卵被黑肩绿盲蝽捕食的数量，将得到的数据作为对照数据。

作为本发明的进一步改进，所述黑肩绿盲蝽为室内用TN1水稻品种饲养的实验种群；所述褐飞虱为在TN1水稻上饲养一代后，再接入虫笼中的不同水稻品种或品系上饲养得到的种群。

作为本发明的进一步改进，所述载体为棉球、海绵或棉布中至少一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了基于褐飞虱蜜露的转基因抗除草剂水稻安全性的评价方法，特别是基于褐飞虱蜜露的转基因抗除草剂水稻对捕食性天敌黑肩绿盲蝽安全性评价方法，该方法从另外一个角度研究了褐飞虱取食转基因水稻后分泌的蜜露对捕食性天敌黑肩绿盲蝽的影响；该方法可在室内测定，使用更加方便，易于控制，准确性高，周期性短，可以为转基因水稻的环境释放对天敌昆虫是否安全提供新的评价方法。

附图说明

图1是本发明一种实施例褐飞虱蜜露收集容器的剖视结构示意图；

图2是本发明一种实施例褐飞虱蜜露收集容器的俯视图；

图3是本发明一种实施例的饲喂装置的结构示意图；

图4是本发明一种实施例的三种褐飞虱蜜露对黑肩绿盲蝽雌成虫寿命影响对比图；

图5是本发明一种实施例的三种褐飞虱蜜露对黑肩绿盲蝽雄成虫寿命影响对比图；

图6是本发明一种实施例的三种褐飞虱蜜露和蒸馏水对黑肩绿盲蝽捕食褐飞虱卵能力的影响对比图。

其中，CK：喂食蒸馏水的实验处理；

HTN1：喂食TN1水稻的褐飞虱排泄的蜜露的实验处理；

HD68：喂食D68水稻的褐飞虱排泄的蜜露的实验处理；

HBar68-1：喂食Bar68-1水稻的褐飞虱排泄的蜜露的实验处理；

图中，a，b，ab，bc，c表示差异性，相同字母表示两者差异不显著，不同字母表示差异显著。

具体实施方式

本发明提供了一种转基因抗除草剂水稻对黑肩绿盲蝽环境安全性的评价方法，具体实施方式为，包括以下步骤：

步骤S1：分别收集转基因抗除草剂水稻、非转基因亲本对照水稻和非转基因感虫对照水稻上饲养的褐飞虱分泌的蜜露，得到转基因抗除草剂水稻、非转基因亲本对照水稻和非转基因感虫对照水稻的褐飞虱蜜露；

步骤S2：用棉球分别吸收转基因抗除草剂水稻、非转基因亲本对照水稻和非转基因感虫对照水稻的褐飞虱蜜露，然后将吸收了褐飞虱蜜露的棉球分别装入三个喂食容器中，所述喂食容器的侧壁设有通孔；将三个喂食容器分别放入到三个试验箱中；

步骤S3：将24 h内羽化的黑肩绿盲蝽成虫分别装入到三个试验箱中，每6 h检查黑肩绿盲蝽成虫的存活数，直到成虫死亡；

步骤S4：将怀卵褐飞虱雌虫分别在转基因抗除草剂水稻Bar68-1、非转基因亲本对照水稻D68和非转基因感虫对照水稻TN1稻茎上产卵24h，得到带有褐飞虱卵的上述三种水稻稻茎；将这三种带有褐飞虱卵的水稻稻茎分别放入到步骤S2装有对应的比较样本的褐飞虱蜜露喂食容器的三个试验箱中，将24h内羽化的黑肩绿盲蝽雌成虫分别装入到这三个试验箱中，24h后，解剖稻株，得到褐飞虱卵被黑肩绿盲蝽捕食的数量；

步骤S5：比较采用转基因抗除草剂水稻的褐飞虱蜜露和非转基因亲本对照、非转基因感虫品种的褐飞虱蜜露喂食处理间，黑肩绿盲蝽的成虫寿命以及褐飞虱卵捕食量的差异显著性，分析转基因抗除草剂水稻对黑肩绿盲蝽生物学特性和捕食能力的影响。

另外，还包括以蒸馏水代替褐飞虱蜜露喂食作为对照，重复步骤S2到步骤S5的内容。

下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。

供试虫源：褐飞虱与黑肩绿盲蝽均为室内用TN1水稻品种饲养种群。其中，褐飞虱在TN1水稻上饲养一代后，再接入虫笼不同水稻材料上饲养，得到不同水稻材料上的褐飞虱种群。

供试水稻品种：抗除草剂转基因水稻“Bar68-1”为中国科学院亚热带农业生态研究所、湖南杂交水稻研究中心和香港中文大学共同培育的早籼稻，系用基因枪法将Bar 基因转入籼稻品种“D68”而得的抗草铵膦转基因水稻（Xiao G. Y. et al.，2007），非转基因亲本对照品种为“D68”，均由中国科学院亚热带农业生态研究所提供。感虫对照品种“TN1”由广西农业科学院植物保护研究所提供。

具体步骤为：

步骤S1：分别采用60日龄的转基因抗除草剂水稻“Bar68-1”、非转基因亲本对照水稻“D68”和非转基因感虫对照水稻“TN1” 稻杆喂食褐飞虱种群，然后收集褐飞虱蜜露，分别记为HBar68-1、 HD68和HTN1；

收集褐飞虱蜜露的具体方法为：如图1和图2所示，收集容器为漏斗形，其口部为方形，所述收集容器的口部设有对称的凹槽2，底部有通孔3，收集容器漏斗形的下部与上方用纱网5隔开；在进行收集褐飞虱蜜露时，将稻杆1的两端放入收集容器对称的凹槽2内，在将褐飞虱放入到收集容器中，在收集容器的口部用滤纸4覆盖住，减少水蒸气对收集容器内褐飞虱蜜露的影响；在收集容器的通孔3下部用杯子收集褐飞虱蜜露，这样既可以避免褐飞虱跑出，同时褐飞虱排泄的褐飞虱蜜露又可以从漏斗型底部的通孔流入杯子中，方便褐飞虱蜜露的收集； 采用此种方案，将褐飞虱放入后集中收集褐飞虱蜜露，操作简单、效率高，且不容易漏出。另外不同品种的水稻的褐飞虱蜜露可以同时在室内进行收集。

其中，优选的，在将稻杆1的两端放入收集容器对称的凹槽2内时，先在凹槽2内垫上棉花，将稻杆1的两端放入收集容器对称的凹槽2内时让棉花裹住凹槽2内的稻杆1部分，这样可以减少对稻杆1的挤压，同时能更好地密封和固定，避免褐飞虱跑出。

步骤S2：将棉球分别放入到HBar68-1、 HD68和HTN1的褐飞虱蜜露中浸泡，另外再放入棉球在蒸馏水中浸泡作为对照，以不滴水为原则，取出棉球，然后将吸收了 HBar68-1、HD68和HTN1的褐飞虱蜜露的棉球、以及蒸馏水的棉球分别装入四个喂食容器管21中，如图3所示，所述喂食容器管21的侧壁设有通孔22；将这四个喂食容器管21放入到四个试验箱23中；

步骤S3：将10头/箱的24 h内羽化的黑肩绿盲蝽成虫分别装入到四个试验箱中，并盖上试验箱盖24，所述试验箱盖24上也设有通孔25；每6 h检查黑肩绿盲蝽成虫的存活数，直到成虫死亡；期间为保证棉球湿润需及时用胶头滴管补充褐飞虱蜜露。上述试验每个处理（不同褐飞虱蜜露和蒸馏水对照）重复3次，即每个试验用黑肩绿盲蝽雌、雄成虫各30头，共60头成虫，4个处理共用黑肩绿盲蝽成虫240头。

步骤S4：以5头/根的数量将怀卵褐飞虱雌虫分别在转基因抗除草剂水稻Bar68-1、非转基因亲本对照D68和非转基因感虫品种TN1稻茎上产卵24h，得到带有褐飞虱卵的上述三种水稻稻茎；

将这三种带有足量褐飞虱卵的水稻稻茎以1根/管的数量分别放入步骤S2所述的装有HBar68-1、 HD68和HTN1的褐飞虱蜜露喂食容器的三个试验箱23中，然后以1头/箱的数量将24 h内羽化的黑肩绿盲蝽雌成虫分别装入到这三个试验箱23中，让其在箱内捕食不同水稻材料上的褐飞虱卵。24 h后，解剖稻株，得到褐飞虱卵被黑肩绿盲蝽捕食的数量。

另外准备两个装有蒸馏水棉球喂食容器的试验箱23，连同步骤S3的装有蒸馏水棉球喂食容器的试验箱23一共为三个装有蒸馏水棉球喂食容器的试验箱23，将上述三种带有褐飞虱卵的水稻稻茎按照水稻品种分别以1根/箱的数量放入三个装有蒸馏水棉球喂食容器的试验箱23中，然后以1头/箱的数量将24 h内羽化的黑肩绿盲蝽雌成虫分别装入这三个试验箱23中，让其在箱内捕食褐飞虱卵；24 h后，解剖稻株，得到褐飞虱卵被黑肩绿盲蝽捕食的数量。

上述试验一共六个处理，即：

处理A：试验箱内有产有Bar68-1褐飞虱种群卵块的Bar68-1稻秆，喂食容器内为浸有Bar68-1褐飞虱蜜露（即为Bar68-1褐飞虱种群取食Bar68-1后所分泌的蜜露，下同）的棉球；

处理B：试验箱内有产有D68褐飞虱种群卵块的D68稻秆，喂食容器内为浸有D68褐飞虱蜜露的棉球；

处理C：试验箱内有产有TN1褐飞虱种群卵块的TN1稻秆，喂食容器内为浸有TN1褐飞虱蜜露的棉球；

处理D：试验箱内有产有Bar68-1褐飞虱种群卵块的Bar68-1稻秆，喂食容器内为浸有蒸馏水的棉球；

处理E：试验箱内有产有D68褐飞虱种群卵块的D68稻秆，喂食容器内为浸有蒸馏水的棉球；

处理F：试验箱内有产有TN1褐飞虱种群卵块的TN1稻秆，喂食容器内为浸有蒸馏水的棉球。

上述每个处理重复10次，即每个水稻材料试验用黑肩绿盲蝽雌成虫10头、褐飞虱雌成虫50头，6个处理共用黑肩绿盲蝽雌成虫60头、褐飞虱雌成虫300头。

步骤S5：比较转基因抗除草剂水稻Bar68-1的褐飞虱蜜露、非转基因感虫对照水稻TN1的褐飞虱蜜露、非转基因亲本对照水稻D68的褐飞虱蜜露和蒸馏水空白对照处理间，黑肩绿盲蝽的雌、雄成虫寿命以及褐飞虱卵捕食量的差异显著性，分析转基因抗除草剂水稻对黑肩绿盲蝽生物学特性和捕食能力的影响。

本例的结果显示，如图4和图5示，黑肩绿盲蝽成虫取食HBar68-1、 HD68和HTN1的三种褐飞虱蜜露后，成虫寿命与蒸馏水对照组相比均显著延长。在HBar68-1、 HD68和HTN1三种不同水稻品种之间，黑肩绿盲蝽在取食褐飞虱蜜露后成虫寿命没有显著差异。

如图6所示，通过上述六个处理之间的对比可以发现，无论是否有褐飞虱蜜露的存在，黑肩绿盲蝽的捕食能力在三种水稻材料之间差异不明显。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.基于褐飞虱蜜露的转基因抗除草剂水稻安全性的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：确定比较样本的水稻品种得到各比较样本，分别收集所述各比较样本水稻上饲养的褐飞虱分泌的蜜露，得到各比较样本水稻的褐飞虱蜜露；

步骤S2：用载体分别吸收比较样本水稻的褐飞虱蜜露，然后将吸收了褐飞虱蜜露的载体分别装入喂食容器中得到各比较样本褐飞虱蜜露的喂食容器，所述喂食容器的侧壁设有通孔；准备与样本数量相同的试验箱，将所述各比较样本褐飞虱蜜露的喂食容器分别放入各试验箱中；所述各试验箱包括两组，分别为第一组试验箱和第二组试验箱，第一组试验箱和第二组试验箱的设置相同；

步骤S3：将24 h内羽化的黑肩绿盲蝽成虫分别装入到所述步骤S2装有比较样本褐飞虱蜜露喂食容器的第一组试验箱中，定时检查黑肩绿盲蝽成虫的存活数，直到成虫死亡；

步骤S4：准备带有褐飞虱卵的所述各比较样本的水稻稻茎；将带有褐飞虱卵的各比较样本的水稻稻茎放入到所述步骤S2装有对应的比较样本褐飞虱蜜露喂食容器的第二组试验箱中，将24h内羽化的黑肩绿盲蝽雌成虫也装入到所述第二组试验箱中，24h后，解剖稻株，得到褐飞虱卵被黑肩绿盲蝽捕食的数量；

步骤S5：分析比较取食了各比较样本褐飞虱蜜露的黑肩绿盲蝽的成虫寿命，以及黑肩绿盲蝽捕食褐飞虱卵量的差异显著性，分析转基因抗除草剂水稻对黑肩绿盲蝽生物学特性和捕食能力的影响。

2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：所述步骤S1中收集褐飞虱蜜露的方法，该方法将水稻稻杆放置在收集容器中，所述收集容器底部设有通孔，然后将褐飞虱放入所述收集容器中，用吸水透气材料片或膜覆盖收集容器的口部，从所述收集容器底部的通孔收集褐飞虱蜜露。

3.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于：所述收集容器为漏斗形，所述收集容器的口部设有对称的凹槽，所述水稻稻杆水平放入到对称的凹槽中；所述收集容器在漏斗形的上部与倾斜部之间采用隔断物分开，所述隔断物上设有通孔。

4.根据权利要求3所述的评价方法，其特征在于：所述水稻稻杆与凹槽之间设有棉花、棉球或者棉布中至少一种。

5.根据权利要求3所述的评价方法，其特征在于：所述隔断物为纱网。

6.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于：所述收集容器的口部为方形。

7.根据权利要求1~6任意一项所述的评价方法，其特征在于：步骤S2中，所述喂食容器为圆柱形中空管。

8.根据权利要求1~6任意一项所述的评价方法，其特征在于：还包括以蒸馏水代替褐飞虱蜜露喂食作为对照，重复所述步骤S2到步骤S5的步骤。

9.根据权利要求1~6任意一项所述的评价方法，其特征在于：所述黑肩绿盲蝽为室内用TN1水稻品种饲养的实验种群；所述褐飞虱为在TN1水稻上饲养一代后，再接入虫笼中的不同水稻材料上饲养得到的种群。

10.根据权利要求1~6任意一项所述的评价方法，其特征在于：所述载体为棉球、海绵或棉布中至少一种。