CN104789681A - 一种微小反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微小反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法，具体步骤包括在200μl的PCR管中配制微小反应体系、恒温检测反应和结果判断，结果判断时在PCR管中加入2μl荧光显色剂，混匀，阳性质粒显现为绿色，阴性质粒显现为橙色，且阳性质粒显现S型扩增曲线，阴性质粒显现直线扩增曲线，阳性质粒、阴性质粒在该微小反应体系水平上均实现正常扩增。本发明利用微小反应体系为恒温核酸扩增技术提供一种降低原料用量和成本的新途径，能极大地节省恒温核酸扩增所用原料，降低所需成本，从而极大地推动恒温核酸扩增技术在基础理论研究领域的推广和商业化应用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体是一种微小反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法。
背景技术
恒温核酸扩增技术是一种用于核酸快速扩增的新技术，具有快速简便、容易普及、安全可靠等优点；尤其在灵敏度、特异性和反应时间上更具有无语伦比的优点。但是，现有恒温核酸扩增技术所用原料量大、成本昂贵，极大地限制了恒温核酸扩增技术在基础理论研究领域的推广和商业化应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种原料用量少、成本低的微小反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法，具体步骤如下：以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种微小反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法，具体步骤如下：
1）在200μl的PCR管中配制微小反应体系：
引物液：0.36-1.44μl，反应液：3.04-12.16μl，DNA聚合酶：0.2-0.8μl，SYTO-9：0.2-0.8μl，待检DNA：0.2-4.8μl，用DNase/RNase-Free蒸馏水补齐到5-20μl；
2）恒温检测反应：设置阳性对照反应时，用含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于温度设置为60-65℃的PCR仪上反应45-90min，并在80℃下持续反应2min；
3）结果判断：在上述PCR管中加入2μl荧光显色剂，混匀，阳性质粒显现为绿色，阴性质粒显现为橙色，且阳性质粒显现S型扩增曲线，阴性质粒显现直线扩增曲线，阳性质粒、阴性质粒在该微小反应体系水平上均实现正常扩增。
作为本发明再进一步的方案：所述引物液包含50μM第一外引物、50μM第二外引物，50μM第一内引物、50μM第二内引物；
所述第一外引物为TAAGTATTTGGGAGAAGGGA；
第二外引物为AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA；
第一内引物为
CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA；
第二内引物为GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG；
所述反应液包含12mM的dNTP、等温扩增反应缓冲液、150mM的硫酸镁水溶液，dNTP、反应缓冲液体积比是8：5：2；
所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8U/μl；
所述核酸中阳性质粒为含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性质粒为不含目的基因的反应混合液；
所述荧光显色剂为SYTO-9。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用微小反应体系为恒温核酸扩增技术提供一种降低原料用量和成本的新途径，能极大地节省恒温核酸扩增所用原料，降低所需成本，从而极大地推动恒温核酸扩增技术在基础理论研究领域的推广和商业化应用。
附图说明
图1为本发明中实施例1的恒温实时荧光检测结果图。
图2为本发明中实施例2的恒温实时荧光检测结果图。
图3为本发明中实施例3的恒温实时荧光检测结果图。
图4为本发明中实施例4的恒温实时荧光检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
请参阅图1，本发明实施例中，一种20μl反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法，具体步骤如下：
1）在200μl的PCR管中配制微小反应体系：
引物液：1.44μl，反应液：12.16μl，DNA聚合酶：0.8μl，SYTO-9：0.8μl，待检DNA：3.2μl，用DNase/RNase-Free蒸馏水补齐到20μl；
2）恒温检测反应：设置阳性对照反应时，用含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于温度设置为65℃的PCR仪上反应90min，并在80℃下持续反应2min；
3）结果判断：在上述PCR管中加入2μl荧光显色剂，混匀，阳性质粒显现为绿色，阴性质粒显现为橙色，且阳性质粒显现S型扩增曲线，阴性质粒显现直线扩增曲线，阳性质粒、阴性质粒在该微小反应体系水平上均实现正常扩增。
所述引物液包含50μM第一外引物、50μM第二外引物，50μM第一内引物、50μM第二内引物；
所述第一外引物为TAAGTATTTGGGAGAAGGGA；
第二外引物为AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA；
第一内引物为
CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA；
第二内引物为GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG；
所述反应液包含12mM的dNTP、等温扩增反应缓冲液、150mM的硫酸镁水溶液，dNTP、反应缓冲液体积比是8：5：2；
所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8U/μl；
所述核酸中阳性质粒为含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性质粒为不含目的基因的反应混合液；
所述荧光显色剂为SYTO-9。
实施例2
请参阅图2，本发明实施例中，一种15μl反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法，具体步骤如下：
1）在200μl的PCR管中配制微小反应体系：
引物液：1.08μl，反应液：9.12μl，DNA聚合酶：0.6μl，SYTO-9：0.6μl，待检DNA：2.4μl，用DNase/RNase-Free蒸馏水补齐到15μl；
2）恒温检测反应：设置阳性对照反应时，用含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于温度设置为64℃的PCR仪上反应70min，并在80℃下持续反应2min；
3）结果判断：在上述PCR管中加入2μl荧光显色剂，混匀，阳性质粒显现为绿色，阴性质粒显现为橙色，且阳性质粒显现S型扩增曲线，阴性质粒显现直线扩增曲线，阳性质粒、阴性质粒在该微小反应体系水平上均实现正常扩增。
所述引物液包含50μM第一外引物、50μM第二外引物，50μM第一内引物、50μM第二内引物；
所述第一外引物为TAAGTATTTGGGAGAAGGGA；
第二外引物为AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA；
第一内引物为
CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA；
第二内引物为GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG；
所述反应液包含12mM的dNTP、等温扩增反应缓冲液、150mM的硫酸镁水溶液，dNTP、反应缓冲液体积比是8：5：2；
所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8U/μl；
所述核酸中阳性质粒为含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性质粒为不含目的基因的反应混合液；
所述荧光显色剂为SYTO-9。
实施例3
请参阅图3，本发明实施例中，一种10μl反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法，具体步骤如下：
1）在200μl的PCR管中配制微小反应体系：
引物液：0.72μl，反应液：6.08μl，DNA聚合酶：0.4μl，SYTO-9：0.4μl，待检DNA：1.6μl，用DNase/RNase-Free蒸馏水补齐到10μl；
2）恒温检测反应：设置阳性对照反应时，用含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于温度设置为62℃的PCR仪上反应60min，并在80℃下持续反应2min；
3）结果判断：在上述PCR管中加入2μl荧光显色剂，混匀，阳性质粒显现为绿色，阴性质粒显现为橙色，且阳性质粒显现S型扩增曲线，阴性质粒显现直线扩增曲线，阳性质粒、阴性质粒在该微小反应体系水平上均实现正常扩增。
所述引物液包含50μM第一外引物、50μM第二外引物，50μM第一内引物、50μM第二内引物；
所述第一外引物为TAAGTATTTGGGAGAAGGGA；
第二外引物为AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA；
第一内引物为
CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA；
第二内引物为GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG；
所述反应液包含12mM的dNTP、等温扩增反应缓冲液、150mM的硫酸镁水溶液，dNTP、反应缓冲液体积比是8：5：2；
所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8U/μl；
所述核酸中阳性质粒为含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性质粒为不含目的基因的反应混合液；
所述荧光显色剂为SYTO-9。
实施例4
请参阅图4，本发明实施例中，一种5μl反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法，具体步骤如下：
1）在200μl的PCR管中配制微小反应体系：
引物液：0.36μl，反应液：3.04μl，DNA聚合酶：0.2μl，SYTO-9：0.2μl，待检DNA：0.8μl，用DNase/RNase-Free蒸馏水补齐到5μl；
2）恒温检测反应：设置阳性对照反应时，用含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于温度设置为60℃的PCR仪上反应45min，并在80℃下持续反应2min；
3）结果判断：在上述PCR管中加入2μl荧光显色剂，混匀，阳性质粒显现为绿色，阴性质粒显现为橙色，且阳性质粒显现S型扩增曲线，阴性质粒显现直线扩增曲线，阳性质粒、阴性质粒在该微小反应体系水平上均实现正常扩增。
所述引物液包含50μM第一外引物、50μM第二外引物，50μM第一内引物、50μM第二内引物；
所述第一外引物为TAAGTATTTGGGAGAAGGGA；
第二外引物为AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA；
第一内引物为
CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA；
第二内引物为GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG；
所述反应液包含12mM的dNTP、等温扩增反应缓冲液、150mM的硫酸镁水溶液，dNTP、反应缓冲液体积比是8：5：2；
所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8U/μl；
所述核酸中阳性质粒为含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性质粒为不含目的基因的反应混合液；
所述荧光显色剂为SYTO-9。
本发明利用微小反应体系为恒温核酸扩增技术提供一种降低原料用量和成本的新途径，能极大地节省恒温核酸扩增所用原料，降低所需成本，从而极大地推动恒温核酸扩增技术在基础理论研究领域的推广和商业化应用。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (2)
1.一种微小反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）在200μl的PCR管中配制微小反应体系：
引物液：0.36-1.44μl，反应液：3.04-12.16μl，DNA聚合酶：0.2-0.8μl，SYTO-9：0.2-0.8μl，待检DNA：0.2-4.8μl，用DNase/RNase-Free蒸馏水补齐到5-20μl；
2）恒温检测反应：设置阳性对照反应时，用含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于温度设置为60-65℃的PCR仪上反应45-90min，并在80℃下持续反应2min；
3）结果判断：在上述PCR管中加入2μl荧光显色剂，混匀，阳性质粒显现为绿色，阴性质粒显现为橙色，且阳性质粒显现S型扩增曲线，阴性质粒显现直线扩增曲线，阳性质粒、阴性质粒在该微小反应体系水平上均实现正常扩增。
2.根据权利要求1所述的微小反应体系水平上的核酸恒温扩增检测方法，其特征在于，所述引物液包含50μM第一外引物、50μM第二外引物，50μM第一内引物、50μM第二内引物；
所述第一外引物为TAAGTATTTGGGAGAAGGGA；
第二外引物为AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA；
第一内引物为
CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA；
第二内引物为GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG；
所述反应液包含12mM的dNTP、等温扩增反应缓冲液、150mM的硫酸镁水溶液，dNTP、反应缓冲液体积比是8：5：2；
所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8U/μl；
所述核酸中阳性质粒为含有目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性质粒为不含目的基因的反应混合液；
所述荧光显色剂为SYTO-9。
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