CN104774934B - 一种鉴定周麦23号小麦品种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于小麦种质资源品种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定周麦23号小麦品种的方法。该方法包括提取DNA、以Xcwm65为引物序列，PCR扩增、电泳、显色、带型统计、对比判定等步骤。本发明利用SSR技术，通过对小麦21条染色体上的340个SSR引物进行筛选，确认Xcwm65引物序列针对周麦23号小麦品种具有较好的特异性，可以用于周麦23号品种的检测、鉴定。总体而言，本发明技术成熟，快速、简便、准确度较高，能够较为便捷、有效的鉴定出周麦23号品种，有利于新品种推广和种质资源保护，同时也为其他小麦品种的推广利用和保护提供了较好的应用借鉴。

Description

一种鉴定周麦23号小麦品种的方法
技术领域
本发明属于小麦种质资源品种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定周麦23号小麦品种的方法。
背景技术
小麦是我国最重要的粮食作物之一，年种植面积比较稳定，常年在3.6亿亩上下浮动，年需求小麦良种90亿斤左右。随着优良新品种的不断出现和种子商业化水平的提高，我国小麦品种更换越来越快，农民每年购买良种率也在不断提高，每年需求小麦良种约50亿斤，并且换种率在不断提高。商业价值的存在致使很多经营玉米杂交种的企业开始经营小麦良种，造成企业对小麦品种权激烈竞争，没有品种权的企业为获得高额利润，侵权假冒现象泛滥，假包装、随意更换品种名字等现象在市场上普遍存在，伪劣假冒种子伤农害农现象屡次发生，严重影响农民购买良种，也影响到育种家的利益，遏制了育种家创新的动力，影响我国种业的健康快速发展。为保护小麦新品种权，给维权打假工作提供有效证据，亟待需要准确、快速、简便、稳定的品种鉴定方法。
通过籽粒、幼苗和植株等性状的表型鉴定需要经验丰富的专家进行，而且往往存在时间较长、易受人为因素影响等问题，法院不易采用；采用苯酚染色法、氢氧化钠测定法等化学鉴定方法往往存在受种子发育程度、环境条件等制约，鉴定不同的品种准确度不高；采用醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺电泳法等蛋白标记鉴定小麦品种真实性往往存在条带较多、受种植环境条件制约，对亲缘关系较近的品种之间鉴定有较大的困难；又因小麦基因组相对较大、且80%都是重复序列，进行单个品种的全基因组测序存在技术复杂、耗时较长、测序费用多等诸多问题，基层育种单位和种子企业往往无法进行。以上技术特点决定了针对不同小麦品种往往难以采用统一的鉴定方法。
现有技术中，分子标记（包括RAPD、RFLP、SSR和RGAP）技术在小麦基因组的研究中得到了广泛应用。其中SSR技术具有共显性、高多态性、容易检测和重验性好等优点，并且成本低，是一种较为理想的分子标记方法，目前己广泛用于群体遗传结构和遗传多样性分析、亲缘关系的比较和鉴定、物种的进化和系统发生研究、构建基因连锁图谱进行功能基因定位和QTL分析等方面。因此，根据分子标记技术特点，如果能够利用分子标记技术筛选出该针对小麦品种的1个或几个特异引物，而这些引物能够真实反应该品种的基因型信息，因而即可利用针对该小麦品种的特异性引物用于小麦品种的鉴定工作。另外考虑到SSR技术的准确、快速、简便、稳定等特点，采用该方法可为特定小麦品种的维权打假工作提供有效证据，利于相关品种保护和其他工作开展。需要强调的是，由于小麦属于自花授粉作物，且具有特殊的地域性，在不同的生态区可推广的审定品种数量有限，品种特性固定，这又为此方法在特定品种鉴定中提高了准确性，因而是具有较好的应用意义的。
发明内容
本发明目的是提供一种利用SSR技术针对小麦品种周麦23号的鉴定方法，该方法采用能够较好的表达黄淮麦区小麦品种的特异性Xcwm65，利用该引物可为周麦23号小麦品种的快速、准确的检测、鉴定提供较好的保障。
本发明所采取的主要技术方案如下。
一种鉴定周麦23号小麦品种的方法，包括以下步骤：
（1）采用单籽粒DNA提取法，分别对周麦23号小麦和待测小麦种子提取DNA；
（2）以步骤（1）中提取的周麦23号小麦和待测小麦种子的DNA为模板，以Xcwm65为引物序列，分别进行PCR扩增；
所述Xcwm65为引物序列为：
上游序列TCATTGGTGTCATCCCTCGTGT；
下游序列GAATAATGCCTTGACCCTGGAC；
15 µL PCR扩增反应体系设置如下：
2×Taq PCR Mix (含Taq酶 0.1 U/µL、dNTPs 500 µmol/L、Tris-HCl 20 mmol/L、KCl 100 mmol/L、MgCl2 3 mmol/L) 7.5 µL，
引物Xcwm65（10 µmol/L），上游序列、下游序列各1 µL，
步骤（1）提取的DNA模板，1.5 µL，
超纯水4 µL；
PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7 min；PCR扩增产物置于4℃保存备用；
（3）对步骤（2）中PCR扩增产物进行电泳，电泳前，加入指示剂，以步骤（2）中15µLPCR扩增产物为例，加入3μL变性上样指示剂；94℃变性10min后，立即放入冰水混合物中冷却10min；然后取处理后的样品6.5μL在质量浓度为6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色；
所述变性上样指示剂组分为：98％无离子甲酰胺、10mM EDTA pH8.0，0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青；
（4）对步骤（3）显色后样品进行带型统计，对比判定，如果待测小麦种子的PCR扩增样品电泳结果与周麦23号小麦的PCR扩增样品结果带型一致，表明待测小麦种子为周麦23号品种，如果不一致，则表明待测小麦种子非周麦23号品种。
本发明利用SSR技术，通过对小麦21条染色体上的340个SSR引物进行筛选，确认Xcwm65引物序列针对周麦23号小麦品种具有较好的特异性，可以用于周麦23号品种的检测、鉴定。总体而言，本发明技术成熟，快速、简便、准确度较高，能够较为便捷、有效的鉴定出周麦23号品种，有利于新品种推广和种质资源保护，同时也为其他小麦品种的推广利用和保护提供了较好的应用借鉴。
附图说明
图1为初次筛选特异性引物过程中未经处理的部分引物电泳图；其中，第三泳道为周麦13号，第五泳道为新麦9号，第六泳道为周麦23号；
图2为初次筛选特异性引物过程中未经处理的部分引物电泳图；其中第一泳道为周麦13号，第二泳道为新麦9号，第三泳道为周麦23号；
图3为二次筛选过程中针对特异引物Xcwm65的电泳对比图，其中从左到右分别是Marker、A组（A1—A7）、B组（B1—B15）、C组（C1—C14）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明，具体介绍实施例前，对本发明所涉及的部分小麦品种来源和主要应用试剂简要介绍如下。
周麦23号小麦品种及其他小麦供试材料均由周口市农科院小麦研究所提供或由市场购得；
Xcwm65及其他引物序列均由上海生工生物有限公司合成提供；
2×Taq PCR Mix购于北京汇天东方科技有限公司；
PCR反应在BIO-RAD S1000- PCR仪（美国伯乐公司）上运行。
实施例
由于本发明的难点及关键点在于针对周麦23号小麦品种的特异性引物序列Xcwm65的筛选获得，因此本实施例对于该引物序列的筛选过程简要介绍如下。
一、特异性引物序列的初步筛选
初步筛选过程包括如下步骤：
1、SSR引物选择
SSR引物选用覆盖小麦21条染色体的340对简单重复序列（simple sequencerepeat，SSR）引物，包括BARC、CFA、CFD、GDM，WMC系列的SSR引物及CWM、KSUM、CWEM、SWES，和CNL系列的EST-SSR引物。引物序列信息在GrainGenes2.0 (http://wheat.pw.usda.gov/)查阅获得。
相关引物序列均由上海生工生物有限公司合成提供。
2、DNA提取、PCR扩增及扩增产物的电泳
以周麦23号及其亲本周麦13号、新麦9号为检测材料进行引物的初步筛选，具体步骤如下：
（1）采用单籽粒DNA提取法，分别对每个品种的小麦种子提取DNA；
（2）以步骤（1）中提取的小麦种子的DNA为模板，分别以步骤1中的SSR引物为引物序列，分别进行PCR扩增；
15 µL PCR扩增反应体系设置如下：
2×Taq PCR Mix (含Taq酶 0.1 U/µL、dNTPs 500 µmol/L、Tris-HCl 20 mmol/L、KCl 100 mmol/L、MgCl2 3 mmol/L) 7.5 µL，
引物（10 µmol/L），上游序列、下游序列各1 µL，
步骤（1）提取的DNA模板，1.5 µL，
超纯水4 µL；
PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7 min；PCR扩增产物置于4℃保存备用；
（3）电泳，电泳前，加入指示剂，以步骤（2）中15µL PCR扩增产物为例，加入3μL变性上样指示剂；94℃变性10min后，立即放入冰水混合物中冷却10min；然后取处理后的样品6.5μL在质量浓度为6%的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色；
所述变性上样指示剂组分为：98％无离子甲酰胺、10mM EDTA pH8.0，0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青；
（4）对步骤（3）显色后样品进行带型统计，最终根据电泳结果，筛选出PCR扩增的周麦23号的带型与其亲本周麦13号和新麦9号均不相同的引物对。
筛选结果表明，周麦23号的带型与其亲本周麦13号和新麦9号均不相同的引物对有7个，具体如下表所示，初步电泳图如图1和图2所示。
二、特异性引物序列的二次筛选
由于初步筛选所得到的周麦23号品种的特异性引物数量相对较多，因而并不适合直接用于小麦品种的鉴定、筛选工作，因此尚需进一步的筛选。
二次筛选过程中，发明人以周麦23号的标准种子（国家种质资源库植物新品种权保护种子）及其6个姊妹系，周麦23号的衍生新品种（系）15个和目前黄淮麦区的主推品种14个共36份材料为基础，对初步筛选出来的7对引物进行了进一步特异性引物筛选。简要介绍如下。
从中筛选出的特异引物再对周麦23号衍生的新品种（B组材料），以及外观长相与周麦23号差异较大的黄淮麦区主推品种（C组材料）进行检测验证。
（1）筛选过程中所用小麦品种
具体所用小麦品种情况如下表所示，其中6个姊妹系标记为A组材料（A2~A7），衍生新品种标记为B组材料（B1~B15），外观长相与周麦23号差异较大的黄淮麦区主推品种标记为C组材料（C1~C14）。
（2）对小麦基因组DNA提取、PCR扩增及扩增样品的电泳方法同初步筛选。
筛选时，先对周麦23号（A1）和与周麦23号外观长相极其相似的姊妹系（A组材料）进行筛选，因为姊妹系在表型性状上与周麦23号标准种子非常相似，一般的育种家也不易辨别真伪，往往需要经验丰富的专家才能进行表型鉴定，而且存在时间较长、易受人为因素影响等问题。因此，在姊妹系中筛选出某小麦品种特异标记就有着非常重要的意义。
从姊妹系中筛选出的特异引物再对周麦23号衍生新品种（B组材料），以及外观长相与周麦23号差异较大的黄淮麦区主推品种（C组材料）进行检测验证。
B组材料是周麦23号的衍生后代，是以周麦23号为亲本的，因此，B组材料只继承了周麦23号的部分遗传物质，同时与另一个或多个亲本的部分遗传物质进行了重组。在对它们检测验证时，如果筛选出标记是Genomic-SRR（简单重复序列），则要选衍生后代中与周麦23号不同的标记；如果筛选出标记是EST-SSR（表达序列标签），则在衍生后代中，就可能会有与周麦23号相同的，此发明所筛选出的特异标记类型就是EST-SSR，它所表达的片段是有功能的，属于功能性标记，正是继承了亲本某性状的遗传物质的表现。
C组材料品种是目前在黄淮麦区大面积推广的品种，它们的表型性状与周麦23号差异较大，表型鉴定也能辨别出是哪个品种，从遗传角度看，一般表型差异较大的品种，其遗传物质差异也较大。因此，周麦23号与C组材料的任一个品种都是不同的，也就初步判定引物标记Xcwm65可以作为周麦23号的特异标记，用于检测周麦23号的真伪。
综上所述，结合最终的针对特异引物Xcwm65的电泳对比图（如图3所示），可以看出，引物Xcwm65具有较好的特异性，适于用于筛选鉴定周麦23号小麦品种。

Claims (4)

1.一种鉴定周麦23号小麦品种的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）采用单籽粒DNA提取法，分别对周麦23号小麦和待测小麦种子提取DNA；
（2）以步骤（1）中提取的周麦23号小麦和待测小麦种子的DNA为模板，以Xcwm65为引物序列，分别进行PCR扩增；
所述Xcwm65引物序列为：
上游序列，TCATTGGTGTCATCCCTCGTGT；
下游序列，GAATAATGCCTTGACCCTGGAC；
（3）对步骤（2）所得PCR扩增产物进行电泳，电泳前，加入指示剂，电泳结束后显色；
（4）对步骤（3）所得显色后样品进行带型统计，对比判定，如果待测小麦种子的PCR扩增样品电泳结果与周麦23号小麦的PCR扩增样品结果带型一致，表明待测小麦种子为周麦23号品种；如果不一致，则表明待测小麦种子非周麦23号品种。
2.如权利要求1所述鉴定周麦23号小麦品种的方法，其特征在于，步骤（2）中PCR扩增反应设置如下：
15 µL PCR扩增反应体系设置如下：
2×Taq PCR Mix 7.5 µL，其中包含：Taq酶 0.1 U/µL、dNTPs 500 µmol/L、Tris-HCl20 mmol/L、KCl 100 mmol/L、MgCl2 3 mmol/L；
引物Xcwm65以10 µmol/L计，上游序列、下游序列各1 µL，
步骤（1）提取的DNA模板，1.5 µL，
超纯水4 µL；
PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸7 min；PCR扩增产物置于4℃保存备用。
3.如权利要求1所述鉴定周麦23号小麦品种的方法，其特征在于，步骤（3）中所述指示剂为变性上样指示剂，所述变性上样指示剂组分为：98％无离子甲酰胺、10mM EDTA pH8.0、0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青。
4.如权利要求3所述鉴定周麦23号小麦品种的方法，其特征在于，所述步骤（3）具体为：取步骤（2）所得15µL PCR扩增产物，加入3μL变性上样指示剂；94℃变性10min后，立即放入冰水混合物中冷却10min；然后取处理后的样品6.5μL在质量浓度为6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。
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