CN104771411B - 五缺位铁双七钨磷氧簇化合物的医药新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及五缺位铁双七钨磷氧簇化合物的医药新用途。该化合物具有以下的阴离子化合物单元，阴离子化合物单元的化学式为：[Fe(HPW₇O₂₈)₂]^12‑；本专利公开了该化合物具有良好的抗肿瘤活性。

Description

五缺位铁双七钨磷氧簇化合物的医药新用途

技术领域

本发明涉及五缺位铁双七钨磷氧簇化合物的医药新用途。

背景技术

多金属氧酸盐(POMS)以其丰富多彩的结构以及其自身的优良分子特性，包括极性、氧化还原电位、表面电荷分布、形态及酸性，使其在很多领域，尤其是材料、催化、药物等方面具有广泛的应用前景。

申请人申请的中国发明专利(申请号：201210568121.1申请日：2012-12-24)公开了五缺位铁双七钨磷氧簇化合物，该化合物具有以下的阴离子化合物单元，阴离子化合物单元的化学式为：[Fe(HPW₇O₂₈)₂]^12-；并且所述的Fe、P、W、O具有以下的结构式：

该专利还公开了该化合物具有潜在的抗肿瘤、抗病毒活性。同时，该化合物在催化剂和分子基光、电、磁性材料等方面也具有潜在的应用。但是该专利未明确该化合物具有何种抗肿瘤活性。

发明内容

本发明的第一个目的是提供铁双七钨磷氧簇化合物用于制备治疗肉瘤药物的应用；该化合物具有以下的阴离子化合物单元，阴离子化合物单元的化学式为：[Fe(HPW₇O₂₈)₂]^12-；并且所述的Fe、P、W、O具有以下的结构式：

本发明的第二个目的是提供铁双七钨磷氧簇化合物用于制备治疗慢性骨髓性白血病药物的应用。

本发明的第三个目的是提供铁双七钨磷氧簇化合物用于制备治疗子宫颈癌药物的应用。

本发明的第四个目的是提供铁双七钨磷氧簇化合物用于制备治疗卵巢癌粘液性癌药物的应用。

附图说明

图1为铁七钨磷氧簇合物Na₁₂H[Fe(HPW₇O₂₈)₂]·44H₂O(IHTPO)的化学结构式(a)IHTPO球棍模型(b)IHTPO多面体模型。

图2为IHTPO对荷S180肉瘤小鼠脾细胞增殖反应的影响。

图3为IHTPO对荷S180肉瘤小鼠自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的影响。

图4为IHTPO对荷S180肉瘤小鼠脾细胞分泌γ-干扰素(IFN-γ)和白介素2(IL-2)能力的影响。

图5为IHTPO对荷S180肉瘤小鼠脾细胞GAPDH、细胞因子和转录因子mRNA表达的影响。

图6为IHTPO对荷S180肉瘤小鼠血清特异性抗体效价的影响。

图7为铁双七钨磷氧簇Na₁₂H[Fe(HPW₇O₂₈)₂]·44H₂O浓度25–500μM时，体外对K562、HeLa等肿瘤细胞增殖呈显著的浓度依赖性抑制作用图。

具体实施方式

实施例1

1实验方法

1.1分组和给药

取传代6d的腹水型S180瘤株小鼠，于无菌条件下颈椎脱臼处死后，常规消毒取腹水，用无菌生理盐水按1:4制成S180细胞悬液。每只小鼠左前肢腋下接种该细胞悬液0.2mL。接种瘤液24h后，称重并将小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半。设为荷瘤对照组、环磷酰胺阳性对照组及铁双七钨磷氧簇Na₁₂H[Fe(HPW₇O₂₈)₂]·44H₂O低、中、高3个剂量实验组(60mg/kg、80mg/kg和120mg/kg)。正常组和荷瘤对照组每日按0.2mL/10g经口灌服生理盐水，连续10天，阳性对照组按50mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺(CTX)，每日一次，连续2天；Fe(PW₇)₂低、中、高三个剂量组按0.2mL/10g分别灌胃给予不同浓度的药液，每天一次，连续10天。末次给药24h后，称体重，股动脉取血，制备血清；颈椎脱臼处死动物，无菌条件下取脾脏，制备脾细胞悬液；取瘤组织并称重，计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。

体内腹腔注射60、80、120mg/kg给药能显著抑制小鼠移植性S180肉瘤生长，抑瘤率分别为27.39％、34.40％和43.37％。同时，Na₁₂H[Fe(HPW₇O₂₈)₂]·44H₂O可显著促进荷瘤小鼠T、B淋巴细胞增殖反应，以及增强NK细胞和CTL细胞活性。

如图2所示，荷S180肉瘤小鼠以40,60和80mg/kg的计量腹腔注射IHTPO 8天，或以每天一次50mg/kg的计量腹腔注射CTX 2天，对照组用生理盐水注射相同计量。第9天开始，脾细胞用Con A,LPS或RPMI-1640培养基培养48小时。脾细胞增殖用MTT法测量并以刺激指数(SI)来说明，数据以平均值±标准偏差(n＝10)的形式体现。^aP<0.05和^bP<0.01vs荷瘤对照组(MC)。CTX:环磷酰胺(阳性对照)。

如图3所示，荷S180肉瘤小鼠以40,60和80mg/kg的计量腹腔注射IHTPO 8天，或以每天一次50mg/kg的计量腹腔注射CTX 2天，对照组用生理盐水注射相同计量。第9天，脾细胞采用MTT法制备和测量以用于自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的测量。数据以平均值±标准偏差(n＝10)的形式体现。^aP<0.05、^bP<0.01和^cP<0.001vs荷瘤对照组(MC)。CTX:环磷酰胺(阳性对照)。

如图4所示，荷S180肉瘤小鼠以40,60和80mg/kg的计量腹腔注射IHTPO 8天，或以每天一次50mg/kg的计量腹腔注射CTX 2天，对照组用生理盐水注射相同计量。第9天开始，脾细胞用Con A培养基培养48小时，培养上清液中γ-干扰素(IFN-γ)和白介素2(IL-2)的含量用ELISA试剂盒来测量，数据以平均值±标准偏差(n＝10)的形式体现。^aP<0.05、^bP<0.01和^cP<0.001vs荷瘤对照组(MC)。CTX:环磷酰胺(阳性对照)。

如图5所示，荷S180肉瘤小鼠以40,60和80mg/kg的计量腹腔注射IHTPO 8天，或以每天一次50mg/kg的计量腹腔注射CTX 2天，对照组用生理盐水注射相同计量。第9天开始，GAPDH、细胞因子IFN-γ和IL-2以及T-bet和SATA-4转录因子的mRNA表达能力使用特异性引物以RT-PCR检测技术来测定，使用持家基因GAPDH作为内标，基因扩增在1.5％(w/v)琼脂糖凝胶中进行并用goldview染色，图示为三个独立实验的代表性结果。M道为DNA标记，1道为对照组，2道为环磷酰胺，3道为40mg/kg IHTPO，4道为60mg/kg IHTPO，5道为80mg/kgIHTPO。数据以平均值±标准偏差(n＝3)的形式体现，^aP<0.05、^bP<0.01和^cP<0.001vs荷瘤对照组(MC)。

如图6所示，荷S180肉瘤小鼠以40,60和80mg/kg的计量腹腔注射IHTPO 8天，或以每天一次50mg/kg的计量腹腔注射CTX 2天，对照组用生理盐水注射相同计量。第9天开始，收集血清并用间接ELISA法测量血清特异性IgG,IgG2a和IgG2b抗体效价，数据以平均值±标准偏差(n＝10)的形式体现。^aP<0.05、^bP<0.01和^cP<0.001vs荷瘤对照组(MC)。CTX:环磷酰胺(阳性对照)。

1.2脾细胞增殖反应

1.2.1脾细胞悬液制备末次给药24h后，断颈处死小鼠，无菌条件下取小鼠的脾脏，加入Hank’s液7mL，研磨，以200目不锈钢筛网滤过，1500r/min离心5min，弃上清，加Hank’s液7mL，蜗旋，1500r/min离心5min，重复洗涤2次。收集脾细胞，加适量RPMI 1640完全培养液混悬，以台盼兰拒染法计数，活细胞数不少于95％，加RPMI 1640完全培养液稀释，调整细胞至适宜浓度。

1.2.2淋巴细胞增殖反应于96孔微量板中，每孔加脾细胞悬液100μL，每个脾细胞样品重复12孔，分别加Con A液(终浓度为5μg/mL)、LPS液(终浓度为10μg/mL)或RPMI 1640培养液至总体积为200μL，重复4孔。另设培养液空白对照组。37℃、5％CO₂培养44h后，各孔加MTT溶液(2mg/mL)50μL，继续培养4h。1800r/min离心5min，弃去各孔上清，分别加酸性DMSO溶液150μL，振荡，于室温暗处放置15min，以酶标仪于波长570nm处测定OD值，并计算刺激指数(SI值)。

1.3自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性测定

1.3.1靶细胞的制备分别取指数生长期的人红白血病K562细胞和小鼠S180细胞，以PBS液洗3次，加RPMI 1640完全培养液稀释制成浓度为1.0×10⁵个/ml的细胞悬液。

1.3.2效应细胞的制备按1.1.1方法制备1×10⁷个/mL的脾细胞悬液，作为效应细胞。

1.3.3细胞毒性试验于96孔细胞培养板上，每孔加脾细胞悬液(1×10⁷个/ml)100μL，重复12孔。4孔分别加RPMI 1640完全培养液100μL作为效应细胞对照；4孔加K562靶细胞悬液(2×10⁵个/mL)100μL，4孔加S180细胞悬液(1.0×10⁵个/mL)100μL，作为实验孔。同时，设立靶细胞对照组(每孔加2×10⁵个/mL靶细胞悬液100μL和RPMI 1640完全培养液100μL)和空白对照组(每孔加RPMI 1640完全培养液200μL)。37℃、5％CO₂培养20h后，各孔加MTT溶液(2mg/mL)50μL，继续培养4h。1500r/min离心5min，弃去各孔上清，分别加酸性(4％1NHCl)DMSO溶液150μL，振荡，于室温暗处放置15min，以酶标仪于波长492nm处测定OD值。按下列公式计算NK细胞或CTL活性：

NK细胞活性＝[(靶细胞对照OD值－空白对照孔OD值)－(实验孔OD值－效应细胞OD值)]/(靶细胞对照OD值－空白对照孔OD值)×100％

CTL活性＝[(靶细胞对照OD值－空白对照孔OD值)－(实验孔OD值－效应细胞OD值)]/(靶细胞对照OD值－空白对照孔OD值)×100％

1.4脾细胞培养上清中细胞因子含量测定

于24孔细胞培养板中，每孔接种脾细胞悬液(5×10⁶个/ml)1ml，加入等体积的ConA溶液(终浓度为5μg/ml)。37℃，5％CO₂培养箱中孵育48小时，2500r/m离心10min，收集细胞上清。根据小鼠细胞因子ELISA检测试剂盒说明书测定上清液中细胞因子Il-4、INF-γ、IL-10的含量。具体操作：取已包被抗原的酶标板，加入标准品或样本100μl/孔，37℃孵育90min；甩去酶标板内液体，拍干，加入生物素标记的抗小鼠特异性抗体工作液100μl/孔，37℃孵育60min；甩去酶标板内液体，PBS 300μl/孔洗涤3次，每次浸泡1min左右；加入亲和素－过氧化物酶复合物(ABC)工作液(37℃预平衡30分钟)100μl/孔，37℃孵育30min；甩去酶标板内液体，PBS 300μl/孔洗涤5次，每次浸泡1min；加入已经在37℃平衡30分钟的TMB显色液90μl/孔，37℃避光15～20min，以标准液高浓度几孔出现梯度蓝色为准；加TMB终止液100μl/孔，蓝色转为黄色。以酶标仪450nm处测定OD值。根据标准曲线，计算细胞因子子Il-4、INF-γ、IL-1的含量。

1.5脾细胞细胞因子基因表达水平检测

1.5.1脾细胞刺激和总RNA提取于24孔细胞培养板中，每孔接种脾细胞悬液(5×10⁶个/ml)1ml，加入等体积的Con A溶液(终浓度为2μg/ml)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养16h，收集细胞。加入1ml Trizol，震荡均匀后，室温静置5min，加入0.2ml氯仿，震荡5s，静置2min，4℃，12000rpm离心15min，取上清；加入等体积异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；4℃，12000rpm离心10min，弃上清；加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500rpm离心5min，弃上清；室温干燥RNA沉淀，加入适量的DEPC水于60℃溶解10min；经RNAclean RNA清洁纯化试剂盒过柱纯化；使用Nanodrop2000测定RNA纯度和浓度。

1.5.2 cDNA第一链的合成取0.2ml离心管，按照20μl反应体系进行反转录。使用DEPC水将所有样品的mRNA量都调整为2μg，体积定容至11.5μl，加入100μM的Oligd(T)181μl，60℃水浴5min，之后迅速置于-20℃冷却2min；按照所需配制混合反应体系，一份反应混合液中含有5×Buffer(MMLV)4μl，RNA酶抑制剂0.5μl，dNTP(10mM)2μl，MMLV反转录酶1μl，总体积为7.5μl。至此，将此20μl反应体系置于PCR仪中，以反转录程序：42℃1h和72℃10min进行cDNA第一链的合成。反转录后的cDNA保存-20℃待扩增使用。

1.5.3 PCR引物根据基因库(Genebank)上发表的小鼠细胞因子和GAPDH序列，用Premier5.0软件设计引物(表)，并由生工生物有限公司合成。

表1基因序列即扩增条件

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)

1.5.4 PCR反应体系及反应程序取0.2ml离心管，按照20μl反应体系对细胞因子靶基因进行扩增。20μl反应体系中含有：cNDA模板1μl，DEPC水13.9μl，10×PCR buffer 2μl，MgCl2(25mM)1.2μl，dNTP(10mM)0.5μl，Taq酶0.4μl，上下游引物各0.5μl。按常规方法进行PCR扩增。

1.5.5琼脂糖电泳分析用0.5×TAE缓冲液配制1.5％琼脂糖凝胶，加入核酸染料Glodview(0.5μg/ml)。取PCR产物20μl，加6×加样缓冲液4μl，混匀后取4μl上样，同时上样DNA Marker做对照，确定产物的特异性。以恒压120V，电泳30min。

1.5.6光密度分析 电泳结束，于Peiqing凝胶成像仪下观察并拍照，用LaunchSensiAnsys软件定量分析扩增条带光密度，并按照下列公式计算目的基因的相对表达强度：被测基因表达强度＝被测基因光密度/GAPDH光密度。

1.6血清抗原特异性抗体及亚类的测定

在96孔酶标板上，每孔加入100μl包被液(S180细胞裂解物的50mM碳酸盐缓冲液，蛋白浓度为50μg/ml,pH9.6)，置4℃孵育24h，用洗涤液洗涤3次，每次3min，每孔加封闭液150μl，于37℃，5％CO2培养箱中孵育2h，用洗涤液洗涤3次，每次3min，加100μl待测血清稀释液(1∶200)。37℃，5％CO2培养箱中孵育2h，用洗涤液洗涤3次，每次3min，每孔加辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG(1:16000)、、羊抗小鼠IgG2a(1:8000)、羊抗小鼠IgG2b(1:8000)抗体稀释液100μl，37℃，5％CO2培养箱中孵育2h，用洗涤液洗涤3次，每次3min。每孔加100μl底物溶液(25ml底物缓冲液中加入10mg邻苯二胺和30％H₂O₂37.5μl)，37℃暗处放置10min，加50μl/孔2NH₂SO₄溶液终止反应。置酶标仪于波长492nm处测定OD值。1.7统计学分析

所得数据用x±SD表示，用t检验比较实验组与对照组间的显著性差异。在各组间的显著性差异用one-way ANOVA统计分析。

铁双七钨磷氧簇Na₁₂H[Fe(HPW₇O₂₈)₂]·44H₂O浓度25–500μM时，体外对K562、HeLa等肿瘤细胞增殖呈显著的浓度依赖性抑制作用。如图7所示。

铁双七钨磷氧簇对K562细胞的毒性反应

实施例2

一、实验原理：

MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

MTT主要有两个用途1.药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定；2.细胞增殖及细胞活性测定。

检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。

二、操作方法

1.药物浓度配制

铁双七钨磷氧簇化合物药物原液+1640培养基倍比稀释，形成7个浓度梯度。

2.细胞浓度(细胞株名称)

细胞株3AO(卵巢癌粘液性癌)

3.实验步骤

1:胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至(5-10)×10⁴/ml。

2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul,这样待测细胞的密度为5000～10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。

3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，(但常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul，设3个复孔)。

4.5％CO2，37℃孵育24-96小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

6.终止培养，准备溶解结晶。

7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

三、结果如下表

四、结论

48h IC50的浓度是8.105mg/ml。

Claims (3)

1.铁双七钨磷氧簇化合物用于制备治疗肉瘤药物的应用；该化合物具有以下的阴离子化合物单元，阴离子化合物单元的化学式为：[Fe(HPW₇O₂₈)₂]^12-；并且所述的Fe、P、W、O具有以下的结构式：

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2.铁双七钨磷氧簇化合物用于制备治疗慢性骨髓性白血病药物的应用；该化合物具有以下的阴离子化合物单元，阴离子化合物单元的化学式为：[Fe(HPW₇O₂₈)₂]^12-；并且所述的Fe、P、W、O具有以下的结构式：

。

3.铁双七钨磷氧簇化合物用于制备治疗卵巢癌粘液性癌药物的应用；该化合物具有以下的阴离子化合物单元，阴离子化合物单元的化学式为：[Fe(HPW₇O₂₈)₂]^12-；并且所述的Fe、P、W、O具有以下的结构式：

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