CN104757559A - 一种抗疲劳组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及保健品技术领域，尤其涉及一种抗疲劳组合物及其制备方法。本发明将苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物、牛磺酸进行复配后能够具有显著的抗疲劳的功能。经小鼠负重游泳实验，结果表明采用本发明提供的组合物能够将小鼠游泳时间延长155％，显著优于单独使用牛磺酸(延长41.55％)、西洋参提取物(延长54.22％)或苹果干细胞冻干粉(延长46.13％)的小鼠，且经检测，给予本发明提供的组合物，小鼠经负重游泳实验后体内肌糖原和乳酸脱氢酶的含量皆有显著的上升，而血尿素氢的含量有显著的下降。这些实验表明本发明提供的组合物的抗疲劳的效果显著优于单独使用各组分的作用。

Description

一种抗疲劳组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及保健品技术领域，尤其涉及一种抗疲劳组合物及其制备方法。

背景技术

在劳动过程中人体各系统、器官或全身生理功能和作业能力出现明显下降的状态称为疲劳。它是人体的正常生理反应。疲劳的长期积蓄会造成过度疲劳，发展为病理状态。疲劳是人们熟悉但又十分复杂的一种现象，不论从事何种作业，随着劳动时间延长，均会出现疲劳，表现为作业能力下降，感觉疲倦，对任何用力都感到厌烦等。对疲劳按其形式大致分为以下几种：①局部疲劳疲劳主要发生在身体的某一部分或个别器官，如抄写、折页、打字等引起的上肢疲劳和仪表工人的视觉疲劳。这类疲劳发生在局部，一般不影响其他部位的功能。如手指疲劳时，对视力和听力并无明显影响。②全身疲劳主要是由于全身参加较为繁重的体力劳动所致，表现为肌肉关节酸痛、疲倦、运作迟缓、反应迟钝、错误增加、作业能力下降等。③智力疲劳主要是长时间从事紧张的脑力劳动所引起头昏脑胀、全身乏力、嗜睡或失眠等。这种疲劳与对某项工作缺乏兴趣而产生的厌倦感不易区别。④技术性疲劳常见于需要脑力体力并重且精神紧张的作业，如驾驶员、报务员、流水线上的操作工等，这种疲劳与前两种疲劳无本质上的差别。

随着现代生活节奏的加快，社会竞争的加剧，很多人因为工作、学习的压力等，疲劳成为困扰很多人的健康问题。也正因如此，具有缓解疲劳，抗疲劳作用的保健食品应运而生。据中国保健协会市场工作委员会数据，截止到2005底，我国共批准“抗疲劳”、“缓解体力疲劳“保健食品1260种，其中国产保健食品1214种，进口保健食品46种。很多产品同时申报了两中以上的保健功能，多集中在提高免疫力、耐缺氧上。目前市场上的抗疲劳产品大致可以分为以下几类：第一是补充能量。通过补充运动中所消耗的营养素来达到维持机体正常生理功能，解除疲劳的目的。第二是补充人体必需的维生素和微量元素。第三是通过提高机体器官的功能，特别是循环系统的功能，加速体内代谢物质的清除、排出，来达到抗疲劳目的。

但是，疲劳发生往往是综合因素导致的，而目前的抗疲劳保健品往往不能具有确切的效果，功能也大多十分不稳定。因此，进一步的开发功能显著且稳定的抗疲劳产品十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种抗疲劳组合物，该组合物能够具有显著且稳定的抗疲劳效果。

本发明提供了一种抗疲劳组合物，包括苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸。

其中，苹果干细胞不仅可以快速激活机体内休眠的干细胞，而且还能积极修复受损的干细胞，刺激人类角质细胞和纤维母细胞的增生，增加皮肤弹性，具有抗衰老和美容生发的奇效。苹果干细胞具有植物干细胞的特性：强大的抗氧化和抗衰老活性，能显著提高人体免疫力和抗癌能力。

牛磺酸是一种特殊的氨基酸，是人体必不可少的一种营养元素，有着平衡健康的奇妙功效。除了眼睛之外，牛磺酸还对其它器官有重要功效。例如，经过研究证实，人体心脏中牛磺酸含量最高。牛磺酸是通过保护心肌而增强心脏功能的。当心肌细胞中钙离子流入量过高时，就会引发冠心病。牛磺酸可以调整心肌细胞中钙离子的量，维持其平衡，实现强心。牛磺酸与心脏的关系已成为全世界重点研究的课题之一。

西洋参又称花旗参，具有补气养血、滋阴补肾、键脾养胃、延缓衰老及养颜等功效。现代医学研究证明，西洋参具有抗疲劳、抗衰老、抗休克、提高思维、改善记忆及调节内分泌、增强人体免疫力及改善心血管功能等作用。其主要成分为西洋参总皂苷。

本发明采用的西洋参提取物可为自制也可为市场购得，本发明对此不作限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。

作为优选，西洋参提取物采用乙醇提取，其中西洋参总皂苷的含量不低于。

本发明将苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物、牛磺酸进行复配后能够具有显著的抗疲劳的功能。经小鼠负重游泳实验，结果表明采用本发明提供的组合物能够将小鼠游泳时间延长155％，显著优于单独使用牛磺酸(延长41.55％)、西洋参提取物(延长54.22％)或苹果干细胞冻干粉(延长％)的小鼠，且经检测，给予本发明提供的组合物，小鼠经负重游泳实验后体内肌糖原和乳酸脱氢酶的含量皆有显著的上升，而血尿素氢的含量有显著的下降。这些实验表明本发明提供的组合物的抗疲劳的效果显著优于单独使用各组分的作用。

在本发明的实施例中，苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸的质量比为(10～20)：(10～15)：(0.6～1.5)。

在一些实施例中，苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸的质量比为10:10:0.6。

在一些实施例中，苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸的质量比为10:10:1.5。

在一些实施例中，苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸的质量比为10:15:0.6。

在一些实施例中，苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸的质量比为10:15:1.5。

在一些实施例中，苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸的质量比为20:10:0.6。

在一些实施例中，苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸的质量比为20:10：1.5。

在一些实施例中，苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸的质量比为20:15:0.6。

在一些实施例中，苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸的质量比为20:15:1.5。

在一些实施例中，苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸的质量比为15：12.5:1。

本发明采用的苹果干细胞冻干粉可为市场购得也可采用本发明提供的方法制备，其实施皆在本发明的保护范围之内。作为优选，苹果干细胞冻干粉以本发明提供的方法制得，该方法以苹果新生枝条为原料，经诱导形成愈伤组织后增殖培养并扩大培养获得苹果干细胞，再冻干后制得。该苹果干细胞冻干后直接用于本发明提供组合物的制备，该冻干粉中黄酮和多酚类物质含量丰富。

苹果干细胞冻干粉的制备方法包括以下步骤：

步骤1：苹果新生枝条杀菌、去除木质部和髓后，接种于诱导培养基，诱导培养获得形成层细胞；

步骤2：所述形成层细胞经继代培养，接入增殖培养基，摇床培养获得单细胞；

步骤3：将所述单细胞接种于增殖培养基经扩大培养，获得苹果干细胞；

步骤4：将所述苹果干细胞反复冻融后冻干、粉碎，获得苹果干细胞冻干粉；

所述诱导培养基为含有NAA、BA和水解酪蛋白的MS固体培养基；

所述增殖培养基为含有2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的MS液体培养基。

在本发明的实施例中，杀菌包括以下步骤：

步骤1：将苹果新生枝条以水冲洗后，以浓度为10～1000mg/L的L-抗坏血酸溶液浸泡；

步骤2：以体积分数为60％～95％的乙醇水溶液浸泡后以无菌水冲洗；

步骤3：以体积分数为10％～100％的过氧化氢水溶液浸泡后以无菌水冲洗。

作为优选，苹果新生枝条的长度为10cm。

作为优选，L-抗坏血酸的浓度为120mg/L。

优选的，步骤1中所述浸泡的时间为1min。

作为优选，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为75％。

优选的，步骤2中所述浸泡的时间为1min。

作为优选，步骤2中无菌水的体积为2L。

作为优选，过氧化氢水溶液中过氧化氢的体积分数为30％。

优选的，步骤3中所述浸泡的时间为20min。

优选的，步骤3中所述冲洗的时间为10min。

以本发明提供的杀菌方法对苹果新生枝条进行杀菌能够充分的杀除苹果新生枝条上所携带的真菌、细菌或病毒。以便保证苹果新生枝条在培养过程中不被干扰，从而保证苹果新生枝条上的细胞更加快速的去分化。而实验表明，本发明提供的方法能够有效将苹果新生枝条细胞去分化，经诱导和扩大培养，48天左右即可获得大量的苹果干细胞。

在本发明实施例中，NAA、BA和水解酪蛋白的质量比为0.5：2：1。

优选的，诱导培养基中NAA的浓度为0.5mg/L。

优选的，诱导培养基中BA的浓度为2.0mg/L。

优选的，诱导培养基中水解酪蛋白的浓度为1.0mg/L。

作为优选，诱导培养基为固体培养基，其中琼脂的质量分数为1％。

作为优选，诱导培养基的pH值为6.0。

在本发明的实施例中，步骤1中所述的接种为，每g去除木质部和髓的苹果新生枝条接种于10cm²的诱导培养基。

在一些实施例中，诱导培养为暗培养；温度为25℃；时间为10天。

经诱导培养后，形成层组织为均一生长的平板状组织，而其他组织则为不规则的聚集生长物。

在一些实施例中，继代培养为暗培养；温度为25℃；时间为10天。

在本发明的实施例中，继代培养采用遇到培养基，每g形成层细胞接种于10cm²的诱导培养基。

经10天的继代培养，形成层细胞形成愈伤组织，每10cm²的诱导培养基上约有愈伤组织20.8g。

一些实施例中，增殖培养基中，2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的质量比为2:1:1:1。

优选的，增殖培养基中2,4-D的浓度为2.0mg/L。

优选的，增殖培养基中BA的浓度为1.0mg/L。

优选的，增殖培养基中水解酪蛋白的浓度为1.0mg/L。

优选的，增殖培养基中活性炭的浓度为1.0mg/L。

作为优选，增殖培养基的pH值为6.0。

在本发明的实施例中，每g愈伤组织接入20mL增殖培养基。

作为优选，摇床培养时，增殖培养基中还添加经灭菌的直径为0.5cm的玻璃珠。

优选的，玻璃珠的添加量为100g/L增殖培养基。

实施例中，培养采用三角瓶，1000mL三角瓶中加入200mL增殖培养基。

在本发明的实施例中，摇床培养的条件为每小时用20W的白炽灯照射10min。

在一些实施例中，摇床培养的温度为25℃；转速为120转/分钟；时间为14天。

作为优选，在摇床培养7天后加入新鲜的增殖培养基。

作为优选，加入新鲜的增殖培养基的体积为原增殖培养基的2倍。

添加新鲜的增殖培养基后，其中细胞的密度为1×10⁵/ml。

采用本发明提供的方法进行摇床培养，愈伤组织成为单细胞悬液，细胞增殖速度较快，用100目的不锈钢筛网过滤，除去细胞团、玻璃珠和残渣，获得细胞密度约1×10⁶/ml。

作为优选，步骤3中接种的密度为1×10⁴/ml。

在一些实施例中，扩大培养具体为：于20L的生物反应器中添加5L增殖培养基，培养7天后添加增殖培养基至细胞浓度为1×10⁵/ml，再培养7天。

本发明提供的抗疲劳组合物的制备方法为，将苹果干细胞冻干粉、牛磺酸和西洋参提取物混合，制得抗疲劳组合物。

本发明还提供了一种抗疲劳的保健品，包括本发明提供的抗疲劳的组合物。

作为优选，本发明提供的抗疲劳的保健品还包括保健品中可接受的辅料。

本发明提供的抗疲劳的保健品的剂型为口服液剂。

一种抗疲劳的口服液，本发明提供的抗疲劳组合物、甜味剂、香精和水。

作为优选，其中甜味剂为L-苹果酸和甜菊糖苷；香精为苹果香精。

甜菊糖苷在人体中不参与生理生化反应，具有某种程度的抑制细菌和防腐的作用，其具有多种生理功能，例如：，甜菊糖苷无毒副作用无致癌性食用安全，经常食用可预防高血压糖尿病肥胖症心脏病龋齿等，且能够调节血脂、预防肿瘤、促进矿物质吸收。将其作为甜味剂不仅不会导致血糖上升，还会起到一定的保健作用，更适合糖尿病患者使用。

L-苹果酸能增强药物的稳定性，改善人体对药物的吸收。将其作为甜味剂使用也不会导致血糖的升高，适合糖尿病患者使用。

作为优选，在抗疲劳口服液中，本发明提供的抗疲劳组合物、甜味剂、香精和水的质量比为(20.6～36.5)：(2.3～4.6)：(2～4)：(45～65)。

优选的，在抗疲劳口服液中，本发明提供的抗疲劳组合物、甜味剂、香精和水的质量比为28.5:3.5：3：55。

本发明提供的抗疲劳口服液的制备方法为将甜味剂、西洋参提取物、牛磺酸与水混合，煮沸30min后与香精混合，经冷却与苹果干细胞冻干粉混合制得抗疲劳口服液。

具体的，本发明提供的抗疲劳口服液的制备方法包括：

步骤1：将苹果干细胞冻干粉、牛磺酸、西洋参提取物分别粉碎后，过120目筛；

步骤2：以配方量的纯化水溶解L-苹果酸、甜菊糖苷、西洋参提取物、牛磺酸，加热至煮沸30分钟后，与香精混合，经过滤，冷却至室温，与苹果干细胞冻干粉，制得抗疲劳口服液。

本发明将苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物、牛磺酸进行复配后能够具有显著的抗疲劳的功能。经小鼠负重游泳实验，结果表明采用本发明提供的组合物能够将小鼠游泳时间延长155％，显著优于单独使用牛磺酸(延长41.55％)、西洋参提取物(延长54.22％)或苹果干细胞冻干粉(延长％)的小鼠，且经检测，给予本发明提供的组合物，小鼠经负重游泳实验后体内肌糖原和乳酸脱氢酶的含量皆有显著的上升，而血尿素氢的含量有显著的下降。这些实验表明本发明提供的组合物的抗疲劳的效果显著优于单独使用各组分的作用。

具体实施方式

本发明提供了一种抗疲劳组合物及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1苹果干细胞冻干粉的制备

1、培养基的配方：

1.1诱导培养基：MS固体培养基+NAA0.5mg/L+BA 2mg/L+CH 1mg/L，pH值为6.0；

1.2增殖培养基：MS液体培养基+2,4-D 2.0mg/L+BA 1.0mg/L+CH1.0mg/L+AC 1.0mg/L，pH值为6.0；

2、苹果枝条的杀菌

选择无化肥农药污染、绿色种植的苹果树，按照一定的评判标准挑选10支10cm长新生枝条；用无菌水2L洗涤新生枝条表面附着物；将新生枝条放进120mg/L L-抗坏血酸中浸泡1分钟；将新生枝条放入75％的乙醇溶液中杀菌1分钟，用2L无菌水冲洗干净；再放入30％的过氧化氢溶液中杀菌20分钟，并用无菌水冲洗10分钟。

3、形成层组织的诱导

将灭菌的苹果新生枝条用接种刀剥离形成层、韧皮部、皮质和表皮等组织，丢弃木质部和髓；将获得的组织接种至新鲜的固体培养基中，以每1g组织接种10cm²固体培养基的密度进行接种，在受控的暗室内25℃连续培养10天，获得形成层组织。

4、继代培养形成层组织

将再生的形成层组织与其他组织分离开；以每1g组织接种10cm²固体培养基的密度，将再生的形成层组织接种至新鲜的固体培养基中，在受控的暗室内25℃连续培养10天，获得愈伤组织。

5、单细胞培养

在1000ml三角瓶中加入200ml液体培养基、灭菌处理的20g、直径0.5cm的玻璃珠；将10g愈伤组织转移到三角瓶中；将三角瓶置于25℃、120转/分钟的摇床上进行培养，每小时用20W的白炽灯照射10分钟；第7天，加入400ml新鲜的液体培养基至细胞密度为其中细胞的密度为1×10⁵/ml，然后继续培养7天；培养后用100目的不锈钢筛网过滤，除去细胞团、玻璃珠和残渣，得到单细胞悬液，

6、放大培养

将单细胞悬液转移至20L生物反应器中进行大规模培养，生物反应器中容纳5L的增殖培养基。培养第7天时，加入10L的新鲜液体培养基，继续培养后获得细胞悬液。

7、冻干粉的制备

苹果干细胞悬液用1um过滤器过滤，去掉培养基，收获截留的黏胶状细胞取出；将细胞放入-30℃的冰箱内预冻3小时；放入液氮罐中超低温速冻2小时；取出解冻30分钟后，再放入-30℃冰箱内预冻和液氮罐内速冻，依次2遍；将细胞取出，室温下维持10分钟，入低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥后，高速粉碎成60目冻干粉。

实施例2抗疲劳组合物的制备

先将苹果干细胞冻干粉100g、西洋参提取物100g、牛磺酸6g，分别进行粉碎，过120目筛，然后将已粉碎、过筛的物料于混合机中混合均匀。

实施例3抗疲劳组合物的制备

先将苹果干细胞冻干粉100g、西洋参提取物100g、牛磺酸15g，分别进行粉碎，过120目筛，然后将已粉碎、过筛的物料于混合机中混合均匀。

实施例4抗疲劳组合物的制备

先将苹果干细胞冻干粉100g、西洋参提取物150g、牛磺酸6g，分别进行粉碎，过120目筛，然后将已粉碎、过筛的物料于混合机中混合均匀。

实施例5抗疲劳组合物的制备

先将苹果干细胞冻干粉100g、西洋参提取物150g、牛磺酸15g，分别进行粉碎，过120目筛，然后将已粉碎、过筛的物料于混合机中混合均匀。

实施例6抗疲劳组合物的制备

先将苹果干细胞冻干粉100g、西洋参提取物50g、牛磺酸6g，分别进行粉碎，过120目筛，然后将已粉碎、过筛的物料于混合机中混合均匀。

实施例7抗疲劳组合物的制备

先将苹果干细胞冻干粉100g、西洋参提取物50g、牛磺酸7.5g，分别进行粉碎，过120目筛，然后将已粉碎、过筛的物料于混合机中混合均匀。

实施例8抗疲劳组合物的制备

先将苹果干细胞冻干粉100g、西洋参提取物75g、牛磺酸6g，分别进行粉碎，过120目筛，然后将已粉碎、过筛的物料于混合机中混合均匀。

实施例9抗疲劳组合物的制备

先将苹果干细胞冻干粉100g、西洋参提取物75g、牛磺酸15g，分别进行粉碎，过120目筛，然后将已粉碎、过筛的物料于混合机中混合均匀。

实施例10抗疲劳组合物的制备

先将苹果干细胞冻干粉150g、西洋参提取物125g、牛磺酸10g，分别进行粉碎，过120目筛，然后将已粉碎、过筛的物料于混合机中混合均匀。

实施例11抗疲劳口服液的制备

苹果干细胞冻干粉、牛磺酸、西洋参提取物分别粉碎过120目筛网，纯化水450mL投入配料罐中，在搅拌的情况下加入2g L-苹果酸、0.3g甜菊糖苷、100g西洋参提取物、6g牛磺酸，加热至煮沸30分钟后，加入2g苹果香精，搅拌混合均匀，过滤，冷却至室温，再加入100g苹果干细胞冻干粉，搅拌混合均匀，转移至口服液灌装机内，灌装于具有一定规格的容器中，即得具有抗疲劳保健功能的苹果干细胞口服液。

实施例12抗疲劳口服液的制备

苹果干细胞冻干粉、牛磺酸、西洋参提取物分别粉碎过120目筛网，纯化水500mL投入配料罐中，在搅拌的情况下加入2.2g L-苹果酸、0.35g甜菊糖苷、100g西洋参提取物、15g牛磺酸，加热至煮沸30分钟后，加入2.3g苹果香精，搅拌混合均匀，过滤，冷却至室温，再加入100g苹果干细胞冻干粉，搅拌混合均匀，转移至口服液灌装机内，灌装于具有一定规格的容器中，即得具有抗疲劳保健功能的苹果干细胞口服液。

实施例13抗疲劳口服液的制备

苹果干细胞冻干粉、牛磺酸、西洋参提取物分别粉碎过120目筛网，纯化水550mL投入配料罐中，在搅拌的情况下加入2.4g L-苹果酸、0.4g甜菊糖苷、150g西洋参提取物、6g牛磺酸，加热至煮沸30分钟后，加入2.6g苹果香精，搅拌混合均匀，过滤，冷却至室温，再加入100g苹果干细胞冻干粉，搅拌混合均匀，转移至口服液灌装机内，灌装于具有一定规格的容器中，即得具有抗疲劳保健功能的苹果干细胞口服液。

实施例14抗疲劳口服液的制备

苹果干细胞冻干粉、牛磺酸、西洋参提取物分别粉碎过120目筛网，纯化水600mL投入配料罐中，在搅拌的情况下加入2.6g L-苹果酸、0.45g甜菊糖苷、150g西洋参提取物、15g牛磺酸，加热至煮沸30分钟后，加入2.8g苹果香精，搅拌混合均匀，过滤，冷却至室温，再加入100g苹果干细胞冻干粉，搅拌混合均匀，转移至口服液灌装机内，灌装于具有一定规格的容器中，即得具有抗疲劳保健功能的苹果干细胞口服液。

实施例15抗疲劳口服液的制备

苹果干细胞冻干粉、牛磺酸、西洋参提取物分别粉碎过120目筛网，纯化水600mL投入配料罐中，在搅拌的情况下加入1.4g L-苹果酸、0.25g甜菊糖苷、50g西洋参提取物、6g牛磺酸，加热至煮沸30分钟后，加入1.5g苹果香精，搅拌混合均匀，过滤，冷却至室温，再加入100g苹果干细胞冻干粉，搅拌混合均匀，转移至口服液灌装机内，灌装于具有一定规格的容器中，即得具有抗疲劳保健功能的苹果干细胞口服液。

实施例16抗疲劳口服液的制备

苹果干细胞冻干粉、牛磺酸、西洋参提取物分别粉碎过120目筛网，纯化水325mL投入配料罐中，在搅拌的情况下加入1.5g L-苹果酸、0.275g甜菊糖苷、50g西洋参提取物、7.5g牛磺酸，加热至煮沸30分钟后，加入1.6g苹果香精，搅拌混合均匀，过滤，冷却至室温，再加入100g苹果干细胞冻干粉，搅拌混合均匀，转移至口服液灌装机内，灌装于具有一定规格的容器中，即得具有抗疲劳保健功能的苹果干细胞口服液。

实施例17抗疲劳口服液的制备

苹果干细胞冻干粉、牛磺酸、西洋参提取物分别粉碎过120目筛网，纯化水300mL投入配料罐中，在搅拌的情况下加入1.6g L-苹果酸、0.3g甜菊糖苷、75g西洋参提取物、6g牛磺酸，加热至煮沸30分钟后，加入1.7g苹果香精，搅拌混合均匀，过滤，冷却至室温，再加入100g苹果干细胞冻干粉，搅拌混合均匀，转移至口服液灌装机内，灌装于具有一定规格的容器中，即得具有抗疲劳保健功能的苹果干细胞口服液。

实施例18抗疲劳口服液的制备

苹果干细胞冻干粉、牛磺酸、西洋参提取物分别粉碎过120目筛网，纯化水275mL投入配料罐中，在搅拌的情况下加入2g L-苹果酸、0.275g甜菊糖苷、75g西洋参提取物、15g牛磺酸，加热至煮沸30分钟后，加入2g苹果香精，搅拌混合均匀，过滤，冷却至室温，再加入100g苹果干细胞冻干粉，搅拌混合均匀，转移至口服液灌装机内，灌装于具有一定规格的容器中，即得具有抗疲劳保健功能的苹果干细胞口服液。

实施例19抗疲劳口服液的制备

苹果干细胞冻干粉、牛磺酸、西洋参提取物分别粉碎过120目筛网，纯化水550mL投入配料罐中，在搅拌的情况下加入3g L-苹果酸、0.45g甜菊糖苷、125g西洋参提取物、10g牛磺酸，加热至煮沸30分钟后，加入3g苹果香精，搅拌混合均匀，过滤，冷却至室温，再加入150g苹果干细胞冻干粉，搅拌混合均匀，转移至口服液灌装机内，灌装于具有一定规格的容器中，即得抗疲劳口服液。

对比例1对照品1的制备

苹果干细胞冻干粉粉碎过120目筛网，纯化水550mL投入配料罐中，在搅拌的情况下加入3g L-苹果酸、0.45g甜菊糖苷，加热至煮沸30分钟后，加入3g苹果香精，搅拌混合均匀，过滤，冷却至室温，再加入285g苹果干细胞冻干粉，搅拌混合均匀，转移至口服液灌装机内，灌装于具有一定规格的容器中，即得具有抗疲劳保健功能的苹果干细胞口服液。

对比例2对照品2的制备

牛磺酸粉碎过120目筛网，纯化水550mL投入配料罐中，在搅拌的情况下加入3g L-苹果酸、0.45g甜菊糖苷、285g牛磺酸，加热至煮沸30分钟后，加入3g苹果香精，搅拌混合均匀，过滤，冷却至室温，转移至口服液灌装机内，灌装于具有一定规格的容器中，即得具有抗疲劳保健功能的苹果干细胞口服液。

对比例3对照品3的制备

西洋参提取物粉碎过120目筛网，纯化水550mL投入配料罐中，在搅拌的情况下加入3g L-苹果酸、0.45g甜菊糖苷、285g西洋参提取物，加热至煮沸30分钟后，加入3g苹果香精，搅拌混合均匀，过滤，冷却至室温，转移至口服液灌装机内，灌装于具有一定规格的容器中，即得具有抗疲劳保健功能的苹果干细胞口服液。

实施例20本发明提供抗疲劳口服液的效果鉴定

进行小鼠负重实验鉴定本发明提供的抗疲劳口服液的效果。

1、小鼠：昆明小鼠，体重均为25±2g，雌雄不分，进入实验程序前，进行1g负重筛选，10min仍然存活进入实验程序共100只，雌雄各半。随机分配成5组，20只/组，雌雄各半。分别为实验组、阳性对照组1～3，空白对照组。

2、试剂配制及取用剂量

①实验组：取实施例19提供的口服液，灌胃给予小鼠，10mL/只。

②阳性对照组1：取对照组1提供的口服液，灌胃给予小鼠，10mL/只。

③阳性对照组2：取对照组2提供的口服液，灌胃给予小鼠，10mL/只。

④阳性对照组3：取对照组3提供的口服液，灌胃给予小鼠，10mL/只。

⑤空白对照组：去离子水灌胃给予小鼠，10mL/只。

3、实验程序

①小鼠日常以相同的饲料喂养，自由饮水。

②实验周期为15天，每日早中晚各分别灌胃1次，0.5mL/次；最后一次为第15天游泳前1h，然后进行游泳试验。

③小鼠尾部负重1g，于60cm直径的水桶(控制水深为25cm，水温在25±1℃)中游泳，直至力竭(沉入水面下6s不能上浮的时间即为小鼠力竭游泳时间)。

实验结果如表1所示：

表1 负重游泳实验结果

编号	组别	动物数	游泳时间(min)	延长时间％
					1	空白对照组	20	28.4±15.8	------
2	阳性对照组1	20	41.5±18.6*	46.13％
					3	阳性对照组2	20	40.2±20.3*	41.55％*
4	阳性对照组3	20	43.8±17.6*	54.22％*
					5	实验组	20	72.5±27.2**	155％**

*表示与对照组相比为P<0.05,具有显著性差异。

**表示与对照组相比，P<0.01,具有极显著差异。

结果显示：空白对照组平均的力竭时间为28.4±15.8min，阳性对照组1～3在给药后，游泳时间分别为41.5±18.6、40.2±20.3、43.8±17.6；延长了46.13％、41.55％和54.22％，与对照组相比具有显著性提高；而实验组在服用后，游泳时间大大增加至72.5±27.2min，延长率达155％，与对照组相比，具有极显著性差异。

将实验后的小鼠进行肌糖原、乳酸脱氢酶(LDH)、血尿素氢(BUN)的测定，方法为：

a.肌糖原测定：小鼠进行脱臼处死后，取后肢肌肉，以冷的生理盐水冲洗后，用滤纸吸干，称取肌肉1g，放入3mL的300g/L的KOH溶液试管中，置沸水中水浴20min，冷却后转移至新的试管中，用蒸馏水定容后摇匀，取200uL的样品液，用蒽酮法测定糖含量，再换算出肌糖原的含量。

b.LDH活性测定：取小鼠的血液样品，4℃环境下离心3000r/min离心10min，取血清0.1mL与0.4mL冷的生理盐水混匀。用LDH试剂盒测定LDH的活性(z/U*L^-1)。

c.BUN含量测定：将取得的小鼠血清，用全自动生化分析仪测定(mmol/L)。

结果如表2：

表2：肌糖原、乳酸脱氢酶(LDH)、血尿素氢(BUN)的测定

编号	组别	肌糖原(mg/g)	乳酸脱氢酶(LDH)	血尿素氢(BUN)
					1	空白对照组	0.282±0.021	2764±152	9.41±0.67
2	阳性对照组1	0.328±0.029*△	3001±212△	8.52±0.28*
					3	阳性对照组2	0.324±0.013*△	2988±241△	8.77±0.35*
4	阳性对照组3	0.347±0.038*△	3112±236*△	8.65±0.29*
					5	实验组	0.429±0.034*	3689±336*	8.05±0.33*

*表示与对照组相比为P<0.05,具有显著性差异。

△表示实验组与阳性对照组相比，P<0.05,具有显著性差异。

进行试验后，空白对照组平均的肌糖原含量为0.282±0.021，而对比例1～3和实验组的肌糖原含量分别为0.328±0.029、0.324±0.013、0.347±0.038、0.429±0.034；与对照组相比，均具有显著差异。实验组与对比例1～3相比，肌糖原含量均具有显著性差异。

空白对照组平均乳酸脱氢酶的活性为2764±152，而对比例1～3和实验组的乳酸脱氢酶的活性分别3001±212、2988±241、3112±236、3689±336；与对照组相比，均具有显著差异。实验组与对比例1～3相比，乳酸脱氢酶含量均具有显著性差异。

空白对照组平均的血尿素氢(BUN)为9.41±0.67，而对比例1～3和实验组的血尿素氢分别8.52±0.28、8.77±0.35、8.65±0.29、8.05±0.33；与对照组相比，均具有显著差异。

对本发明其他实施例提供的口服液的检测结果与此相似。

实施例21本发明提供抗疲劳口服液的效果调查

随机选取240例感到疲劳的志愿者(其中80例全身疲劳类型人群、80例智力疲劳类型人群、80例技术疲劳类型人群)，随机分配成4组(其中每组中，三种类型所占人数不得少于20人)其效果明显。参加者年龄为28-55岁，无其他疾病，均为全向疲倦、头重、嗜睡、无力、情绪低落、无热心、经常出差错等症状的人群。

试用组：早晚各服用一次本发明实施例19提供的口服液，每次1瓶，30天为一疗程。

对照组：专利：一种抗疲劳、耐缺氧的运动保健品(授权号：CN101356972)每次1瓶，30天为一疗程。

表中服用效果的说明如下：

效果很好：疲倦感大大改善、没有嗜睡、无力等身体症状、情绪平稳，未出现低落现象。

效果明显：疲倦感有所改善；嗜睡无力等症状明显改善，情绪平稳，未出现低落现象。

效果可见：疲倦感减少，嗜睡无力等现象也有所缓解，情绪较服药前平稳。

无效：看不出有任何改变。

下面用表格说明对比试用情况。

表3 抗疲劳口服液效果调查

对本发明其他实施例提供的口服液的检测结果与此相似。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗疲劳组合物，其特征在于，包括苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸的质量比为(10～20)：(10～15)：(0.6～1.5)。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸的质量比为15：12.5:1。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，其中苹果干细胞冻干粉的制备方法包括以下步骤：

步骤1：苹果新生枝条杀菌、去除木质部和髓后，接种于诱导培养基，诱导培养获得形成层细胞；

步骤2：所述形成层细胞经继代培养，接入增殖培养基，摇床培养获得单细胞；

步骤3：将所述单细胞接种于增殖培养基经扩大培养，获得苹果干细胞；

步骤4：将所述苹果干细胞反复冻融后冻干、粉碎，获得苹果干细胞冻干粉；

所述诱导培养基为含有NAA、BA和水解酪蛋白的MS固体培养基；

所述增殖培养基为含有2,4-D、BA、水解酪蛋白和活性炭的MS液体培养基。

5.如权利要求1～4任一项所述的抗疲劳组合物的制备方法，其特征在于，将苹果干细胞冻干粉、西洋参提取物和牛磺酸混合，制得抗疲劳组合物。

6.一种抗疲劳的保健品，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的组合物。

7.一种抗疲劳的口服液，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的组合物、甜味剂、香精和水。

8.根据权利要求7所述的抗疲劳口服液，其特征在于，所述甜味剂为L-苹果酸和甜菊糖苷；香精为苹果香精。

9.根据权利要求7所述的抗疲劳口服液，其特征在于，所述权利要求1～4任一项所述的组合物、甜味剂、香精和水的质量比为(20.6～36.5)：(2.3～4.6)：(2～4)：(45～65)。

10.如权利要求7～9任一项所述的抗疲劳口服液的制备方法，其特征在于，将甜味剂、西洋参提取物、牛磺酸与水混合，煮沸30min后与香精混合，经冷却与苹果干细胞冻干粉混合制得抗疲劳口服液。