CN104755106A - 药物-蛋白质缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明记载了包含美登素和结合蛋白或肽的特异性缀合物及制备其的方法。所述缀合物使用特异性接头技术，其给出了优于已知抗体-药物缀合物的优势。

Description

药物-蛋白质缀合物
本发明涉及新的药物-蛋白质缀合物。
结合蛋白对靶细胞和分子的表面上的特定标志物的特异性已经导致了它们作为多种诊断和治疗试剂的载体的广泛用途。例如，发现这类缀合至标记物和报告基团(例如荧光基团、放射性同位素和酶)的蛋白质可用于在标记和成像应用中，而与细胞毒性试剂和化疗药物的缀合使得能够将这类试剂靶向递送至特定的组织或结构(例如特定的细胞类型或生长因子)，从而将对正常健康组织的影响降到最低并显著降低与化疗治疗相关的副作用。这类缀合物在一些疾病领域尤其在癌症领域中具有广泛的潜在的治疗性应用。
水溶性的合成的聚合物，尤其是聚烷二醇(polyalkarlene glycol)，被广泛用于缀合治疗活性分子，例如肽或蛋白配体，包括抗体。这些治疗性缀合物已被证明可通过延长循环时间和降低清除率而有利地改变药物代谢动力学，从而降低全身毒性并且在一些情况下展示出增加的临床效力。将聚乙二醇(PEG)共价缀合至蛋白质的过程通常被称为“PEG化”。
对于最佳效力和保证剂量间的一致性来说重要的是：每个结合蛋白的缀合部分的数目是相同的，并且每个部分被特异性地缀合至每个结合蛋白中相同的氨基酸残基。因此，已经开发了很多方法来提高这类缀合物的均一性。Liberatore et al,Bioconj.Chem1990,1,36-50,和del Rosario et al,Bioconj.Chem.1990,1,51-59描述了可用于交联蛋白质(包括抗体)中的二硫键的试剂的用途。WO 2005/007197描述了将聚合物缀合至蛋白质的方法，其使用能够与源自蛋白质中二硫键的两个硫原子缀合以产生新硫醚缀合物的新缀合试剂。
美登素是一类细胞毒性化合物，其包括美登素本身(一种从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)中分离的天然产品)以及相关的称作类美登素的化合物(例如DM1，安丝菌素P-3)。美登素及其类似物是有效的微管靶向化合物，其在有丝分裂时抑制细胞的增殖。然而，由于它们的细胞毒性，已将研究转向包含美登素的缀合物的开发，目的是减少副作用/毒性、改善药物递送或提高功效。例如，WO2009/134976公开了包含具有聚乙二醇间隔基的亲水性接头的抗体-药物缀合物，其中在其他可能性中，药物可为类美登素。WO2011/039721公开了类美登素及其用于制备与抗体的缀合物的用途。目前正在开发包含美登素的抗体-药物缀合物例如曲妥珠单抗-美坦辛(trastuzumab emtansine，T-DM1)，用于治疗多种疾病，包括治疗癌症。
两种抗体药物缀合物已经得到监管机构批准：一种是贝伦妥单抗-维多汀(brentuximab vedotin)，其中的药物为澳瑞他汀；一种是曲妥珠单抗-美坦辛(trastuzumab emtansine)，其中的药物为美登素(maytansine)。在这两种市售缀合物中，药物与抗体的连接都使用了基于马来酰亚胺的接头。马来酰亚胺在缀合试剂中被广泛使用。然而，与许多其他缀合试剂相同的是，马来酰亚胺的使用存在许多困难：缀合反应的控制是困难的，导致具有低均一性的产物，并且所得到的缀合物的稳定性可能是一个问题。
因此，本发明提供了一种含有美登素的缀合物，其具有以下通式：
(((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3)n-Ab            (I)
其中D代表美登素部分；
q代表从1至10的整数；
Lk1代表接头；
m代表从1至10的整数；
P代表键或z价基团-P1-NH-，其中z为2-11，并且P1为含有至少一个亚乙基单元–CH2-CH2-或乙二醇(ethylene glycol)单元-O-CH2-CH2-的基团；
p代表从1至10的整数；
Lk2代表键或y价接头，其中y为2-11，并且其由1-9个天冬氨酸和/或谷氨酸残基组成；
Lk3代表具有以下通式的接头：
-CO-Ph-X-Y-              (II)
其中Ph为任选地取代的苯基；X代表CO基团或CH.OH基团；并且Y代表具有下式的基团：
其中A和B各自代表C1-4亚烷基或亚烯基基团；
Ab代表能够结合靶标上的结合伴侣(binding partner)的结合蛋白或肽，所述结合蛋白经由源自所述结合蛋白或肽中的二硫键的两个硫原子被键合至Lk3上；并且
n代表一个从1至s的整数，其中s是缀合至Lk3之前存在于所述结合蛋白或肽中的二硫键的数目；
选择m、n、p、q、y和z的含义使得缀合物含有1至10个D基团。
D代表美登素部分(即，Lk1基团键合至美登素的残基上)。术语美登素包括化合物例如美登素本身、类美登素例如15-甲氧基安丝菌素P-3，及它们的衍生物。
优选地，美登素为一个包含亚结构(A)的化合物
其中X代表O或S；Ra代表氢或C1-4烷基；Rb代表氢、羟基、C1-4烷氧基或C1-4烷基C(O)O-；Rc代表氢、羟基、C1-4烷氧基或C1-4烷基C(O)O-；Rd代表氢或C1-4烷基；Re代表卤素或氢，并且Rf代表氢或C1-4烷基。
X优选地代表O。Ra优选地代表C1-4烷基，尤其是甲基。Rb优选地代表氢。Rc优选地代表氢或甲氧基，更优选地为氢。Rd优选地代表C1-4烷基，尤其是甲基。Re优选地代表氯或氢，尤其是氯。Rf优选地代表C1-4烷基，尤其是甲基。
更优选地，美登素包含亚结构(B)
其中X和Ra-Rf具有上文所示的含义。
仍更优选地，美登素包含亚结构(C)或(D)
最优选(C)。
在一些优选的实施方案中，美登素包括键合至亚结构(A)、(B)、(C)或(D)的酯羰基碳原子上的下述基团(E)：
例如美登素可包含亚结构(F)：
在一些优选的实施方案中，美登素包括键合至亚结构(A)、(B)、(C)或(D)的酯羰基碳原子上的以下基团之一：
在一些优选的实施方案中，美登素包含键合至亚结构(A)、(B)、(C)或(D)的酯羰基碳原子上的基团(L)：
具体的优选美登素的实例包括：
Lk1可在任何合适的位点被键合至所述美登素部分。当所述美登素部分对应于包含基团(E)的美登素时，Lk1'例如可被键合至基团(E)的氮原子上，例如：
Lk1是将两个或更多个美登素部分D连接至P基团的接头。它可带有2至10个D基团。Lk1优选地包含可降解的基团，即Lk1优选地为在生理条件下断裂从而将D从Ab上分离的接头。或者，Lk1可为在生理条件下不可切割的接头。当Lk1为在生理条件下断裂的接头时，其优选地可在细胞内的条件下切割。当靶标在细胞内时，Lk1优选地基本上对细胞外条件不敏感(即，使得能够允许向细胞内靶标递送充足剂量的治疗试剂)。
当Lk1是可降解的接头时，其可包含对水解条件敏感的基团。Lk1可包含在特定pH值(例如酸性条件)下降解的基团。水解条件/酸性条件可存在于例如内体或溶酶体中。在酸性条件下易水解的基团的实例包括腙、缩氨基脲、硫代缩氨基脲、顺式-乌头酰胺(cis-acotinic acid)、原酸酯和缩酮。易受水解条件影响的基团的实例包括：
在一个优选的实施方案中，Lk1是或包含
例如，Lk1可为：
在这种情况下，其优选地如下所示键合至D和P基团：
在该实施方案中，美登素部分D优选通过基团(E)的氮原子键合，例如：
Lk1也可在还原条件下易降解。例如，Lk1可包含二硫化物基团(disulfide group)，所述二硫化物基团在暴露于生物还原剂如硫醇时是可切割的。二硫化物基团的实例包括：
其中R、R′、R″和R″′均独立地为氢或C1-4烷基。在一个优选的实施方案中，Lk1是或包含
例如，Lk1可为
在该情况下，Lk1优选地如下所示键合至D和P基团：
在这些实施方案中，美登素部分D优选地通过基团(E)的氮原子键合，例如
Lk1也可包含易被酶降解的基团，例如它可易被蛋白酶(例如溶酶体的或内体的蛋白酶)或肽酶切割。例如，Lk1可包含肽基，所述肽基包含至少一个、例如至少两个或至少三个氨基酸残基(例如Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Cit、Phe-Lys)。例如，Lk1可为含有1至5个(例如2至4个)氨基酸的氨基酸链。另一个易被酶降解的基团的实例为：
其中AA代表蛋白酶-特异性的氨基酸序列，例如Val-Cit。
在一个优选的实施方案中，Lk1是或包含：
例如，Lk1可为
在这种情况下，其优选地如下所示键合至D和P基团
在该实施方案中，美登素部分D优选地是通过N-末端的氮键合。
在一个实施方案中，Lk1带有单独一个美登素部分D(即q＝1)。上面所示的特异性接头(Va)、(Vd)和(Ve)是属于此类型。在另一个实施方案中，q大于1，例如为2、3或4，并且Lk1被用作将多于一个美登素部分整合到本发明的缀合物中的一种方法。在一个实施方案中，这可通过使用分支接头Lk1来实现，所述分支接头Lk1例如可纳入天冬氨酸或谷氨酸或类似的残基。这引进了具有下式的分支成分(element)：
其中b为1、2或3，b＝1时为天冬氨酸，b＝2时为谷氨酸，b＝3时代表一个优选的实施方案。式VI中每个酰基部分均可经由合适的接头Lk1a被偶联至基团D上，其中Lk1a为任何合适的接头，例如纳入上文中针对Lk1提到的连接之一的可降解的接头。在一个具体的实施方案中，Lk1a代表上面所示的基团(Va)、(Vd)或(Ve)。天冬氨酸或谷氨酸或类似残基的氨基基团可通过任何合适的方法键合至P上，例如该连接可以是经由酰胺键，举例来说上述分支基团可经由-CO.CH2-基团被连接至P，因此：
如果需要的话，天冬氨酸或谷氨酸或类似残基可被偶联至其他天冬氨酸和/或谷氨酸和/或类似残基上，例如：
等，最高达9个此类的残基，给出了整合最高达10个D基团的潜力。如上所述，每个D均可经由任何合适的接头Lk1a被连接至天冬氨酸/谷氨酸或类似残基。
根据式(I)缀合物的结构，它可能以游离碱或游离酸的形式存在，以药学上可接受的盐的形式存在，或作为溶剂化物存在。
当P代表-P1-NH-基团时，P1包含至少一个亚乙基或乙二醇单元(-CH2-CH2-或-O-CH2-CH2-)。如果存在许多这样的单元，则P1代表聚乙烯(PE)或聚乙二醇(PEG)。这些聚合物可包含单独一个直链，或可具有包含许多小的或大的链的分支形态，在这种情况下它们将包含分支基团，通常包含>CH-，如例如在-(CH2CH2)2-CH-或-(O-CH2-)2CH-中。它们可以任选地以任何需要的方式被衍生化或官能化。例如它们可携带额外的治疗试剂，或标记试剂。包含多于一个的治疗试剂分子的多聚缀合物可产生协同和加成效应，所述多于一个的治疗试剂分子例如为多于一个的美登素汀分子或者除了一个美登素分子之外还包含一个治疗试剂分子。
当P1代表PE或PEG时，该聚合物最佳分子量将当然取决于预期的应用。通常，当P1代表PE时，优选地，数均分子量最高达2kDa，优选最高达1kDa。当P1代表PEG时，可使用更高的分子量，例如数均分子量可最高达75kDa，例如最高达60kDa，同时最小数均分子量为例如至少0.5kDa，例如至少1kDa，例如2kDa。在一个优选的实施方案中，可使用数均分子量为0.5至2kDa的PEG。然而，在某些优选的实施方案中，P可为键，或P可代表–P1-NH-，其中P1包含少量单个亚乙基或乙二醇单元，例如，2-10个，例如2个或3个亚乙基或优选的乙二醇单元。
如果希望式I的缀合物包含多于一个-(CH2-CH2)a-或-(O-CH2-CH2)a-链(其中a是在任何直链中亚乙基或乙二醇单元的数目)，例如以使每个这类链可带有Dq-Lk1基团，那么这可通过将多于一个(即2-10个)这类链键合至Lk2来实现，或通过使用分支的PE或PEG来实现(在这种情况下，只有一个基团P将被连接至Lk2，但是这将包含多于一个支链，例如1-9个支链(为D-Lk1基团提供2-10个连接点))。
应理解，当P是-P1-NH-时，该P基团或每个P基团是通过酰胺键被偶联至相邻基团Lk1和/或Lk2上。例如PEG(其通常以–OH基团封端)可被转化为相应的以–NH2基团封端的PEG胺，所述–NH2基团用于与所述Lk2中的-CO2基团形成酰胺键；或OH基团可被反应以与上文所述的Lk1形成连接-NH.CO.CH2.O-。
在本发明的一个优选的实施方案中，P1代表PEG，PEG是一种水溶性的合成的聚合物，并且在本说明书全文中，除非上下文另有要求，任何对P1的一般性提及都应被理解为包括对PEG的具体提及。
Lk2代表一个y-价接头，其中y为2-11。因此其能够键合1-10个基团P或Lk1。在其最简单的形式中，Lk2是一个键，在这种情况下Lk1直接键合至-P1-NH-基团，或者如果P是一个键，Lk2就直接键合至D-Lk1基团。然而，Lk2可被用作将多于一个D基团(美登素部分)纳入本发明的缀合物中的手段。这可通过经由酰胺连接将天冬氨酸或谷氨酸残基偶联至Lk3的-CO-基团而实现(例如使天冬氨酸或谷氨酸氨基基团与对应于Lk3的合适的羧酸衍生物反应)。这引入了上文所示的式VI的分支成分。在那种情况下，每个酰基部分可通过酰胺连接被偶联至-P1-NH-基团，或当P是一个键时偶联至D-Lk1基团。或者，如上文所示的式VIIa和VIIb中所示，天冬氨酸或谷氨酸残基可被偶联至其他的天冬氨酸和/或谷氨酸残基上，等等，最高可达9个此类残基，这给出了通过在Lk2中的不同连接点键合多个D-Lk1-P基团而纳入最高达10个D基团的潜力。应理解，Lk2的化合价与存在的D-Lk1-P基团的数目相关。例如，当P为-P1-NH-时，对于每个D-Lk1-P基团，Lk2的化合价与存在的-P1-NH-基团的数目有关，即p等于y-1。当P为一个键时，对于每个D-Lk1-P基团，Lk2的化合价与存在的D-Lk1基团的数目相关，即m等于y-1。
Lk3是一种能够通过源自结合蛋白中二硫键的两个硫基团结合至结合蛋白上的特异性接头。在Lk3中，苯基基团Ph可为未取代的或取代的。可任选存在于苯基基团Ph上的取代基包括例如一个或多个相同或不同的选自下述基团的取代基：烷基(优选C1-4烷基，尤其是甲基，任选地被OH或CO2H取代)、-CN、-NO2、-CO2R4、-COH、-CH2OH、-COR4、-OR4、-OCOR4、-OCO2R4、-SR4、-SOR4、-SO2R4、-NHCOR4、-NR4COR4、NHCO2R4、-NR4.CO2R4、-NO、-NHOH、-NR4.OH、-C＝N-NHCOR4、-C＝N-NR4.COR4、-N+R4 3、-N+H3、-N+HR4 2、-N+H2R4、卤素如氟或氯、-C≡CR4、-C＝CR4 2和-C＝CHR4，其中每个R4独立地代表氢原子或烷基(优选C1-6烷基)、芳基(优选苯基)或烷基-芳基(优选C1-6烷基-苯基)基团。特别优选存在吸电子取代基。优选的取代基包括例如-CN、-NO2、-OR4、-OCOR4、-SR4、-NHCOR4、-NR.COR4、-NHOH和–NR4.COR4。然而，优选地，苯基基团Ph是未取代的。
当Y代表基团III时，在接头Lk3与源自结合蛋白Ab中的二硫键的两个硫原子之间形成单个碳桥，而当Y代表基团IV时，基团A和B的性质决定了在接头Lk3与源自结合蛋白Ab中的二硫键的两个硫原子之间形成的桥的长度。优选形成3-碳桥，即优选Y具有下式：
如上所述，包含多于一个美登素部分的缀合物可具有优势。可用许多不同的方法实现存在多于一个美登素部分，例如如上文所述通过使用支链PEG、通过使用多价基团Lk2或通过使用多价基团Lk1。然而，其也可通过将多于一个接头Lk3连接至结合蛋白Ab而实现。一般而言，常见的全长抗体具有4个链间二硫键(对于整个IgG1抗体来说，重链-重链或重链-轻链)，并且这些二硫键中的任何或者全部都可根据本发明通过接头Lk3被桥接。也应想到的是，抗体中的一个或多个链内二硫键可通过接头Lk3被桥接。当存在多于一个缀合基团时，n大于1。n可为例如2、3或4。
替代地或额外地，可存在一个或多个其他美登素部分，其可经由接头Lk1连接至P，或者当P是一个键时，直接连接至Lk2。在这种情况下，m大于1，例如为2、3或4，最高达最大数10。如果存在多于一个接头Lk1，这些可彼此相同或不同。
替代地或额外地，可存在一个或多个其他美登素部分，其可连接至多价接头Lk1上。在这种情况下，q大于1，例如为2、3或4，最高达最大数10。
应想到的是，本发明的缀合物可带有最高达10个D基团(美登素部分)。当需要式I的缀合物包含多于一个D基团(即多于一个美登素部分)时，这可通过许多方法中的任何一个方法实现。例如，多个(((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3)-基团可被键合至单个抗体上(即n为2至s)。这个连接模式形成了一个提供包含多于一个基团D的缀合物的优选方法。第二个提供包含多于一个基团D的缀合物的优选方法是通过使用多价接头Lk1，例如包含上文所述的一个或多个天冬氨酸和/或谷氨酸或类似残基(例如式VI、VIIa和VIIb)的接头Lk1，以允许多个D基团存在(即q为2-10。可以相信的是，这样的缀合物是特别有效的：在该缀合物中Lk1是多价接头，尤其一个包括上式VI的接头，p＝1，q＝2，m＝1并且Lk2是一个键，此类缀合物形成了本发明的一个优选的实施方案。
替代地或额外地，当Lk2是由1-9个天冬氨酸和/或谷氨酸残基组成的基团时，多个((Dq-Lk1)m-P)-基团可在Lk2基团上的不同位置被键合(即p为2-10)，通过每个基团的胺部分与Lk2基团中的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基基团之间的酰胺键合。当P1包含至少一个亚乙基或乙二醇单元并且还包含至少一个分支单元时，多个(Dq-Lk1)-基团可额外地或替代地被键合至P1基团上的不同位置(即m为2-10)。
具有上述组合的缀合物也涵盖在本发明中。例如，缀合物可包含与两个((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基团键合的一个Ab基团，其中，对于那些((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基团中的每个来说，Lk2为与两个(D-Lk1)m-P基团键合的一个天冬氨酸或谷氨酸残基，并且其中，对于那些(D-Lk1)m-P基团中的每个来说，P为-P1-NH-，其中P1包含至少一个亚乙基或乙二醇单元并且还包含至少一个分支单元，以使得所述缀合物中存在共计8个D-Lk1基团。又例如，缀合物可包含与两个((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基团键合的一个Ab基团，其中对于那些((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基团中的每个来说，Lk2是一个键，P是-P1-NH-，其中P1包含至少一个亚乙基或乙二醇单元并且还包含至少一个分支单元，并且每个Lk1包含一个与两个D基团键合的天冬氨酸或谷氨酸残基，以使得所述缀合物中存在共计8个D-Lk1基团。
不同的Lk3、Lk2、P、Lk1和D基团也可在相同的缀合物中存在，例如当缀合物包含一个与两个((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3基团键合的Ab基团时，在那些((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基团中的一个基团中，Lk2可为键，而在那些((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-基团中的另一个基团中，Lk2可为天冬氨酸或谷氨酸残基。类似地，当缀合物包含键合至一个Lk2基团上的多个(D-Lk1)m-P基团时，对于那些基团中的一个基团来说，P可为键，而对于那些基团中的另一个来说，P可为–P1-NH-。
在本发明的最简单的实施方案中，本发明涉及包含单个美登素部分(n＝m＝q＝p＝1)的缀合物。所述缀合物可包含最高达10个美登素部分，例如最高达8个美登素部分。它们可例如包含最高达4个(例如1、2、3或4个)美登素部分。当存在两个D基团时，这些可在例如具有下式的缀合物中：
其中Lk1优选地包含一个上述式(Va)、(Vd)或(Ve)的基团。
或者，当存在两个D基团时，这些可以在例如具有下式的缀合物中：
上述式显示了X通过存在于Ab中的一个二硫键的键合。抗体可包含最高达4个链间二硫键，而如果这些键中的每个都被带有单个美登素分子的试剂桥接，那么得到的缀合物的药物:抗体比例(DAR)将为4。如果一个带有两个美登素部分的试剂被用于桥接所有的4个二硫键，例如一个带有两个PE或PEG链或具有一个分支的PE或PEG链或具有一个分支的接头Lk1的试剂，那么DAR将会是8。具有如此高DAR的缀合物可具有明显的临床优势。其中Ab带有2、3或尤其4个拷贝的～X-基团的上述式Ia-Ie的缀合物形成本发明的一个优选的实施方案。
为方便起见，在本说明书的全文中使用的术语“结合蛋白”同时包括结合蛋白和肽，并且除了上下文另有明确要求之外，所述结合蛋白应该理解为包括肽以及蛋白质。可用于本发明的缀合物中的结合蛋白包括可用作针对靶标上的结合伴侣的结合试剂的任何蛋白质、多肽或肽。该靶标可为例如微生物、病毒或细胞(如癌细胞或免疫细胞)。因此结合蛋白的作用是将美登素靶向特定的靶标。这类结合蛋白的实例包括全长抗体、抗体片段、免疫球蛋白(Ig)和通过合理的或组合的蛋白质工程技术得到的非-Ig蛋白支架以及凝集素。在蛋白质-药物缀合物中使用的最常用的结合蛋白为抗体，并且除了当本文另有明确要求以外，任何对结合蛋白或基团Ab的提及，应该被理解为包括对抗体的具体提及。
在本说明书的全文中，术语“抗体”应该理解为意指通过在免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标抗原的免疫球蛋白分子，所述靶标抗原例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或它们的结合。术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体例如二特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白、以及任何其他经修饰的包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展示所需的生物活性。抗体可为五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中的任一种或其亚类(同种型)(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)，基于它们的分别称为α、δ、ε、γ和μ的重链恒定结构域的种类。不同类的免疫球蛋白具有不同的且众所周知的亚单位结构和三维构型。特别优选使用IgG1或IgG4。
此外，除了上下文另有要求，术语“抗体”应理解为涵盖全长抗体和包含全长抗体的抗原结合区域的抗体片段。抗体片段可为例如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、双抗体、微抗体(minibody)或由抗体片段形成的多特异性抗体，例如包含scFv片段或双抗体以及任选的Fc片段或CH结构域的不同排列的微抗体，例如scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、Fab-scFv、(Fab’ScFv)2、单链双抗体(scDiabody)、scDiabody-Fc、scDiabody-CH3、scFv-CH3、scFv-CH2-CH3融合蛋白等等。抗体片段可通过酶切割、合成或重组技术制备。
结合蛋白可用作针对靶标表面上的受体、抗原或其他部分的结合试剂，所述靶标为例如与增殖性、自身免疫性或感染性疾病相关的细胞或病毒。例如，结合蛋白可为特异性结合癌细胞的细胞表面抗原的抗体。用于癌细胞的抗体靶向的细胞表面抗原的鉴定和验证方法是已知的，例如Carter P,et al.,Endocr.Relat.Cancer.2004Dec；11(4)：659-87，并且许多用于治疗癌症的抗体-药物缀合物目前正处于临床开发中。可用于治疗癌症的抗体以及特定癌症的肿瘤标志物的实例也是本技术领域中众所周知的并且可被使用。或者，靶标可为免疫细胞，例如负责生成自身免疫性抗体的细胞或与自身免疫性疾病相关的活化的淋巴细胞。在其他实施方案中，靶标可为与微生物或病毒感染或疾病相关的微生物或病毒。
本发明的缀合物可通过还原结合蛋白质中的一个或多个二硫键并随后与以下通式的缀合试剂反应而制备：
((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3a         (VIII)
其中D、Lk1、P、Lk2和m、p和q具有针对通式I给出的含义，并且Lk3a代表具有下式的基团：
-CO-Ph-Xa-Ya     (IX)
其中Ph具有上文给出的含义，Xa代表一个CO基团，以及Ya代表以下基团：
其中A和B具有上文给出的含义，每个L独立地代表一个离去基团，并且x代表1-4的整数。
上式X、XI、XII和XIII的基团是彼此的化学等价物，并且式X和XI的基团与抗体的二硫键生成单个碳桥，以及式XII和XIII的基团生成更长的碳桥，下面示出了当n＝1时的情况：
当包含基团X或XII的缀合试剂与抗体反应时，在反应途径中的紧邻步骤是失去一个离去基团L而分别产生包含基团XI或XIII的缀合试剂。因此，式XI或XIII的缀合试剂为原位制备或者从头开始使用。使用包含X、XI、XII或XIII基团中的任一个的缀合试剂的一个关键特点是：α-亚甲基离去基团和双键与用作迈克尔活化(Michael activating)部分的吸电子官能团交叉缀合。如果离去基团倾向于在交叉功能(cross-functional)试剂中消除而不是直接置换并且吸电子基团是合适的用于迈克尔反应的活化部分，那么可通过连续的迈克尔和逆迈克尔反应发生相继的分子内的双-烷基化作用。离去部分的作用是掩蔽潜在的缀合双键，所述缀合双键直至第一次烷基化发生之后才暴露，双烷基化是相继的交互式迈克尔和逆迈克尔反应导致的。最佳地选择吸电子基团和离去基团，以使得可通过相继的迈克尔和逆迈克尔反应而发生双烷基化。也可以用缀合至双键上的或在离去基团和吸电子基团之间的额外多重键来制备交叉官能烷基化试剂。
离去基团L可代表例如–SR4、-SO2R4、-OSO2R4、-N+R4 3、-N+HR4 2、-N+H2R4、卤素或其中R4具有上文给出的含义，并且代表包含至少一个吸电子取代基的取代的芳基、尤其是苯基基团，所述吸电子取代基例如-CN、-NO2、-CO2R4、-COH、-CH2OH、-COR4、-OR4、-OCOR4、-OCO2R4、-SR4、-SOR4、-SO2R4、-NHCOR4、-NR4COR4、-NHCO2R4、-NR4CO2R4、-NO、-NHOH、-NR4OH、-C＝N-NHCOR4、-C＝N-NR4COR4、-N+R4 3、-N+HR4 2、-N+H2R4、卤素(尤其是氯或尤其是氟)、-C≡CR4、-C＝CR4 2和–C＝CHR4，其中每个R4独立地具有上文给出的含义之一。尤其优选的离去基团L为–SR4或-SO2R4，尤其是-SO2R4，其中R4代表苯基或者，尤其是甲苯磺酰基基团。因此，特别优选的基团Ya为：
优选的缀合试剂的实例包括：
其中Lk1优选地包含如上所述的式(Va)、(Vd)或(Ve)的基团，并且其中Ya优选地为式(XII)的基团，尤其是其中A和B中均为–CH2-。
其他优选的缀合试剂的实例包括：
其中Ya优选地为式(XII)的基团，尤其是其中A和B均为-CH2-。
使用上述试剂之一的缀合方法的直接产物为美登素-抗体缀合物，其中X代表一个酮基基团CO。然而，本发明的方法在合适的条件下是可逆的。这对于某些应用是有利的，例如当需要将美登素从抗体中快速分离时，但是对于其他应用，可能不需要快速分离。因此，令人满意的是通过还原CO基团X生成CH.OH基团X来稳定该缀合物。因此，上述方法可包括一个额外的任选步骤：还原Lk3中的最初形成的CO基团X以生成Lk3中具有CH.OH基团X的缀合物。特别优选使用硼氢化物作为还原剂，所述硼氢化物例如硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化钾或三乙酰氧基硼氢化钠。其他可使用的还原剂包括例如氯化锡(II)、醇盐例如醇铝、和氢化铝锂。
适用于上述方法的反应条件在WO 2005/007197和WO 2010/100430中给出，其内容以引用的方式纳入本文。例如该方法可在所有的试剂都可溶于其中的溶剂中或溶剂混合物中进行。使得抗体可以在水性反应介质中与缀合试剂直接反应。该反应介质也可以是被缓冲的，这取决于亲核反应的pH需求。所述反应的最适pH一般为至少4.5，通常在约5.0与约8.5之间，优选约6.0至8.2。当然，最佳反应条件将取决于使用的具体反应剂。
在3-37℃之间的反应温度通常是合适的。在有机介质(例如THF、乙酸乙酯、丙酮)中进行的反应通常是在最高达室温的温度下进行。
结合蛋白可使用化学计算当量的或过量的试剂与所需试剂有效缀合。过量的试剂和产物可在常规纯化过程中容易地分离，例如通过标准色谱方法，如离子交换色谱法或尺寸排阻色谱法；渗滤；或者，当存在多组氨酸标签时，通过使用金属亲和色谱法进行分离，例如基于镍或锌的金属亲和色谱法。对结合蛋白中的特定二硫键的靶向可通过已知方法进行；例如通过蛋白质的部分还原，参见例如Liu et al，Anal.Chem.2010,82,5219-5226。
上述通式VIII的缀合试剂可通过使美登素与具有以下通式的化合物反应来制备：
((Lk1b)m-P)p-Lk2-Lk3a
其中m、P、L、p、Lk2和Lk3a具有针对通式VIII给出的含义并且Lk1b是被修饰以包括可与存在于美登素中的基团反应的基团的式Lk1的基团。典型的基团和合适的反应是技术人员熟知的。
通式VIII的缀合试剂是新的，因此本发明提供这些试剂本身。在这些新的试剂中，Lk1、P、Lk2、m、p和q的优选的含义与针对上述通式中给出的含义相同。本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的美登素-蛋白质缀合物，以及可药用载体，以及任选的额外的治疗试剂；这类缀合物用于治疗，具体而言，用作治疗增生性、自身免疫性或感染性疾病(例如癌症)的药物；以及治疗患者的方法，其包括给予患者药学有效量的这类缀合物或药物组合物。本发明可用于的具体病症包括例如白血病(包括非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴细胞性白血病以及慢性骨髓性白血病)；胃癌；乳腺癌；卵巢癌；肝癌；肠癌；结肠癌；肾癌(例如肾细胞癌)；肺癌(例如小细胞肺癌)；黑素瘤；膀胱癌；以及肉瘤。
本发明的缀合物显示出许多重要的优点，这些优点的存在是不可预期的。与使用目前市售缀合物中使用的马来酰亚胺试剂制备的等同的药物-抗体缀合物相比较，它们显示出显著提高的稳定性。此外，与使用马来酰亚胺相比，它们的合成方法生产的产品在药物-抗体比例方面具有显著改善的均一性。由于对药品生产的规定，均一性对于药品是有利的。产生更高产率的单个DAR种类的方法凭借更高的效率将更廉价。通过将该DAR种类从异质性混合物中纯化而制备的单一DAR种类的药物产品在大量生产时成本会难以承受的高。
此外，单一DAR种类将表现出更加可预测的药代动力学、安全性、毒性和耐受性，因为所有药品都应该以类似的方式代谢，生成相同的产物，这与混合的DAR物质相反，其可被差异性代谢或以不同速率代谢，生成更加异质性的分解产物。
下述实施例阐明了本发明。
实施例1：具有末端双砜官能度的带有24个重复单元PEG的缬氨酸-丙氨酸-对氨基苄基-氨基己酸-美登素(val-ala-PAB-AHX-DM1)试剂1的合成。
步骤1：1-氧代-1-(4-(3-甲苯磺酰基-2-(甲苯磺酰基甲基)丙酰基)苯基)-PEG酸(双砜-PEG(24单元)-CO2H)的缀合
将O-(6-氯苯并三氮唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)(29mg)加入到双砜-PEG(24)-CO2H(75mg，使用Nat.Prot.,Vol1,No.4,2006的方法由NH2-PEG(24)-CO2H制备)的搅拌的无水二甲基甲酰胺(5.8mL)溶液中并搅拌20min。加入Val-ala-PAB-AHX-DM1(100mg，ConcortisBiosystems Corp.)并在30℃下搅拌反应混合物。24小时后，加入另一份量的HCTU(2mg)并在30℃下搅拌反应混合物。另外16小时后，真空下移除挥发性物质，并通过使用二氯甲烷-甲醇(97:3v/v+5滴AcOH/50mL溶剂，然后96:4v/v+5滴AcOH/50mL溶剂)洗脱的柱色谱法来纯化固体残余物，在真空下移除溶剂并分离出浅黄色油状的双砜-PEG(24)-val-ala-PAB-AHX-DM1 1(55mg)。m/z M+Na+2716；特征信号：1H NMR(600MHz CDCl3)1.28(6H,dd,缬氨酸CH(CH3)2),1.45(3H,d,丙氨酸CH-CH3)2.49(6H,s,CH3-Ar),3.45-3.75(m,PEG和CH2-Ts),5.62(1H,dd,C＝CH-CH-C＝CH),6.41(1H,dd,C＝CH-CH-C＝CH),6.65(2H,s,CH2-Ar),7.37(4H,d,Ts),7.63(2H,d,Ar),7.66(4H,d,Ts),7.85(2H,d,Ts)。
实施例2.具有末端双砜官能度的带有5kDa重复单元PEG的缬氨酸-丙氨酸-对氨基苄基-氨基己酸-美登素(val-ala-PAB-AHX-DM1)试剂2的合成。
步骤1:3-(2-(4-(3-甲苯磺酰基-2-(甲苯磺酰基甲基)丙酰基)苯基苯甲酰氨基)乙氧基)PEG酸(双砜-PEG(5kDa)-CO2H)的缀合
将1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)(10mg)加入到已知的双砜-PEG(5kDa)-CO2H(56mg，使用Nat.Prot.,Vol1,No.4,2006的方法由NH2-PEG(5kDa)-CO2H制备)的搅拌的无水二甲基甲酰胺(0.5mL)溶液中，加入val-ala-PAB-AHX-DM1(15.8mg,ConcortisBiosystems Corp.)的二甲基甲酰胺(0.5mL)溶液，然后加入N-甲基吗啉(4.4μL)，并在室温下搅拌反应混合物。24小时后，加入另一份量的HATU(10mg)和N-甲基吗啉(4.4μL)并在室温下搅拌反应混合物。另外19小时后，在真空下移除挥发性物质，并通过使用缓冲液A(水：5％乙腈：0.1％TFA，v/v)和缓冲液B(含0.1％TFA的乙腈，v/v)洗脱(100:0v/v至0:100)的反相C18柱色谱法来纯化固体残余物，真空下移除有机溶剂并通过冷冻干燥移除水性溶剂，并分离得到无色薄膜状的双砜-PEG(5kDa)-val-ala-PAB-AHX-DM1 2(10.6mg)。m/zM+Na+6380。
实施例3.双砜-PEG(24)-val-ala-PAB-AHX-DM1 1与抗体(曲妥珠单抗)的缀合
向5mg/mL抗体(2.25mg)的磷酸钠溶液(20mM，pH7.5，150mM NaCl和20mM EDTA)中加入5mM TCEP溶液(18μL)并将所得混合物在40℃下孵育1h。用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5，150mMNaCl和20mM EDTA)将还原的抗体溶液(0.468mL，4.8mg/mL)稀释至3.33mg/mL。向还原的抗体中加入双砜-PEG(24)-val-ala-PAB-AHX-DM1试剂1的DMF溶液(75μL，3.23mg/mL)，并混合所得到的溶液，在22℃下孵育22小时。通过加入50mMN-乙酰基-L-半胱氨酸(36μL)终止反应，并在22℃下再孵育1小时。使用5mL ZebaTM离心柱(Pierce)将最终的反应混合物(786μL)缓冲液交换至PBS×1中。通过使用TOSOH TSK-凝胶丁基-NPR柱的疏水作用色谱(HIC)分析反应混合物。该方法由下述线性梯度构成：在30分钟内从100％缓冲液A(50mM磷酸钠pH7.0,1.5M硫酸铵)至100％缓冲液B(50mM磷酸钠，pH7.0，20％异丙醇)。通过248和280nm处的紫外吸收进行检测。根据负载的药物的量分离物质(species)，并且根据248和280nm处的最大紫外吸收率进行表征。测定每种DAR变体的面积并将其绘制为棒状图，结果见于图1。主要产物为DAR＝4的缀合物(65％)。
实施例4.双砜-PEG(24)-val-ala-PAB-AHX-DM1试剂1与Fab的缀合
向2.59mg/mL Fab(5mg，源自对曲妥珠单抗的木瓜蛋白酶消化)的PBS溶液中加入19.3μL的1M DTT。该还原混合物在22℃下孵育1小时。在孵育后，使用5mL ZebaTM离心脱盐柱将该混合物的缓冲液交换到20mM磷酸钠(pH7.4，150mM NaCl和20mM EDTA)中。用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4，150mM NaCl和20mM EDTA)将还原的Fab溶液(1.9mL,2.58mg/mL)稀释至2.22mg/mL。向还原的Fab(2.12mL，2.22mg/mL)中加入双砜-PEG(24)-val-ala-PAB-AHX-DM1试剂1在50％DMSO和50％20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4，150mM NaCl和20mM EDTA)中的溶液(235μL，1.62mg/mL)，混合所得溶液，在22℃下孵育18小时。然后通过SDS-PAGE分析反应混合物。然后通过使用5mL HiTrapTM Phenyl HP HIC柱的制备型HIC纯化该缀合混合物。通过RP-HPLC(图2)和SDS-PAGE(图3)分析纯化的Fab-试剂1缀合物。RP-HPLC分析是在VariTide RPC250x4.6mm柱(Agilent Technologies)上进行，并且如图2中所示Fab-AHX-DM1缀合产物电泳出一个单独的主峰(以面积计为92％)，表明所述缀合物是高度同质性的。对于SDS-PAGE分析，样品在4-12％Bis-Tris凝胶上于MES电泳缓冲液中在200V下电泳35min。使用Sharp预染标准品作为蛋白质标记物。使用LDS样品缓冲液(4X)作为样品缓冲液并且将凝胶用InstantBlueTM蛋白质染色剂染色。通过ImageQuant LAS4000分析光密度，得到每个泳道的纯度读数，所述纯度在图4的凝胶上表示为百分数。每个泳道——即对于每个样品——上样1μg的样品(以Fab计)。图4中，标记为M的泳道为蛋白质标准品，标记为1的泳道为起始Fab，标记为2的泳道为用DTT处理后的起始Fab，标记为3的泳道为纯化的Fab-AHX-DM1缀合物，标记为4的泳道为纯化的用DTT处理后的Fab-AHX-DM1缀合物。Fab和缀合物两者均下用DTT以同样的方式处理，即在室温以10mM的最终DTT浓度处理1小时。
实施例5.通过体外细胞存活率测定分析抗体药物缀合物(ADC)
通过检测对过表达HER-2受体的癌细胞系的细胞生长的抑制作用来测定实施例3和4分别制备的抗体和Fab的缀合物的体外效力。
可通过在存在逐渐提高的药物或ADC浓度的情况下培养细胞系并使用CellTiter发光试剂(Promega Corp. Technical BulletinTB288；Lewis Phillips G.D,Cancer Res2008；68：9280-9290)对增殖或代谢活性的损失进行定量，来测量用细胞毒性药物或ADC进行体外处理后肿瘤细胞存活率的损失。该方案描述了细胞接种、药物处理和基于ATP合成测定以未处理的细胞作为参考的细胞存活率，所述ATP合成与存在于孔中的细胞数目直接相关。
使用3mL胰蛋白酶EDTA对HER2-阳性SK-BR-3和HER2-阴性MCF-7细胞进行胰蛋白酶消化5-15min。通过加入10mL完全培养基终止胰蛋白酶消化，并且将细胞转移至50mL Falcon管中。使用Neubauer血球计数器计数细胞并将MCF-7和SK-BR-3的细胞密度分别调整至3x104/mL和5x104/mL。将细胞接种至(100μL/孔)多聚-D-赖氨酸包被的不透明壁96孔板中并在37℃和5％CO2下孵育24小时。肿瘤细胞系SK-BR-3(ATCC-HTB-30)和MCF-7(ATCC-HTB-22)购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。SK-BR-3细胞培养在McCoy’s5A培养基10％胎牛血清、100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素中。MCF-7细胞培养在最小必需培养基10％胎牛血清、100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素中。用于细胞培养的方法来源于ATCC的产品信息表以及其中引用的参考文献，例如Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique by R.Ian Freshney，3rd edition，published by Alan R.Liss N.Y.1994，或5th edition published byWiley-Liss N.Y.2005。
使用相关细胞培养的培养基作为稀释剂，通过移液在96孔板的第3-10列中将ADC或游离药物(AHX-DM1)系列稀释(设三个重复)。使用2倍稀释液以40-0.018nM的药物浓度处理HER2-阳性细胞系SK-BR-3。使用3倍稀释液分别以200-0.1nM(游离AHX-DM1)或400-0.2nM(AHX-DM1缀合物)的药物浓度处理HER2-阴性细胞系MCF-7。然后在37℃和5％CO2下将细胞与药物(总体积200μL/孔)再孵育96小时。
使用Cell-Titer发光试剂按照制造商的说明书(PromegaCorp.Technical Bulletin TB288；Lewis Phillips G.D,Cancer Res 2008；68：9280-9290)中所述进行细胞存活率测定。为得到最佳发光信号，将例如细胞裂解和用发光试剂孵育的孵育时间分别延长至3分钟和20分钟。
使用平板读数器(plate reader)(例如MD Spectramax M3平板读数器)记录发光，随后使用四参数非线性回归模型分析数据。
图4.在SKBR-3或MCF-7细胞内对使用Fab-试剂1缀合物或抗体-试剂1缀合物进行的处理的细胞存活率响应
存活率表示为未处理细胞的％。％存活(Y-轴)是相对于单位为nM的药物浓度的对数(x-轴)绘制，以确定所有缀合物以及游离药物的IC50值。
如图4和表1所示，抗体-val-ala-PAB-AHX-DM1和Fab-val-ala-PAB-AHX-DM1缀合物二者都有效抑制了HER2-阳性SK-BR-3细胞的增殖。在HER2-阴性MCF-7细胞中，以测试浓度进行Fab-val-ala-PAB-AHX-DM1或抗体-val-ala-PAB-AHX-DM1处理后，没有观察到生长抑制，证实了所述缀合物的特异性。
表1
实施例6.试剂3的合成
步骤1:4-[2,2-双[(对甲苯磺酰基磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺基酯(双砜)与O-(2-氨基乙基)-O’-[2-(Boc-氨基)乙基]十聚乙二醇的缀合
将O-(2-氨基乙基)-O’-[2-(Boc-氨基)乙基]十聚乙二醇(SigmaAldrich)溶于二氯甲烷。在搅拌下，加入4-[2,2-双[(对甲苯磺酰基磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺基酯(Nature Protocols,2006,1(54),2241-2252)并在氩气气氛下搅拌混合物直到反应完成。在真空中移除挥发性物质并纯化残余物以得到4。
步骤2：Boc-保护基团的去保护。
向步骤1产物的搅拌的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸，搅拌所得溶液直到完成Boc去保护。在真空中移除挥发性物质并纯化残余物以得到5。
步骤3：DM1与6-马来酰亚氨己酸的缀合
搅拌溶于THF/水中的DM1(Widdison et al,J Med.Chem.,2006,49(14),p4392-4408),WO2009/134976)、6-马来酰亚氨己酸(SigmaAldrich)和磷酸钾缓冲液的混合物直到反应进行完全。在真空中移除挥发性组分并纯化残余物以得到4。
步骤4：5和6的反应
在室温下搅拌溶于DMF中的4、DMAP和EDCI的混合物30分钟。加入5，并搅拌该混合物直到反应进行完全。在真空中移除挥发性组分，并纯化残余物以得到3。

Claims (19)

1.一种具有以下通式的包含美登素的缀合物：
(((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3)n-Ab  (I)
其中D代表美登素部分；
q代表1至10的整数；
Lk1代表接头；
m代表1至10的整数；
P代表键或z-价基团-P1-NH-，其中z为2-11并且P1是包含至少一个亚乙基单元–CH2-CH2-或乙二醇单元-O-CH2-CH2-的基团；
p代表1至10的整数；
Lk2代表键或y-价接头，其中y为2-11并且其是由1至9个天冬氨酸和/或谷氨酸残基组成；
Lk3代表具有以下通式的接头：
-CO-Ph-X-Y-  (II)
其中Ph是任选地取代的苯基基团；X代表CO基团或CH.OH基团；并且Y代表具有下式的基团：
其中A和B中的每一个均代表C1-4亚烷基或亚烯基基团；
Ab代表能够结合靶标上的结合伴侣的结合蛋白或肽，所述结合蛋白或肽经由源自所述结合蛋白或肽中的二硫键的两个硫原子被键合至Lk3上；并且
n代表从1至s的整数，其中s是缀合至Lk3之前存在于所述结合蛋白或肽中的二硫键的数目；
选择m、n、p、q、y和z的含义使得所述缀合物包含1至10个D基团。
2.权利要求1所述的缀合物，其中所述美登素部分包含
3.前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中Lk1为可降解的接头。
4.权利要求3所述的缀合物，其中Lk1包括下述基团中一个：
其中R、R'、R”和R”'中的每一个均代表氢原子或烷基基团，并且AA代表蛋白酶特异性的氨基酸序列。
5.权利要求4所述的缀合物，其中Lk1包括：
6.权利要求1或权利要求2所述的缀合物，其中q为2至10的整数，并且Lk1为纳入一个或多个天冬氨酸或谷氨酸残基的多价接头。
7.权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中P代表键，或P代表–P1-NH-，其中P1包含2至10个乙二醇单元。
8.权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中P代表聚乙二醇。
9.权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中Lk3中的苯基基团Ph是未取代的。
10.权利要求1至9中任一项所述的缀合物，其中Y具有下式：
11.权利要求1至10中任一项所述的缀合物，其中Ab代表全长抗体或包含全长抗体的抗原结合区的抗体片段。
12.权利要求11所述的缀合物，其中Ab代表IgG1或IgG4或者IgG1或IgG4的片段。
13.一种制备权利要求1至12中任一项所述的缀合物的方法，其包括其包括还原结合蛋白中的一个或多个二硫键并随后与具有以下通式的缀合试剂反应：
((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3a  (VIII)
其中D、Lk1、P、Lk2和m、p和q具有权利要求1中给出的含义，并且Lk3a代表下式基团：
-CO-Ph-Xa-Ya  (IX)
其中Ph具有权利要求1中给出的含义，Xa代表CO基团，以及Ya代表下述基团：
其中A和B具有权利要求1中给出的含义，每个L独立地代表离去基团，并且x代表1至4的整数，从而制备其中X代表CO的式I缀合物；并且任选地还原所述最初形成的CO基团X以生成具有CH.OH基团X的缀合物。
14.权利要求13所述的方法，其中Ya代表：
15.一种具有以下通式的化合物：
((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3a  (VIII)
其中D具有权利要求1至3中任一项给出的含义；Lk1具有权利要求1和4至7中任一项给出的含义；P具有权利要求1、8和9中任一项给出的含义；Lk2、m、p和q具有权利要求1给出的含义，并且Lk3a代表具有下式的基团：
-CO-Ph-Xa-Ya  (IX)
其中Ph具有权利要求1或权利要求10给出的含义，Xa代表CO基团，并且Ya代表以下基团：
其中A和B具有权利要求1给出的含义，每个L独立地代表离去基团，并且x代表1至4的整数。
16.权利要求15中所述的化合物，其中Ya代表：
17.一种药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的载体，以及任选的额外的治疗试剂。
18.权利要求1至12中任一项所述的缀合物或权利要求17所述的组合物用于治疗。
19.一种治疗患者的方法，其包括给予患者药学上有效量的权利要求1至12中任一项所述的缀合物或权利要求17所述的药物组合物。
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