ES2652513T3 - Conjugados de fármaco proteínas - Google Patents

Conjugados de fármaco proteínas Download PDF

Info

Publication number
ES2652513T3
ES2652513T3 ES13783360.4T ES13783360T ES2652513T3 ES 2652513 T3 ES2652513 T3 ES 2652513T3 ES 13783360 T ES13783360 T ES 13783360T ES 2652513 T3 ES2652513 T3 ES 2652513T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
group
conjugate
linker
integer
maitansin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13783360.4T
Other languages
English (en)
Inventor
John Burt
Antony Godwin
Mark Frigerio
George Badescu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abzena UK Ltd
Original Assignee
Polytherics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Polytherics Ltd filed Critical Polytherics Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2652513T3 publication Critical patent/ES2652513T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5365—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Un conjugado que contiene maitansina de la fórmula general: **(Ver fórmula)** en en la que D representa una unidad estructural de maitansina; q representa un número entero de 1 a 10; Lk1 representa un enlazador; m representa un número entero de 1 a 10; P representa un enlace o un grupo z-valente -P1-NH- en el que z es de 2 a 11 y P1 es un grupo que contiene al menos una unidad de etileno -CH2-CH2- o unidad de etilenglicol -O-CH2-CH2-; p representa un número entero de 1 a 10; Lk2 representa un enlace o un enlazador y-valente en el que y es de 2 a 11 y que consiste en de 1 a 9 residuos de aspartato y/o glutamato; Lk3 representa un enlazador de la fórmula general: -CO-Ph-X-Y- (II) en la que Ph es un grupo fenilo opcionalmente sustituido; X representa un grupo CO o un grupo CH.OH; e Y representa un grupo de fórmula: **(Ver fórmula)** en las que cada uno de A y B representa un grupo C1-4 alquileno o alquenileno; Ab representa una proteína o péptido de enlace capaz de enlazarse a un compañero de enlace en un objetivo, dicha proteína o péptido de enlace se enlaza a Lk3 a través de dos átomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en 35 la proteína o péptido de enlace; y n representa un número entero de 1 a s en el que s es el número de enlaces disulfuro presentes en la proteína o péptido de enlace antes de la conjugación a Lk3; los significados de m, n, p, q, y y z se eligen de modo que el conjugado contenga de 1 a 10 grupos D.

Description

Conjugados de fármaco proteínas
La presente invención se refiere a nuevos conjugados de fármaco proteína.
La especificidad de las proteínas de enlace para marcadores específicos en la superficie de las células objetivo y moléculas ha llevado a su uso extenso como vehículos para una variedad de agentes de diagnóstico y terapéuticos. Por ejemplo, tales proteínas conjugadas a marcadores y grupos informadores tales como fluoróforos, radioisótopos y enzimas encuentran uso en aplicaciones de marcado e imagenología, mientras que la conjugación a agentes citotóxicos y fármacos de quimioterapia permite la administración dirigida de dichos agentes a tejidos o estructuras específicos, por ejemplo tipos de células particulares o factores de crecimiento, minimizando el impacto en el tejido sano normal y reduciendo significativamente los efectos secundarios asociados con los tratamientos de quimioterapia. Dichos conjugados tienen amplias aplicaciones terapéuticas potenciales en varias áreas de enfermedad, particularmente en el cáncer.
Los polímeros sintéticos solubles en agua, en particular los polialquileno glicoles, se usan ampliamente para conjugar moléculas terapéuticamente activas tales como ligandos de péptidos o de proteínas, incluyendo anticuerpos. Dichos conjugados terapéuticos han mostrado que alteran favorablemente la farmacocinética prolongando el tiempo de circulación y disminuyendo las ratas de aclaramiento, disminuyendo la toxicidad sistémica y, en varios casos, mostrando una mayor eficacia clínica. El proceso de conjugación covalente de polietilenglicol, PEG, a proteínas se conoce comúnmente como "PEGilación".
Es importante para la eficacia optimizada y para garantizar la consistencia de dosis a dosis que el número de unidades estructurales conjugadas por proteína de enlace sea el mismo, y que cada unidad estructural se conjugue específicamente al mismo residuo de aminoácido en cada proteína de enlace. En consecuencia, se han desarrollado una serie de métodos para mejorar la homogeneidad de dichos conjugados. Liberatore et al, Bioconj. Chem 1990, 1, 36-50, y del Rosario et al, Bioconj. Chem. 1990, 1, 51-59 describen el uso de reactivos que pueden usarse para entrecruzarse a través de los enlaces disulfuro en proteínas, incluidos los anticuerpos. El documento WO 2005/007197 describe un proceso para la conjugación de polímeros a proteínas, usando nuevos reactivos de conjugación que tienen la capacidad de conjugarse con ambos átomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en una proteína para dar nuevos conjugados de tioéter.
Las maitansinas son una clase de compuestos citotóxicos que incluyen la maitansina en sí, un producto naturalaislado del arbusto de África oriental Maytenus serrata, y compuestos relacionados conocidos como maitansinoides (por ejemplo, DM1, ansamitocina P-3). La maitansina y sus análogos son potentes compuestos dirigidos a microtúbulos que inhiben la proliferación de células en la mitosis. Sin embargo, debido a su citotoxicidad, la investigación se ha dirigido al desarrollo de conjugados que contienen maitansinas, con el objetivo de reducir los efectos secundarios/toxicidad, mejorar la administración de fármacos o mejorar la potencia. Por ejemplo, el documento WO2009/134976 divulga conjugados anticuerpo fármaco que contienen enlazadores hidrófilos que incorporan un espaciador de polietilenglicol, en el que el fármaco puede, entre otras posibilidades, ser un maitansinoide. El documento WO2011/039721 divulga maitansinoides y su uso para preparar conjugados con un anticuerpo. Khalili et al., Bioconjugate Chem. 2012, 23, 2262-2277 divulga un método para conjugar PEG a un fragmento de anticuerpo a través de un enlazador que comprende una unidad estructural -CO-Ph-CO-CH(CH2)2-y es capaz de bisalquilación a través de dos átomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en el fragmento de anticuerpo. Los conjugados de anticuerpo fármaco que contienen maitansinas, tales como trastuzumab emtansina (T-DM1), están actualmente en desarrollo para el tratamiento de diversas enfermedades, incluido el tratamiento del cáncer.
Dos conjugados de anticuerpos han recibido aprobación regulatoria: uno es brentuximab vedotina, en el que el fármaco es una auristatina, y uno es trastuzumab emtansina, en el que el fármaco es una maitansina. En ambos conjugados comercialmente disponibles, la unión del fármaco al anticuerpo utiliza un enlazador con base en maleimida. Las maleimidas se usan ampliamente en la conjugación de reactivos. Sin embargo, al igual que con muchos otros reactivos conjugados, el uso de maleimidas presenta una serie de dificultades: el control de la reacción de conjugación es difícil, lo que lleva a que los productos tengan baja homogeneidad y la estabilidad de los conjugados resultantes puede ser un problema.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de medios mejorados para la administración de maitansinas usando conjugados con buena estabilidad y homogeneidad, que se pueden preparar de manera eficaz, y que demuestran la eficacia requerida.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un conjugado que contiene maitansina que tiene la fórmula general:
en la que D representa una unidad estructural de maitansina; q representa un entero desde 1 a 10;
5 Lk1 representa un enlazador; m representa un número entero desde 1 a 10;
10 P representa un enlace o un grupo z-valente -P1-NH-donde z es desde 2 a 11 y P1 es un grupo que contiene al menos una unidad de etileno -CH2-CH2-o unidad de etilenglicol -O-CH2-CH2-; p representa un número entero desde 1 a 10; 15 Lk2 representa un enlace o un enlazador y-valente donde y es desde 2 a 11 y que consiste en desde 1 a 9 residuos de aspartato y/o glutamato; Lk3 representa un enlazador de la fórmula general:
en el que Ph es un grupo fenilo opcionalmente sustituido; X representa un grupo CO o un grupo CH.OH; y Y representa un grupo de fórmula:
en el que cada uno de A y B representa un grupo C1-4alquileno o alquenileno;
Ab representa una proteína o péptido de enlace capaz de enlazarse a una pareja de enlace en un objetivo, estando 30 dicha proteína de enlace enlazada a Lk3 a través de dos átomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en la proteína o péptido de enlace; y
n representa un número entero desde 1 a s donde s es el número de enlaces disulfuro presentes en la proteína o péptido de enlace antes de la conjugación a Lk3; 35 los significados de m, n, p, q, y y z se eligen de manera que el conjugado contenga desde 1 a 10 grupos D.
D representa una unidad estructural de maitansina (es decir, el grupo Lk1 está enlazado al residuo de una maitansina). El término maitansina incluye compuestos tales como maitansina en sí, maitansinoides tales como 1540 metoxiansamitocina P-3 y derivados de los mismos.
Preferiblemente, la maitansina es un compuesto que contiene la subestructura (A)
en el que X representa O o S; Ra representa hidrógeno o C1-4alquilo; Rb representa hidrógeno, hidroxi, C1-4alcoxi o C1-4alquiloC(O)O-; Rc representa hidrógeno, hidroxi, C1-4alcoxi o C1-4alquiloC(O)O-; Rd representa hidrógeno o C14alquilo; Re representa halógeno o hidrógeno, y Rf representa hidrógeno o C1-4alquilo.
5 Preferiblemente X representa O. Preferiblemente Ra representa C1-4alquilo, especialmente metilo. Preferiblemente Rb representa hidrógeno. Preferiblemente Rc representa hidrógeno o metoxi, más preferiblemente hidrógeno. Preferiblemente Rd representa C1-4alquilo, especialmente metilo. Preferiblemente Re representa cloro o hidrógeno, especialmente cloro. Preferiblemente Rf representa C1-4alquilo, especialmente metilo.
10 Más preferiblemente, la maitansina comprende una subestructura (B)
en la que X y Ra-Rf tienen los significados establecidos anteriormente. Aún más preferiblemente, la maitansina comprende la subestructura (C) o (D)
más preferiblemente (C).
En algunas realizaciones preferidas, la maitansina incluye el siguiente grupo (E) enlazado al átomo de carbono del 25 éster carbonilo de la subestructura (A), (B), (C) o (D):
Por ejemplo, la maitansina puede comprender la subestructura (F):
En algunas realizaciones preferidas, la maitansina incluye uno de los siguientes grupos enlazados al átomo de éster de carbono de carbonilo de la subestructura (A), (B), (C) o (D):
15 En algunas realizaciones preferidas, la maitansina contiene un grupo (L) enlazado al átomo de éster de carbono de carbonilo de la subestructura (A), (B), (C) o (D):
20 Ejemplos de maitansinas preferidas específicas incluyen:
5y
(15-metoxiansamitocina P-3)
Lk1 puede enlazarse a la unidad estructural de maitansina en cualquier punto adecuado. Donde la unidad estructural 10 de maitansina corresponde a un grupo (E) que comprende maitansina, Lk1 puede, por ejemplo, enlazarse al átomo de nitrógeno del grupo (E), por ejemplo:
Lk1 es un enlazador, un enlace o un grupo que conecta una unidad estructural D de maitansina a un grupo P. Puede llevar de 1 a 10 grupos D. Lk1 preferiblemente contiene un grupo degradable, es decir, Lk1 es preferiblemente un
5 enlazador que se rompe bajo condiciones fisiológicas, separando D de Ab. Alternativamente, Lk1 puede ser un enlazador que no se puede escindir bajo condiciones fisiológicas. Donde Lk1 es un enlazador que se rompe bajo condiciones fisiológicas, es preferiblemente escindible bajo condiciones intracelulares. Donde el objetivo es intracelular, preferiblemente Lk1 es sustancialmente insensible a condiciones extracelulares (es decir, de modo que no se prohíba la administración al objetivo intracelular de una dosis suficiente del agente terapéutico).
10 Donde Lk1 es un enlazador degradable, puede contener un grupo que sea sensible a las condiciones hidrolíticas. Lk1 puede contener un grupo que se degrada a ciertos valores de pH (por ejemplo, condiciones acídicas). Las condiciones hidrolíticas/acídicas pueden encontrarse, por ejemplo, en endosomas o lisosomas. Los ejemplos de grupos susceptibles a hidrólisis bajo condiciones acídicas incluyen hidrazonas, semicarbazonas,
15 tiosemicarboazonas, amidas cis-acotínicas, ortoésteres y cetales. Los ejemplos de grupos susceptibles a condiciones hidrolíticas incluyen:
20 En una realización preferida, Lk1 es o incluye
Por ejemplo, Lk1 puede ser:
en cuyo caso está preferiblemente enlazado a los grupos D y P como se muestra:
En esa realización, la unidad estructural de maitansina D está preferiblemente enlazada a través del átomo de nitrógeno del grupo (E), por ejemplo:
Lk1 también puede ser susceptible a la degradación bajo condiciones reductoras. Por ejemplo, Lk1 puede contener 10 un grupo disulfuro que se puede escindir en la exposición a agentes reductores biológicos, tales como tioles. Ejemplos de grupos disulfuro incluyen:
15 en la que R, R', R" y R''' son cada uno hidrógeno o C1-4alquilo de manera independiente. En una realización preferida Lk1 es o incluye
20 Por ejemplo, Lk1 puede ser
o
en cuyo caso Lk1 está preferiblemente enlazado a grupos D y P como se muestra:
En esas realizaciones, la unidad estructural de maitansina D está preferiblemente enlazada a través del átomo de nitrógeno del grupo (E), por ejemplo,
Lk1 también puede contener un grupo que es susceptible a la degradación enzimática, por ejemplo, puede ser
20 susceptible a la escisión por una proteasa (por ejemplo, una proteasa lisosomal o endosomal) o peptidasa. Por ejemplo, Lk1 puede contener un grupo peptidilo que comprende al menos uno, por ejemplo al menos dos o al menos tres residuos de aminoácidos (por ejemplo, Phe-Leu, Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Cit, Phe-Lys). Por ejemplo, Lk1 puede ser una cadena de aminoácidos que tiene desde 1 a 5, por ejemplo 2 a 4, aminoácidos. Otro ejemplo de un grupo susceptible a la degradación enzimática es:
en el que AA representa una secuencia de aminoácidos específica de proteasa, tal como Val-Cit. En una realización preferida, Lk1 es o incluye:
Por ejemplo, Lk1 puede ser
en cuyo caso está preferiblemente enlazado a los grupos D y P como se muestra a continuación
En esa realización, la unidad estructural D de maitansina está preferiblemente enlazada a través del átomo de nitrógeno del grupo (E).
20 En una realización, Lk1 porta una única unidad estructural D de maitansina (es decir, q=1). Los enlazadores específicos (Va), (Vd) y (Ve) mostrados anteriormente son de este tipo. En otra realización, q es mayor que 1, por
ejemplo 2, 3 o 4, y Lk1 se usa como un medio para incorporar más de una unidad estructural de maitansina en un conjugado de la invención. En una realización, esto puede lograrse mediante el uso de un enlazador de ramificación Lk1, que puede, por ejemplo, incorporar un aspartato o un glutamato o un residuo similar. Esto introduce un elemento ramificado de fórmula:
en la que b es 1, 2 o 3, b=1 siendo aspartato y b=2 siendo glutamato, y b=3 representando una realización preferida. Cada una de las unidades estructurales de acilo en la fórmula VI puede estar acoplado a un grupo D a través de un
10 enlazador adecuado Lk1a, donde Lk1a es cualquier enlazador adecuado, por ejemplo un enlazador degradable que incorpora uno de los enlaces mencionados anteriormente para Lk1. En realizaciones particulares, Lk1a representa el grupo (Va), (Vd) o (Ve) mostrado anteriormente. El grupo amino del aspartato o glutamato o residuo similar se puede enlazar a P mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, el enlace puede ser a través de un enlace de amida, por ejemplo, el grupo de ramificación anterior se puede conectar a P mediante un grupo -CO.CH2-, de este modo:
Si se desea, el aspartato o el glutamato o un residuo similar se pueden acoplar a más aspartato y/o glutamato y/o residuos similares, por ejemplo:
y así sucesivamente, hasta un máximo de 9 de tales residuos, lo que da el potencial de incorporar hasta 10 grupos
D. Como anteriormente, cada D se puede unir a un aspartato/glutamato o un residuo similar a través de cualquier 25 enlazador adecuado Lk1a.
Dependiendo de la estructura del conjugado de fórmula (I), puede existir en forma de una base libre o ácido libre, en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, y/o como un solvato.
30 Donde P representa un grupo -P1-NH-, P1 contiene al menos una unidad de etileno o etilenglicol (-CH2-CH2-o -O-CH2-CH2-). Si están presentes muchas de estas unidades, P1 representa polietileno, PE o polietilenglicol, PEG. Estos polímeros pueden contener una sola cadena lineal, o pueden tener una morfología ramificada compuesta de muchas cadenas pequeñas o grandes, en cuyo caso contendrán grupos de ramificación, que típicamente contienen >CH-, como por ejemplo en -(CH2CH2)2-CH-o -(O-CH2-)2CH-. Opcionalmente pueden derivatizarse o funcionalizarse
35 de cualquier manera deseada. Por ejemplo, pueden transportar un agente terapéutico adicional o un agente marcador. Los conjugados multiméricos que contienen más de una molécula de agente terapéutico, por ejemplo, más de una molécula de una maitansina, o una molécula de un agente terapéutico además de una molécula de una
maitansina, pueden dar como resultado beneficios sinérgicos y aditivos. Donde P1 representa PE o PEG, el peso molecular óptimo del polímero dependerá, por supuesto, de la aplicación prevista. Generalmente, donde P1 representa PE, se prefiere que el número de peso molecular promedio sea de hasta 2kDa, preferiblemente hasta 1kDa. Donde P1 representa PEG, se pueden usar pesos moleculares más elevados, por ejemplo, el número de peso molecular promedio puede ser de hasta 75kDa, por ejemplo hasta 60kDa, siendo el peso molecular medio numérico mínimo, por ejemplo, al menos 0,5kDa, por ejemplo al menos 1kDa, por ejemplo 2kDa. En una realización preferida, se puede usar PEG de peso molecular promedio numérico de 0,5 a 2kDa. Sin embargo, en algunas realizaciones preferidas, P puede ser un enlace, o P puede representar -P1-NH-en el que P1 contiene un pequeño número de unidades discretas de etileno o etilenglicol, por ejemplo desde 2 a 10, por ejemplo 2 o 3, etileno o, preferiblemente, unidades de etilenglicol.
Si se desea que el conjugado de fórmula I contenga más de una cadena -(CH2-CH2)a-o -(O-CH2-CH2)a-(donde a es el número de unidades de etileno o etilenglicol en cualquier cadena lineal), por ejemplo, de modo que cada cadena de este tipo pueda llevar un grupo Dq-Lk1, esto puede lograrse mediante el enlace de más de una (es decir, desde 2 a 10) cadenas de este tipo a Lk2 o mediante el uso de un PE o PEG ramificado, en cuyo caso solo un grupo P se unirá a Lk2, pero esto contendrá más de una rama, por ejemplo, desde 1 a 9 ramas (proporcionando desde 2 a 10 puntos de unión para grupos D-Lk1).
Se entenderá que donde P es -P1-NH-, el o cada grupo P está acoplado a los grupos adyacentes Lk1 y/o Lk2 a través de un enlace amida. Por ejemplo, el PEG (que normalmente termina con un grupo -OH) se puede convertir en la amina de PEG correspondiente, que termina con un grupo -NH2, para la formación de enlaces de amida con un grupo -CO2 en, por ejemplo, Lk2; o el grupo OH se puede hacer reaccionar para formar un enlace -NH.CO.CH2.Ocon Lk1 como se describe anteriormente.
En una realización preferida de la invención, P1 representa PEG, un polímero sintético soluble en agua, y a lo largo de esta memoria, excepto donde el contexto requiere lo contrario, cualquier referencia general a P1 debe entenderse que incluye una referencia específica a PEG.
Lk2 representa un enlazador y-valente donde y es desde 2 a 11. Por lo tanto, es capaz de enlazar desde 1 a 10 grupos P o Lk1. En su forma más simple, Lk2 es un enlace, en cuyo caso Lk1 está enlazado directamente a un grupo -P1-NH-o, si P es un enlace, a un grupo D-Lk1. Sin embargo, Lk2 se puede usar como un medio para incorporar más de un grupo D (unidad estructural de maitansina) en los conjugados de la invención. Esto se logra acoplando un residuo de aspartato o glutamato al grupo -CO-de Lk3 a través de un enlace de amida (por ejemplo, haciendo reaccionar el grupo aspartato o grupo glutamato amina con un derivado de ácido carboxílico adecuado correspondiente a Lk3). Esto introduce un elemento de ramificación de la fórmula VI que se muestra arriba. En ese caso, cada una de las unidades estructurales acilo puede acoplarse a un grupo -P1-NH-a través de un enlace de amida, o cuando P es un enlace, a un grupo D-Lk1. Alternativamente, el residuo de aspartato o de glutamato se puede acoplar a residuos adicionales de aspartato y/o glutamato, como se muestra en las fórmulas VIIa y VIIb mostradas anteriormente, y así sucesivamente, hasta un máximo de 9 residuos de este tipo, que dan la posibilidad de incorporar hasta 10 grupos D a través del enlace de múltiples grupos D-Lk1-P en diferentes puntos de unión en Lk2. Se entenderá que la valencia de Lk2 está asociada con el número de grupos D-Lk1-P presentes. Por ejemplo, cuando P es -P1-NH-, para cada grupo D-Lk1-P, la valencia de Lk2 está asociada con el número de grupos -P1-NHpresentes, es decir, p será igual a y-1. Cuando P es un enlace, para cada grupo D-Lk1-P, la valencia de Lk2 está asociada con el número de grupos D-Lk1 presentes, es decir, m será igual a y-1.
Lk3 es un enlazador específico capaz de enlazarse a una proteína de enlace a través de dos grupos de azufre derivados de un enlace disulfuro en la proteína de enlace. En Lk3, el grupo fenilo Ph puede estar no sustituido o sustituido. Los sustituyentes que pueden estar presentes opcionalmente en el grupo fenilo Ph incluyen, por ejemplo, uno o más de los mismos o diferentes sustituyentes seleccionados entre alquilo (preferiblemente C1-4alquilo, especialmente metilo, opcionalmente sustituido por OH o CO2H), -CN, -NO2, -CO2R4, -COH, -CH2OH, -COR4, -OR4, -OCOR4, -OCO2R4, -SR4, -SOR4, -SO2R4,-NHCOR4, -NR4COR4, NHCO2R4, -NR4.CO2R4, -NO, -NHOH, -NR4.OH, C=N-NHCOR4, -C=N-NR4.COR4, -N+R43, -N+H3, -N+HR42, -N+H2R4, halógeno, por ejemplo flúor o cloro, -C=CR4, C=CR42 y -C=CHR4, en el que cada R4 representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (preferiblemente C1-6alquilo), arilo (preferiblemente fenilo) o alquil-arilo (preferiblemente C1-6alquilo-fenilo). La presencia de sustituyentes de extracción de electrones es especialmente preferida. Los sustituyentes preferidos incluyen, por ejemplo, -NO2, -OR4, -OCOR4, -SR4, -NHCOR4, -NR.COR4, -NHOH y -NR4.COR4. Preferiblemente, sin embargo, el grupo fenilo Ph no está sustituido.
Cuando Y representa el grupo III, se forma un único puente de carbono entre el enlazador Lk3 y dos átomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en la proteína de enlace Ab, y cuando Y representa el grupo IV, la naturaleza de los grupos A y B determina la longitud del puente que se forma entre el enlazador Lk3 y dos átomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en la proteína de enlace Ab. Preferiblemente, se forma un puente de 3 carbonos, es decir, preferiblemente Y tiene la fórmula:
Como se mencionó anteriormente, los conjugados que contienen más de una unidad estructural de maitansina pueden tener ventajas. La presencia de más de una unidad estructural de maitansina puede lograrse de varias formas diferentes, por ejemplo como se describe anteriormente mediante el uso de un PEG ramificado, mediante el uso de un grupo multivalente Lk2, o mediante el uso de un grupo multivalente Lk1. Sin embargo, también se puede lograr uniendo más de un enlazador Lk3 a la proteína de enlace Ab. En general, los anticuerpos normales de longitud completa tienen 4 enlaces disulfuro intercadena (cadena pesada-pesada o cadena pesada-ligera para anticuerpos IgG1 completos), y cualquiera o todos estos pueden unirse por un puente mediante el enlazador Lk3 de acuerdo con la invención. También se prevé que uno o más enlaces disulfuro intracadena en el anticuerpo se unir por un puente mediante un enlazador Lk3. Donde hay más de un grupo conjugado presente, n es mayor que 1. n puede ser, por ejemplo, 2, 3 o 4.
Alternativamente o además, pueden estar presentes una o más unidades estructurales de maitansina adicionales enlazadas a través de un enlazador Lk1 a P o, donde P es un enlace, directamente a Lk2. En este caso, m es mayor que 1, por ejemplo, 2, 3 o 4, hasta un máximo de 10. Si hay más de un enlazador Lk1 presente, estos pueden ser iguales el uno al otro o diferentes.
Alternativamente o además, pueden estar presentes una o más unidades estructurales de maitansina adicionales unidos a un enlazador multivalente Lk1. En este caso, q es mayor que 1, por ejemplo, 2, 3 o 4, hasta un máximo de
10.
Se considera que los conjugados de la presente invención pueden transportar hasta 10 grupos D (unidades estructurales de maitansina). Donde se desee que el conjugado de fórmula I contenga más de un grupo D (es decir, más de una unidad estructural de maitansina), esto puede lograrse de una de varias maneras. Por ejemplo, múltiples grupos (((Dq-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3) pueden enlazarse a un solo anticuerpo (es decir, n es desde 2 a s). Este modo de unión forma una manera preferida de proporcionar conjugados que contienen más de un grupo D. Una segunda forma preferida de proporcionar conjugados que contienen más de un grupo D es mediante el uso de un enlazador multivalente Lk1, por ejemplo, un enlazador Lk1 que contiene uno o más aspartato y/o glutamato o residuos similares como se describe anteriormente (como, por ejemplo, en las fórmulas VI, VIIa y VIIb), lo que permite la presencia de múltiples grupos D (es decir, q es desde 2 a 10). Se cree que los conjugados en los que Lk1 es un enlazador multivalente, especialmente uno que incluye la fórmula VI anterior, p=1, q=2, m=1 y Lk2 es un enlace, son particularmente eficaces, y dichos conjugados forman una realización preferida de la invención.
Alternativamente o además, donde Lk2 es un grupo que consta de desde 1 a 9 residuos de aspartato y/o glutamato, pueden enlazarse múltiples grupos ((Dq-Lk1)m-P)-en diferentes posiciones en el grupo Lk2 (es decir, p es desde 2 a 10), mediante enlace de amida de cada grupo a través de una unidad estructural de amina con un grupo carboxilo de un aspartato o residuo de glutamato en el grupo Lk2. Donde P1 contiene al menos una unidad de etileno o etilenglicol y también contiene al menos una unidad de ramificación, pueden enlazarse adicionalmente o alternativamente múltiples grupos (Dq-Lk1)-en diferentes posiciones en el grupo P1 (es decir, m es desde 2 a 10).
También se divulgan conjugados que tienen combinaciones de los anteriores. A modo de ejemplo, un conjugado puede contener un grupo Ab enlazado a dos grupos ((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-en los que, para cada uno de esos grupos ((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-, Lk2 es un aspartato o residuo de glutamato enlazado a dos grupos (D-Lk1)m-P, y en el que, para cada uno de esos grupos (D-Lk1)m-P, P es -P1-NH-en el que P1 contiene al menos una unidad de etileno o etilenglicol y también contiene al menos una unidad de ramificación, de modo que en total 8 grupos D-Lk1 están presentes en el conjugado. A modo de ejemplo adicional, un conjugado puede contener un grupo Ab enlazado a dos grupos ((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-en los que, para cada uno de esos grupos ((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-, Lk2 es un enlace, P es -P1-NH-en el que P1 contiene al menos una unidad de etileno o etilenglicol y también contiene al menos una unidad de ramificación, y cada Lk1 contiene un residuo de aspartato o glutamato enlazado a dos grupos D, de modo que en total 8 grupos D-Lk1 están presentes en el conjugado.
También pueden estar presentes diferentes grupos Lk3, Lk2, P, Lk1 y D en el mismo conjugado, por ejemplo, donde un conjugado contiene un grupo Ab enlazado a dos ((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3 grupos, en uno de aquellos grupos ((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-Lk2 puede ser un enlace y en el otro de esos grupos ((D-Lk1)m-P)p-Lk2-Lk3-Lk2 puede ser un aspartato o un residuo de glutamato. De manera similar, donde un conjugado contiene múltiples grupos (D-Lk1)m-P enlazados a un grupo Lk2, para uno de esos grupos P puede ser un enlace, y para otro de esos grupos P puede ser -P1-NH-. En su realización más simple, la invención se refiere a conjugados que contienen una sola unidad estructural de maitansina (n=m=q=p=1). Los conjugados pueden contener hasta 10 unidades estructurales de maitansina, por ejemplo hasta 8 unidades estructurales de maitansina. Estos pueden contener, por ejemplo, hasta 4, por ejemplo 1, 2, 3 o 4, unidades estructurales de maitansina. Donde dos grupos D están presentes, estos pueden estar, por ejemplo, en conjugados de las fórmulas:
o
en la que Lk1 comprende preferiblemente un grupo de fórmula (Va), (Vd) o (Ve) como se describió anteriormente.
10 Alternativamente, donde están presentes dos grupos D, estos pueden estar, por ejemplo, en conjugados de las fórmulas:
15 o
Las fórmulas anteriores muestran el enlace de X a través de uno de los enlaces disulfuro presentes en Ab. Los anticuerpos pueden contener hasta 4 enlaces disulfuro entre cadenas, y si cada uno de estos enlaces se une por un puente mediante un reactivo que lleva una única molécula de maitansina, el conjugado resultante tendrá una proporción fármaco:anticuerpo (DAR) de 4. Si un reactivo que lleva dos moléculas de maitansina se usa para unir por medio de un puente los 4 enlaces disulfuro, por ejemplo un reactivo que lleva dos cadenas de PE o PEG o que tiene una cadena de PE o PEG ramificada o que tiene un enlazador ramificado Lk1, entonces el DAR será 8. Los conjugados que tienen tales DARs pueden tener ventajas clínicas significativas. Los conjugados de las fórmulas anteriores Ia-Ie, pero en los que Ab lleva 2, 3 o, especialmente, 4, copias del grupo ~X-, forman una realización preferida de la invención.
Por conveniencia, el término "proteína de enlace" se usa en la presente memoria para incluir tanto proteínas de enlace como péptidos, y excepto donde el contexto específicamente requiere otra cosa, se debe entender que incluye péptidos así como también proteínas. Las proteínas de enlace que pueden usarse en los conjugados de la invención incluyen cualquier proteína, polipéptido o péptido que pueda servir como un agente de enlace para un compañero de enlace en un objetivo. El objetivo puede ser, por ejemplo, un microorganismo, un virus o una célula, por ejemplo, un cáncer o una célula inmune. La proteína de enlace por lo tanto actúa para tener como objetivo la maitansina al objetivo particular. Los ejemplos de tales proteínas de enlace incluyen anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos, inmunoglobulina (Ig) y estructuras de armazón de proteína no Ig obtenidas mediante técnicas de ingeniería de proteínas racionales o combinatorias y lectinas. Las proteínas de enlace más comunes utilizadas en los conjugados proteína fármaco son anticuerpos, y cualquier referencia a una proteína de enlace o al grupo Ab debería, salvo que el contexto específicamente requiera otra cosa, entenderse que incluye una referencia específica a un anticuerpo. En la presente memoria, el término "anticuerpo" debe entenderse como una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se enlaza específicamente a un antígeno objetivo, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinación de los mismos a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. El término "anticuerpo" abarca anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una porción de determinación de antígeno de un anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno siempre que los anticuerpos muestren la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser de cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de los mismos (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2), con base en la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada que se denominan alfa, delta, epsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades diferentes y bien conocidas y configuraciones tridimensionales. El uso de IgG1 o IgG4 es particularmente preferido.
Además, excepto donde el contexto requiera otra cosa, el término "anticuerpo" debe entenderse que abarca los anticuerpos de longitud completa y los fragmentos de anticuerpo que comprenden una región de enlace a antígeno del anticuerpo de longitud completa. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, diacuerpos, minicuerpos o anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo, por ejemplo minicuerpos compuestos de diferentes permutaciones de fragmentos scFv o diacuerpos y opcionalmente fragmentos Fc o dominios CH, tales como scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, Fab-scFv, (Fab'ScFv)2, scDiacuerpos, scDiacuerpo-Fc, scDiacuerpo-CH3, scFv-CH3, scFv-CH2-CH3 proteínas de fusión y demás. Se puede producir un fragmento de anticuerpo mediante técnicas de escisión enzimática, sintética o recombinante.
Una proteína de enlace puede servir como un agente de enlace para un receptor, antígeno u otra unidad estructural en la superficie de un objetivo, por ejemplo, una célula o virus asociados con una enfermedad proliferativa, autoinmune o infecciosa. Por ejemplo, la proteína de enlace puede ser un anticuerpo que se enlaza específicamente a un antígeno de superficie celular en una célula cancerosa. Se conocen métodos de identificación y validación de antígenos de superficie celular para anticuerpos dirigidos a células cancerosas, por ejemplo, en Carter P, et al., Endocr. Relat. Cáncer. 2004 Dec; 11(4):659-87, y una serie de conjugados anticuerpo fármaco para tratar el cáncer están actualmente en desarrollo clínico. Ejemplos de anticuerpos disponibles para el tratamiento del cáncer, y marcadores tumorales de cánceres específicos, también son bien conocidos en la técnica y se pueden usar. Alternativamente, el objetivo puede ser una célula inmune, por ejemplo una célula que es responsable de producir anticuerpos autoinmunes, o un linfocito activado que está asociado con una enfermedad autoinmune. En otras realizaciones, el objetivo puede ser un microorganismo o virus asociado con una infección o enfermedad microbiana
o viral.
Los conjugados de la presente invención se pueden preparar reduciendo uno o más enlaces disulfuro en una proteína de enlace y reaccionando a continuación con un reactivo de conjugación de la fórmula general:
en la que D, Lk1, P, Lk2 y m, p y q tienen los significados dados para la fórmula general I, y Lk3a representa un grupo de fórmula:
en el que Ph tiene el significado dado anteriormente, Xa representa un grupo CO, y Ya representa un grupo:
o
en el que A y B tienen los significados dados anteriormente, cada L representa independientemente un grupo saliente, y x representa un número entero desde 1 a 4.
15 Los grupos de fórmulas X, XI, XII y XIII anteriores son equivalentes químicos entre sí, con grupos de fórmula X y XI que conducen a un solo puente de carbono a través de un enlace disulfuro del anticuerpo, y grupos de fórmula XII y XIII que conducen a puentes de carbono más largos, que se muestran a continuación para el caso donde n=1:
20 Cuando se hace reaccionar un reactivo de conjugación que contiene un grupo X o XII con un anticuerpo, la etapa inmediata en la ruta de reacción es la pérdida de un grupo saliente L que conduce a un reactivo de conjugación que contiene un grupo XI o XIII, respectivamente. Por lo tanto, los reactivos de conjugación de fórmula XI o XIII se preparan in situ, o se usan ab initio. Una característica clave del uso de reactivos de conjugación que contienen
25 cualquiera de los grupos X, XI, XII o XIII, es que un grupo saliente de α-metileno y un doble enlace se conjugan cruzadamente con una función de extracción de electrones que sirve como una unidad estructural activadora de Michael. Si el grupo saliente es propenso a la eliminación en el reactivo de funcionalidad cruzada en lugar de al desplazamiento directo y el grupo de extracción de electrones es una unidad estructural activadora adecuada para la reacción de Michael, entonces puede producirse bisalquilación intramolecular secuencial por reacciones
30 consecutivas de Michael y retro Michael. La unidad estructural saliente sirve para enmascarar un doble enlace conjugado latente que no se expone hasta después de que se haya producido la primera alquilación y los resultados de bisalquilación de reacciones Michael secuenciales e interactivas y las reacciones retro Michael. El grupo de extracción de electrones y el grupo saliente se seleccionan de manera óptima para que pueda producirse bisalquilación mediante reacciones secuenciales de Michael y retro Michael. También es posible preparar agentes
35 alquilantes de funcionalidad cruzada con enlaces múltiples adicionales conjugados al doble enlace o entre el grupo saliente y el grupo de extracción de electrones.
Un grupo saliente L puede representar, por ejemplo, -SR4, -SO2R4, -OSO2R4, -N+R43, -N+HR42, -N+H2R4, halógeno o -OØ, en donde R4 tiene el significado dado anteriormente y Ø representa un grupo arilo sustituido, especialmente 40 fenilo, que contiene al menos un sustituyente de extracción de electrones, por ejemplo -CN,-NO2, -CO2R4, -COH, -CH2OH, -COR4, -OR4, -OCOR4, -OCO2R4, -SR4,-SOR4, -SO2R4, -NHCOR4, -NR4COR4, -NHCO2R4, -NR4CO2R4, -NO, -NHOH, -NR4OH, -C=N-NHCOR4, -C=N-NR4COR4, -N+R43, -N+HR42, -N+H2R4, halógeno, especialmente cloro o, especialmente, flúor, -C≡CR4, -C=CR42 y -C=CHR4, en el que cada R4 tiene independientemente uno de los significados dados anteriormente. Un grupo L de salida especialmente preferido es -SR4 o -SO2R4, especialmente
45 SO2R4, donde R4 representa un grupo fenilo o, especialmente, un grupo tosilo. Por lo tanto, un grupo particularmente preferido, Ya, es:
Ejemplos de reactivos de conjugación preferidos incluyen:
y
10
en la que Lk1 comprende preferiblemente un grupo de fórmula (Va), (Vd) o (Ve) como se describió anteriormente, y en la que Ya es preferiblemente un grupo de fórmula (XII), especialmente en la que A y B son cada uno -CH2-.
15
Otros ejemplos preferidos de agentes de conjugación incluyen:
y
en la que Ya es preferiblemente un grupo de fórmula (XII), especialmente en la que A y B son cada uno -CH2-.
El producto inmediato del proceso de conjugación que usa uno de los reactivos descritos anteriormente es un conjugado de maitansina anticuerpo en el que X representa un grupo ceto CO. Sin embargo, el proceso de la invención es reversible bajo condiciones adecuadas. Esto puede ser deseable para algunas aplicaciones, por ejemplo, donde se requiere una rápida separación de la maitansina del anticuerpo, pero para otras aplicaciones, la separación rápida puede ser indeseable. Por lo tanto, puede ser deseable estabilizar los conjugados por reducción del grupo CO X para dar un grupo CH.OH X. Por consiguiente, el proceso descrito anteriormente puede comprender una etapa opcional adicional de reducir el grupo CO X inicialmente formado en Lk3 para dar un conjugado que tiene un grupo CH.OH X en Lk3. Se prefiere particularmente el uso de un borohidruro, por ejemplo, borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, borohidruro de potasio o triacetoxiborohidruro de sodio, como agente reductor. Otros agentes reductores que se pueden usar incluyen, por ejemplo, cloruro de estaño(II), alcóxidos tales como alcóxido de aluminio e hidruro de litio y aluminio.
Las condiciones de reacción adecuadas para el proceso descrito anteriormente se dan en los documentos WO 2005/007197 y WO 2010/100430. El proceso puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un disolvente o mezcla de disolventes en la que todos los reactivos son solubles. Se puede permitir que el anticuerpo reaccione directamente con el reactivo de conjugación en un medio de reacción acuoso. Este medio de reacción también puede ser regulado, dependiendo de los requisitos de pH del nucleófilo. El pH óptimo para la reacción será generalmente de al menos 4,5, típicamente entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,5, de manera preferible aproximadamente 6,0 a 8,2. Las condiciones de reacción óptimas, por supuesto, dependerán de los reactivos específicos empleados.
Las temperaturas de reacción entre 3-37 °C son generalmente adecuadas. Las reacciones realizadas en medios orgánicos (por ejemplo, THF, acetato de etilo, acetona) se llevan a cabo normalmente a temperaturas hasta ambiente.
La proteína de enlace se puede conjugar eficazmente con el reactivo deseado usando un equivalente estoiquiométrico o un exceso de reactivo. El exceso de reactivo y el producto pueden separarse fácilmente durante la purificación de rutina, por ejemplo, mediante métodos de cromatografía estándar, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de exclusión de tamaño, diafiltración o, cuando está presente una etiqueta de polihistidina, mediante separación usando cromatografía de afinidad de metal, por ejemplo, con base en níquel o zinc. La focalización de enlaces disulfuro específicos en la proteína de enlace se puede llevar a cabo mediante métodos conocidos; por ejemplo, mediante la reducción parcial de la proteína, ver, por ejemplo, Liu et al, Anal. Chem. 2010, 82, 5219-5226.
Los reactivos de conjugación de las fórmulas generales VIII anteriores se pueden preparar haciendo reaccionar una maitansina con un compuesto de fórmula general:
en la que m, P, L, p, Lk2 y Lk3a tienen los significados dados para la fórmula general VIII y Lk1b es un grupo de fórmula Lk1 modificado para incluir un grupo reactivo con un grupo presente en una maitansina. Los grupos típicos y las reacciones adecuadas son bien conocidos por la persona experimentada. Los reactivos de conjugación de las fórmulas generales VIII son nuevos, y la invención, por lo tanto, proporciona estos reactivos per se. En estos nuevos reactivos, los significados preferidos para Lk1, P, Lk2, m, p y q son como se han indicado anteriormente para la fórmula general I. La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un conjugado de maitansina proteína de acuerdo con la invención, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente junto con un agente terapéutico adicional; tal conjugado para su uso en terapia, específicamente, para su uso como un medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa, autoinmune o de infecciones, por ejemplo cáncer; y un conjugado de acuerdo con las reivindicaciones para su uso en un método de tratamiento de un paciente que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de dicho conjugado
o composición farmacéutica a un paciente. Las condiciones particulares para las cuales la presente invención encuentra utilidad incluyen, por ejemplo, leucemia, que incluye linfoma no Hodgkin, leucemia mielógena aguda, mieloma múltiple, leucemias linfocíticas y leucemia mielógena crónica; cáncer gástrico; cáncer de mama; cáncer de ovarios; cáncer de hígado; cáncer intestinal; cáncer de colon; cáncer renal, por ejemplo carcinoma de células renales; cáncer de pulmón, por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas; melanoma; cáncer de vejiga; y sarcomas.
Los conjugados de la presente invención demuestran una serie de ventajas importantes, cuya existencia no se pudo predecir. En comparación con los conjugados de fármaco anticuerpo equivalentes preparados usando reactivos de maleimida, tal como se usan actualmente en los conjugados comercialmente disponibles, estos demuestran una estabilidad significativamente aumentada. Además, su método de síntesis conduce a un producto con una homogeneidad significativamente mejorada con respecto a la proporción fármaco anticuerpo, en comparación con el uso de maleimida. La homogeneidad es ventajosa para las sustancias farmacológicas para la regularidad de la producción de la sustancia farmacológica. Un proceso que genere un mayor rendimiento de una sola especie de DAR será más bajo coste a través de una mayor eficiencia. Un producto farmacológico de una única especie de DAR producida por la purificación de esa especie DAR a partir de una mezcla heterogénea sería prohibitivamente costoso de producir en grandes cantidades.
Además, una sola especie de DAR demostrará una farmacocinética, seguridad, toxicidad y tolerabilidad más predecibles ya que toda la sustancia farmacológica debe metabolizarse de manera similar, dando los mismos productos, en lugar de una sustancia DAR mixta que puede metabolizarse de manera diferente o a diferente ratas, dando productos de descomposición más heterogéneos.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención. El contenido no incluido en el alcance de las reivindicaciones no forma parte de la invención.
Ejemplo 1: Síntesis del reactivo 1 de valina-alanina-paraaminobencilo-aminohexoanóico-maitansina (val-ala-PAB-AHX-DM1) que posee un PEG de 24 unidades de repetición con funcionalidad terminal de bis-sulfona.
Etapa 1: Conjugación de ácido 1-oxo-1-(4-(3-tosil-2-(tosilmetil)propanoil)fenil)-PEG (bis-sulfona-PEG(24 unidades)-CO2H)
Se añadió hexafluorofosfato de O-(6-clorobenzotriazol-1-il)-N,N,N',N’-tetrametiluronio (HCTU) (29 mg) a una solución agitada de bis-sulfona-PEG(24)-CO2H (75 mg, preparado a partir de NH2-PEG(24)-CO2H usando un método derivado de Nat. Prot., Vol. 1, No. 4, 2006) en dimetilformamida anhidra (5,8 ml) y se agitó durante 20 minutos. Se añadió Val-ala-PAB-AHX-DM1 (100 mg, Concortis Biosystems Corp.) y la mezcla de reacción se agitó a 30 °C. Después de 24 horas, se añadió una cantidad adicional de HCTU (2 mg) y la mezcla de reacción se agitó a 30 °C. Después de 16 horas adicionales, los compuestos volátiles se eliminaron in vacuo y el residuo sólido se purificó por cromatografía en columna eluyendo con diclorometano-metanol (97:3 v/v + 5 gotas de AcOH/50 ml de disolvente, luego 96:4 v/v + 5 gotas de AcOH/50 ml de disolvente), el disolvente se eliminó al vacío y la bis-sulfona-PEG(24)-val-ala-PAB-AHX-DM1 1 se aisló como un aceite de color amarillo pálido (55 mg). m/z M+Na+ 2716; señales de diagnóstico para 1H NMR ∂H (600 MHz CDCl3) 1,28 (6H, dd, valina CH(CH3)2), 1,45 (3H, d, alanina CH-CH3) 2,49 (6H, s, CH3-Ar) 3,45-3,75 (m, PEG y CH2-Ts), 5,62 (1H, dd, C = CH-CH-C = CH), 6,41 (1H, dd, C=CH-CH-C=CH), 6,65 (2H, s , CH2-Ar), 7,37 (4H, d, Ts), 7,63 (2H, d, Ar), 7,66 (4H, d, Ts), 7,85 (2H, d, Ts).
Ejemplo 2. Síntesis del reactivo 2 de valina-alanina-paraaminobencilo-aminohexoanoico-maitansina (val-ala-PAB-AHX-DM1) que posee una unidad de repetición PEG de 5 kDa con funcionalidad terminal de bis-sulfona.
Etapa 1: Conjugación de ácido de 3-(2-(4-(3-tosil-2-(tosilmetil)propanoil)fenil benzamido)etoxi)PEG (bis-sulfona-PEG(5 kDa)-CO2H)
Se añadió hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-oxido (HATU) (10 mg) a una solución agitada de la bis-sulfona-PEG(5 kDa)-CO2H conocida (56 mg, preparado a partir de NH2-PEG (5 kDa)-CO2H usando un método derivado de Nat. Prot., Vol. 1, No. 4, 2006) en dimetilformamida anhidra (0,5 ml) cuando se añadió una solución de val-ala-PAB-AHX-DM1 (15,8 mg, Concortis Biosystems Corp.) en dimetilformamida (0,5 ml) seguida de N-metilmorfolina (4,4 μl) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 24 horas, se añadió una cantidad adicional de HATU (10 mg) y N-metilmorfolina (4,4 μl) y la reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 19 horas adicionales, los compuestos volátiles se eliminaron in vacuo y el residuo sólido se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa eluyendo con regulador A (v/v): agua:5 % acetonitrilo:0,1 % TFA y regulador B (v/v):0,1 % TFA en acetonitrilo (100:0 v/v a 0:100), el disolvente orgánico se eliminó al vacío y el disolvente acuoso se eliminó por liofilización y la bis-sulfona-PEG(5 kDa)-val-ala-PAB-AHX-DM1 2 se aisló como una película incolora (10,6 mg). m/z M+Na+6380.
Ejemplo 3. Conjugación de bis-sulfona-PEG(24)-val-ala-PAB-AHX-DM1 1 a un anticuerpo (trastuzumab)
A una solución de anticuerpo (2,25 mg) (Herceptin®) a 5 mg/ml en 20 mM de fosfato de sodio, pH 7,5, 150 mM de NaCl y 20 mM de EDTA, se añadió una solución de 5 mM de TCEP (18 μl) y la mezcla resultante fue incubada a 40 °C durante 1 hora. La solución reducida de anticuerpo (0,468 ml, a 4,8 mg/ml) se diluyó a 3,33 mg/ml con 20 mM de regulador de fosfato de sodio, pH 7,5, 150 mM de NaCl y 20 mM de EDTA. Al anticuerpo reducido, se añadió una solución de bis-sulfona-PEG(24)-val-ala-PAB-AHX-DM1 reactivo 1 en DMF (75 μL a 3,23 mg/ml) y la solución resultante se mezcló e incubó a 22 ºC durante 22 horas. La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 mM de N-acetil-L-cisteína (36 μl) y se incubó a 22 °C durante 1 hora más. La mezcla de reacción final (786 μl) se intercambió en regulador a PBS x1 usando una columna de centrifugado Zeba™ de 5 ml (Pierce). La mezcla de reacción se analizó mediante Cromatografía Hidrófoba de Interacción (HIC) usando una columna Butilo-NPR de TOSOH TSK-gel. El método consistió en un gradiente lineal de 100 % regulador A (50 mM de fosfato de sodio pH 7,0, 1,5 M de sulfato de amonio) a 100 % regulador B (50 mM de fosfato de sodio pH 7,0, isopropanol al 20 %) en 30 minutos. La detección se realizó siguiendo la absorción UV a 248 y 280 nm. Las especies se separaron según la cantidad de fármaco cargada y se caracterizaron de acuerdo con la proporción de absorbancia UV máxima a 248 y 280 nm. El área para cada variante de DAR se determinó y se trazó como un gráfico de barras y el resultado se muestra en la Figura 1. El producto principal fue el conjugado de DAR=4 (65 %).
Ejemplo 4. Conjugación de bis-sulfona-PEG(24)-val-ala-PAB-AHX-DM1 reactivo 1 a un Fab
A una solución de un Fab (5 mg, derivado de la digestión con papaína de trastuzumab) a 2,59 mg/ml en PBS se añadieron 19,3 μl de 1 M de DTT. La mezcla de reducción se incubó a 22 °C durante 1 hora. Después de la incubación, la mezcla se cambió por regulador a 20 mM fosfato de sodio, pH 7,4, 150 mM de NaCl y 20 mM de EDTA usando una columna desalinizadora de centrifugación ZebaTM de 5 ml. La solución de Fab reducida (1,9 ml, a 2,58 mg/ml) se diluyó a 2,22 mg/ml con 20 mM de regulador de fosfato de sodio, pH 7,4, 150 mM de NaCl y 20 mM de EDTA. Al Fab reducido (2,12 ml a 2,22 mg/ml), se le añadió una solución de bis-sulfona-PEG(24)-val-ala-PAB-AHX-DM1 reactivo 1 en DMSO al 50 % y 20 mM de regulador de fosfato de sodio al 50 %, pH 7,4, 150 mM de NaCl y 20 mM de EDTA (235 μl a 1,62 mg/ml) y la solución resultante se mezcló y se incubó a 22 °C durante 18 horas. La mezcla de reacción se analizó a continuación por SDS-PAGE. La mezcla de conjugación se purificó a continuación mediante HIC preparativa usando una columna HIC HiTrap™ Fenil HP de 5 ml. El conjugado Fab-reactivo 1 purificado se analizó mediante RP-HPLC (Figura 2) y SDS-PAGE (Figura 3). El análisis de RP-HPLC se realizó en una columna VariTide RPC 250 x 4,6 mm (Agilent Technologies) y como se muestra en la Figura 2, el producto conjugado Fab-AHX-DM1 se ejecutó como un único pico principal (92 % por área) mostrando que el conjugado es altamente homogéneo. Para el análisis SDS-PAGE, se ejecutaron muestras en un gel Bis-Tris al 4-12 % en regulador de ejecución MES a 200 V durante 35 minutos. Estándar Novex® Sharp preteñido se utilizó como el marcador de proteínas. Se usó regulador de muestra NuPAGE® LDS (4X) como regulador de muestra y el gel se tiñó con tinción de proteína InstantBlue™. La densitometría fue analizada por ImageQuant LAS 4.000 para proporcionar una lectura de pureza para cada carril que se muestra como un porcentaje sobre el gel en la Figura 4. Se cargó un μg de muestra (con base en Fab) en cada carril, es decir, para cada muestra. En la Figura 4, el carril marcado como M es el estándar de proteína, el carril marcado como 1 es el Fab inicial, el carril marcado como 2 es el Fab inicial después del tratamiento con DTT, el carril marcado como 3 es el conjugado Fab-AHX-DM1 purificado y
el carril marcado como 4 es el conjugado purificado Fab-AHX-DM1 después del tratamiento con DTT. Tanto el Fab como el conjugado se trataron con DTT de la misma forma, es decir, concentración final de 10 mM de DTT durante 1 hora a temperatura ambiente.
Ejemplo 5. Análisis de conjugados de fármaco anticuerpos (ADCs) mediante ensayo de viabilidad celular in vitro
La eficacia in vitro del anticuerpo y los conjugados Fab preparados en los Ejemplos 3 y 4 respectivamente, se determinaron midiendo el efecto inhibidor sobre el crecimiento celular de las líneas celulares cancerosas que sobreexpresan los receptores de HER-2.
La pérdida de la viabilidad de las células tumorales después del tratamiento con fármacos citotóxicos o ADCs in vitro puede medirse mediante líneas celulares en crecimiento en presencia de concentraciones crecientes de fármacos o ADCs y cuantificando la pérdida de proliferación o actividad metabólica utilizando el reactivo Luminescente Cell-Titer Glo® (Promega Corp. Technical Bullettin TB288; Lewis Phillips G.D, Cancer Res 2008; 68:9280-9290). El protocolo describe la siembra celular, el tratamiento farmacológico y la determinación de la viabilidad celular en referencia a las células no tratadas con base en la síntesis de ATP, que está directamente relacionada con el número de células presentes en el pocillo.
Las células SK-BR-3 HER2-positivas y MCF-7 HER2-negativas se tripsinizaron con 3 ml de tripsina EDTA durante 515 minutos. La tripsinización se detuvo mediante la adición de 10 ml de medio completo, y las células se transfirieron a un tubo Falcon de 50 ml. Las células se contaron usando un hemocitómetro de Neubauer y se ajustaron a una densidad celular de 3x104/ml para MCF-7 y 5x104/ml para SK-BR-3 respectivamente. Las células se sembraron (100 μl/pocillo) en placas de 96 pocillos con paredes opacas recubiertas con poli-D-lisina y se incubaron durante 24 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. Las líneas de células tumorales SK-BR-3 (ATCC-HTB-30) y MCF-7 (ATCC-HTB-22) se compraron de la Colección de Cultivos Tipo Americano. Las células SK-BR-3 se cultivaron en medio 5A de McCoy (Life Technologies®), suero bovino fetal al 10 %, 100 u/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Las células MCF-7 se cultivaron en Medio Esencial Mínimo (Life Technologies®), suero bovino fetal al 10 %, 100 u/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Los métodos para el cultivo celular se derivaron de hojas de información del producto para ATCC y referencias citadas allí, por ejemplo, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, 3ª edición, publicado por Alan R. Liss, N.Y. 1994, o 5ª Edición publicada por Wiley-Liss, N.Y. 2005.
Se realizaron diluciones en serie de ADC o fármaco libre (AHX-DM1), por triplicado, pipeteando a través de una placa de 96 pocillos desde las columnas 3-10 usando el medio de cultivo celular relevante como diluyente. La línea celular SK-BR-3 HER2-positiva, se trató con concentraciones de fármaco de 40-0,018 nM usando diluciones de 2 veces. La línea celular MCF-7 HER2-negativa se trató con concentraciones de fármaco de 200-0,1 nM (AHX-DM1 libre) o 400-0,2 nM (conjugados de AHX-DM1), respectivamente usando diluciones de 3 veces. Las células se incubaron con el fármaco (volumen total 200 μl/pocillo), a 37 °C y CO2 al 5 % durante 96 horas más.
El ensayo de viabilidad celular se llevó a cabo utilizando el reactivo Luminescente Cell-Titer Glo®, tal como se describe en las instrucciones del fabricante (Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Lewis Phillips G.D, Cancer Res 2008; 68:9280-9290). Tiempos de incubación, por ejemplo, la lisis celular y la incubación con reactivo luminiscente, se extendieron a 3 minutos y 20 minutos, respectivamente, para una señal luminiscente óptima.
La luminiscencia se registró usando un lector de placas (por ejemplo, el lector de placas MD SpectramaxM3), y los datos se analizaron posteriormente usando un modelo de regresión no lineal de cuatro parámetros.
Figura 4. Respuestas de viabilidad celular al tratamiento con conjugado de Fab-reactivo 1 o conjugado de Anticuerpo-reactivo 1 dentro de las células SKBR-3 o MCF-7.
La viabilidad se expresa como % de células no tratadas. El porcentaje de viabilidad (eje Y) se representa gráficamente frente al logaritmo de la concentración de fármaco en nM (eje x) para determinar los valores de IC50 para todos los conjugados, así como el fármaco libre.
Como se muestra en la Figura 4 y en la Tabla 1, los conjugados de Anticuerpo-val-ala-PAB-AHX-DM1 y Fab-val-ala-PAB-AHX-DM1 inhiben eficientemente la proliferación de células SK-BR-3 HER2-positivas. En células MCF-7 HER2negativas, no se observa inhibición del crecimiento después del tratamiento con Fab-val-ala-PAB-AHX-DM1 o anticuerpo-val-ala-PAB-AHX-DM1 a las concentraciones analizadas, confirmando la especificidad de los conjugados.
Tabla 1
Muestra
SK-BR-3 IC50 (nM) MCF-7 IC50 (nM)
Conjugado de Fab-reactivo 1 (DAR=1)
0,33 N/A
Conjugado de anticuerpo-reactivo 1 (DAR=1)
0,12 N/A
Muestra
SK-BR-3 IC50 (nM) MCF-7 IC50 (nM)
AHX-DM1
3,4 36,26
Ejemplo 6. Síntesis del reactivo 3
Etapa 1: Conjugación de éster de 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]ácido benzoico-N-hidroxisuccinimidilo (bissulfona) a O-(2-aminoetil)-O'-[2-(Boc-amino)etil]decaetilenglicol
O-(2-aminoetil)-O'-[2-(Boc-amino)etil]decaetilenglicol (Sigma Aldrich) se disuelve en diclorometano. Bajo agitación, se agrega éster de 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]ácido benzoico-N-hidroxi succinimidílico (Nature Protocols, 2006, 1(54), 2241-2252) y la mezcla se agita bajo una atmósfera de argón hasta que la reacción se completa. Los
15 volátiles se eliminan in vacuo y el residuo se purifica para dar 4.
Etapa 2: Desprotección del grupo protector de Boc.
A una solución agitada del producto de la etapa 1 en diclorometano se le añade ácido trifluoroacético y la solución resultante se agita hasta que se completa la desprotección de Boc. Los volátiles se eliminan in vacuo y el residuo se purifica para dar 5.
Etapa 3: Conjugación de DM1 a ácido 6-maleimidohexanóico
5 Se agita una mezcla de DM1 (Widdison et al, J Med. Chem., 2006, 49(14), p4392-4408), documento WO2009/134976), ácido 6-maleimidohexanóico (Sigma Aldrich) y regulador de fosfato de potasio en THF/agua hasta que la reacción continúe hasta su finalización. Los componentes volátiles se eliminan in vacuo y el residuo se purifica para dar 4.
10 Etapa 4: Reacción de 5 con 6.
Una mezcla de 4, DMAP y EDCI se agita a temperatura ambiente en DMF durante 30 minutos. Se agrega 5 y la 15 mezcla se agita hasta que la reacción se completa. Los componentes volátiles se eliminan in vacuo y el residuo es purificado para dar 3.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un conjugado que contiene maitansina de la fórmula general:
    5 en en la que D representa una unidad estructural de maitansina; q representa un número entero de 1 a 10; 10 Lk1 representa un enlazador; m representa un número entero de 1 a 10; 15 P representa un enlace o un grupo z-valente -P1-NH-en el que z es de 2 a 11 y P1 es un grupo que contiene al menos una unidad de etileno -CH2-CH2-o unidad de etilenglicol -O-CH2-CH2-; p representa un número entero de 1 a 10; 20 Lk2 representa un enlace o un enlazador y-valente en el que y es de 2 a 11 y que consiste en de 1 a 9 residuos de aspartato y/o glutamato; Lk3 representa un enlazador de la fórmula general:
    en la que Ph es un grupo fenilo opcionalmente sustituido; X representa un grupo CO o un grupo CH.OH; e Y representa un grupo de fórmula:
    en las que cada uno de A y B representa un grupo C1-4 alquileno o alquenileno;
    Ab representa una proteína o péptido de enlace capaz de enlazarse a un compañero de enlace en un objetivo, dicha 35 proteína o péptido de enlace se enlaza a Lk3 a través de dos átomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en la proteína o péptido de enlace; y
    n representa un número entero de 1 a s en el que s es el número de enlaces disulfuro presentes en la proteína o péptido de enlace antes de la conjugación a Lk3; 40 los significados de m, n, p, q, y y z se eligen de modo que el conjugado contenga de 1 a 10 grupos D.
  2. 2. Un conjugado como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la unidad estructural de maitansina comprende
  3. 3.
    Un conjugado como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que Lk1 es un enlazador degradable.
  4. 4.
    Un conjugado como se reivindica en la reivindicación 3, en el que Lk1 incluye uno de los siguientes grupos:
    en las que cada uno de R, R', R" y R''' representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo y AA representa una secuencia de aminoácidos específica de proteasa.
  5. 5. Un conjugado como se reivindica en la reivindicación 4, en el que Lk1 incluye:
  6. 6. Un conjugado como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que q es un número entero de 2 20 a 10 y Lk1 es un enlazador multivalente que incorpora uno o más residuos de aspartato o glutamato.
  7. 7. Un conjugado como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que P representa un enlace, o P representa -P1-NH-en el que P1 contiene de 2 a 10 unidades de etilenglicol.
    25 8. Un conjugado como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que P1 representa polietilenglicol.
  8. 9. Un conjugado como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el grupo fenilo Ph en
    Lk3 no está sustituido. 30
  9. 10. Un conjugado como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que Y tiene la fórmula:
  10. 11. Un conjugado como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que Ab representa un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de anticuerpo que comprende una región de enlace a antígeno del anticuerpo de longitud completa.
    5 12. Un conjugado como se reivindica en la reivindicación 11, en el que Ab representa IgG1 o IgG4 o un fragmento de IgG1 o IgG4.
  11. 13. Un procedimiento para la preparación de un conjugado como se reivindica en una cualquiera de las
    reivindicaciones 1 a 12, que comprende reducir uno o más enlaces disulfuro en una proteína de enlace y 10 posteriormente reaccionar con un reactivo de conjugación de la fórmula general:
    en la que D, Lk1, P, Lk2 y m, p y q tienen los significados dados en la reivindicación 1, y Lk3a representa un grupo de 15 fórmula:
    en el que Ph tiene el significado dado en la reivindicación 1, Xa representa un grupo CO y Ya representa un grupo:
    en las que A y B tienen los significados dados en la reivindicación 1, cada L representa independientemente un grupo saliente, y x representa un número entero de 1 a 4, para producir un conjugado de fórmula I en la que X representa CO; y opcionalmente reducir dicho grupo X de CO formado inicialmente para dar un conjugado que tiene
    30 un grupo X CH.OH.
  12. 14.
    Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 13, en el que Ya representa:
  13. 15.
    Un compuesto de la fórmula general:
    40 en la que D tiene el significado dado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; Lk1 tiene el significado dado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 7; P tiene el significado dado en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 8 y 9; Lk2, m, p y q tienen los significados dados en la reivindicación 1, y Lk3a representa un grupo de fórmula:
    en la que Ph tiene el significado dado tanto en la reivindicación 1 o en la reivindicación 10, Xa representa un grupo CO y Ya representa un grupo:
    o
    en las que A y B tienen los significados dados en la reivindicación 1, cada L representa independientemente un grupo saliente, y x representa un número entero de 1 a 4.
    10 16. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 15, en el que Ya representa:
  14. 17. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado como se reivindica en una cualquiera de las
    15 reivindicaciones 1 a 12, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente junto con un agente terapéutico adicional.
  15. 18. Un conjugado como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o una composición como se
    reivindica en la reivindicación 17 para su uso en terapia. 20
ES13783360.4T 2012-10-24 2013-10-11 Conjugados de fármaco proteínas Active ES2652513T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261717743P 2012-10-24 2012-10-24
US201261717743P 2012-10-24
PCT/GB2013/052662 WO2014064424A1 (en) 2012-10-24 2013-10-11 Drug-protein conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2652513T3 true ES2652513T3 (es) 2018-02-02

Family

ID=49488609

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13783360.4T Active ES2652513T3 (es) 2012-10-24 2013-10-11 Conjugados de fármaco proteínas

Country Status (20)

Country Link
US (1) US20150283259A1 (es)
EP (1) EP2911696B1 (es)
JP (1) JP6328649B2 (es)
KR (1) KR20150085808A (es)
CN (1) CN104755106B (es)
AU (1) AU2013336410B2 (es)
BR (1) BR112015008311A2 (es)
CA (1) CA2884359A1 (es)
DK (1) DK2911696T3 (es)
ES (1) ES2652513T3 (es)
HK (1) HK1208186A1 (es)
HU (1) HUE037604T2 (es)
IL (1) IL237673A0 (es)
IN (1) IN2015DN02577A (es)
MX (1) MX2015005124A (es)
NO (1) NO2789793T3 (es)
RU (1) RU2015119557A (es)
SG (1) SG11201501955VA (es)
WO (1) WO2014064424A1 (es)
ZA (1) ZA201501996B (es)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY183572A (en) 2013-03-15 2021-02-26 Regeneron Pharma Biologically active molecules, conjugates thereof, and therapeutic uses
WO2014194030A2 (en) * 2013-05-31 2014-12-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
EA038192B1 (ru) 2013-08-26 2021-07-21 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Фармацевтические композиции, содержащие диастереомеры макролида, способы их синтезирования и терапевтическое применение
CN106536560B (zh) * 2014-05-23 2021-03-09 诺华股份有限公司 从含二硫化物的蛋白质制备缀合物的方法
EP3148592A2 (en) * 2014-06-02 2017-04-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody-drug conjugates, their preparation and their therapeutic use
EP3218009B1 (en) 2014-10-14 2021-04-07 Polytherics Limited Process for the conjugation of a peptide or protein with a reagent comprising a leaving group including a portion of peg
GB2531715A (en) * 2014-10-24 2016-05-04 Polytherics Ltd Novel drug conjugates
EP3220956B1 (en) * 2014-10-24 2023-08-09 Abzena (UK) Limited Conjugates and conjugating reagents
CA2991973C (en) 2015-07-12 2021-12-07 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Bridge linkers for conjugation of a cell-binding molecule
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
EP3331569A1 (en) * 2015-08-07 2018-06-13 Gamamabs Pharma Antibodies, antibody drug conjugates and methods of use
WO2017132173A1 (en) 2016-01-25 2017-08-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use
WO2017161206A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Halozyme, Inc. Conjugates containing conditionally active antibodies or antigen-binding fragments thereof, and methods of use
JP7038663B2 (ja) 2016-04-14 2022-03-18 ポリセリックス・リミテッド 環中に少なくとも２個の（－ｃｈ２－ｃｈ２－０－）単位を含むリンカーを含むコンジュゲート及びコンジュゲート試薬
GB201608936D0 (en) 2016-05-20 2016-07-06 Polytherics Ltd Novel conjugates and novel conjugating reagents
CN109311996B (zh) 2016-06-06 2023-11-28 阿布泽纳(英国)有限公司 抗体、其用途及其缀合物
GB201615725D0 (en) * 2016-09-15 2016-11-02 Polytherics Ltd Novel cytotoxic agents and conjugates thereof
CA3042442C (en) 2016-11-14 2024-01-02 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Conjugation linkers, cell binding molecule-drug conjugates containing the linkers, methods of making and uses of such conjugates with the linkers
US10864279B2 (en) 2016-12-16 2020-12-15 Industrial Technology Research Institute Linker-drug and antibody-drug conjugate (ADC) employing the same
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
CN114040778A (zh) 2019-06-29 2022-02-11 杭州多禧生物科技有限公司 一种细胞结合分子-Tubulysin衍生物偶联物及其制备方法
WO2021055816A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds
AU2021337687A1 (en) 2020-09-04 2023-03-23 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Nectin-4 antibodies and uses thereof
EP4308242A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens
CN117147824A (zh) * 2022-05-29 2023-12-01 菲鹏生物股份有限公司 一种抗体缀合物及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0316294D0 (en) 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
CN107213469A (zh) * 2003-11-06 2017-09-29 西雅图基因公司 能够与配体偶联的单甲基缬氨酸化合物
NZ566982A (en) * 2005-09-26 2011-06-30 Medarex Inc Duocarmycin drug conjugates
EP2211904B1 (en) * 2007-10-19 2016-08-17 Seattle Genetics, Inc. Cd19 binding agents and uses thereof
CN104258413A (zh) * 2008-04-30 2015-01-07 伊缪诺金公司 有效的偶联物和亲水性连接体
US9005598B2 (en) 2009-03-04 2015-04-14 Polytherics Limited Conjugated proteins and peptides
AR078471A1 (es) * 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis COMPUESTOS MAITANSINOIDES Y EL USO DE ESTOS PARA PREPARAR CONJUGADOS CON UN ANTICUERPO LOS CUALES SE UTILIZAN COMO AGENTES ANTICANCERIGENOS Y EL PROCEDIMIENTO DE PREPARACIoN DE ESTOS CONJUGADOS
EP2861261A2 (en) * 2012-06-19 2015-04-22 Polytherics Limited Process for preparation of antibody conjugates and antibody conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014064424A1 (en) 2014-05-01
MX2015005124A (es) 2015-10-29
AU2013336410B2 (en) 2017-08-03
EP2911696B1 (en) 2017-09-20
IN2015DN02577A (es) 2015-09-11
CN104755106B (zh) 2018-03-13
JP2015536329A (ja) 2015-12-21
HUE037604T2 (hu) 2018-09-28
SG11201501955VA (en) 2015-04-29
EP2911696A1 (en) 2015-09-02
CN104755106A (zh) 2015-07-01
DK2911696T3 (en) 2018-01-08
JP6328649B2 (ja) 2018-05-23
KR20150085808A (ko) 2015-07-24
RU2015119557A (ru) 2016-12-20
AU2013336410A1 (en) 2015-04-09
BR112015008311A2 (pt) 2017-07-04
HK1208186A1 (en) 2016-02-26
IL237673A0 (en) 2015-04-30
ZA201501996B (en) 2016-01-27
CA2884359A1 (en) 2014-05-01
NO2789793T3 (es) 2018-01-27
US20150283259A1 (en) 2015-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2652513T3 (es) Conjugados de fármaco proteínas
US20220062436A1 (en) Drug-protein conjugates
ES2532855T3 (es) Conjugados de amatoxina con uniones mejoradas
US20200268885A1 (en) Conjugates And Conjugating Reagents
AU2011307195B2 (en) Amatoxin-conjugates with improved linkers
AU2017265310B2 (en) Multi-arm polymeric targeting anti-cancer conjugate
CA3149263A1 (en) Targeted dendrimer conjugates
CA3201005A1 (en) Glycoside dual-cleavage linkers for antibody-drug conjugates
CA3203849A1 (en) Dual-cleavage ester linkers for antibody-drug conjugates
NZ728857B2 (en) Materials and methods relating to linkers for use in protein drug conjugates