CN104744594A - 乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因序列如SEQ ID No.2所示；该融合蛋白携带有三种乙肝病毒抗原的四个超型表位，分别为HBsAg281-290、HBcAg98-107、Pol321-330和Pol661-670，还携带有Th表位Padre和志贺毒素，融合蛋白可用于制备乙肝治疗性疫苗，具有靶向性强、适应人群广等优点。

Description

乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种融合蛋白，还涉及该融合蛋白的制备方法，以及在制药领域中的应用。

背景技术

乙肝病毒(HBV)是重要的肝脏疾病致病因子。慢性HBV感染患者主要表现为肝损伤以及与脂肪变性和纤维化相关的代谢紊乱，长期感染患者有可能发展为肝硬化和肝癌。目前治疗慢性HBV感染主要采用以抗病毒药物和细胞因子为主、中医药为辅的治疗方法，虽然取得了一定疗效，但存在不能有效清除HBV、复发率高等缺点。因此，研究慢性HBV感染的新型治疗方法和治疗药物是我国当前亟待解决的重大课题之一。

随着乙肝病毒学和现代免疫学的快速发展，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在HBV清除过程中的关键作用得到深刻认识。利用CTL抑制HBV的复制并进一步将其清除，已成为极富前景的慢性HBV感染治疗方法。现有文献已报道了一些以激发特异性CTL反应为目标的乙肝疫苗，包括多肽疫苗、蛋白疫苗和DNA疫苗等。但这些疫苗并不完善，例如多肽疫苗多数是由单一抗原单一MHC限制性的单一表位或多表位串联而成，存在表位单一、宿主限制性、免疫原性差等缺点；蛋白疫苗可以多次免疫，但由于单一蛋白抗原表位的免疫原性差，在体内不能有效激发特异性CTL反应；DNA疫苗虽然在体内可以有效激发特异性CTL反应，但由于质粒DNA的转染具有非特异性，对体细胞的转染可导致T细胞对该抗原耐受，存在多次免疫效果差的问题，难以适应慢性HBV感染患者长期治疗、多次免疫的要求。因此，迫切需要开发一种适应广泛人群MHC限制性的更高效的乙肝疫苗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种融合蛋白，免疫原性和靶向性强，能够激发特异性CTL反应，高效抑制和清除乙肝病毒，同时能够适应广泛人群MHC限制性，可用于制备高效乙肝疫苗。

为达到上述目的，经研究，本发明提供如下技术方案：

1.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有上述编码基因的重组表达载体。

4.含有上述重组表达载体的转化菌。

5.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的编码基因克隆入质粒pET300中，获得重组表达载体pET300-STXB-EP；将重组表达载体pET300-STXB-EP转化大肠杆菌BL21(DE3)，用终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷于温度37℃诱导表达4小时，收集菌体，超声破碎，离心取上清，用Ni²⁺亲和层析柱纯化，用TEV蛋白酶酶切去除His标签，再过葡聚糖凝胶G75分子筛纯化，即得乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白。

6.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白在制备乙肝治疗性疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，其携带有三种乙肝病毒抗原的四个超型表位，分别为HBsAg281-290、HBcAg98-107、Pol321-330和Pol661-670，还携带有Th表位Padre和志贺毒素，其中，四个超型表位免疫原性和靶向性强，能够有效激发广谱、特异的CTL反应，高效抑制和清除乙肝病毒，而且四个超型表位的MHC限制性包括A2、A3两大超型，可以覆盖90％以上的中国人群；Th表位Padre能够有效辅助特异性CTL的产生；志贺毒素在体内靶向树突状细胞，可使融合蛋白易于被树突状细胞捕获，进而呈递给T细胞，激活CTL反应；该融合蛋白可用于制备乙肝治疗性疫苗，具有靶向性强、适应人群广等优点。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的编码基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为DNA分子量标准，泳道2为PCR扩增产物。

图2为重组质粒pET300-STXB-EP酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为DNA分子量标准，泳道2和3为NcoI酶切产物，泳道4和5为NcoI和XbaI双酶切产物。

图3为pET300-STXB-EP转化菌表达产物的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2为未经IPTG诱导的表达产物，泳道3和4为经IPTG诱导的表达产物，泳道5为纯化的携带His标签的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白。

图4为经酶切并过Sephadex-G75分子筛后的蛋白电泳图，其中泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2为携带His标签标签的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，泳道3和4为经酶切并过Sephadex-G75分子筛后的蛋白即纯化的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白。

图5为HBV多表位融合志贺毒素蛋白分别免疫HLA-A*0201和HLA-A*1101转基因小鼠前后HBV DNA和HBcAg的变化。

图6为HBV多表位融合志贺毒素蛋白靶向树突状细胞流式结果。峰1为对照HBV多表位融合多肽，峰2为HBV多表位融合志贺毒素蛋白。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的设计与制备

一、乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的设计

首先，选取体外诱导特异性CTL分泌细胞因子IFN-γ的能力高于对照表位HBcAg18-27的4个乙肝病毒超型表位：HBsAg281-290、HBcAg98-107、Pol321-330和Pol661-670，以有效激发广谱、特异的CTL反应，高效抑制和清除乙肝病毒；

HBsAg281-290：氨基酸序列为CPLLPGTSTT，MHC限制性为A3超型(包括A0301、A1101)；

HBcAg98-107：氨基酸序列为RQLLWFHISC，MHC限制性为A2超型(包括A0201、A0206、A0207和A0209)；

Pol321-330：氨基酸序列为LSCWWLQFRN，MHC限制性为A3超型(包括A0301、A1101、A3202、A3302和A5001)；

Pol661-670：氨基酸序列为IQAKQAFTFS，MHC限制性为A2超型(包括A0201、A0202和A0203)。

其次，选取通用Th表位Padre(氨基酸序列为AKFVAAWTLKAAA)以有效辅助特异性CTL的产生。

再次，设计各表位的连接方式及连接肽如下：GAA-(HBsAg281-290)-GAAA-(HBcAg98-107)-KAA-(Padre)-GAAA-(Pol321-330)-NAAA-(Pol661-670)-GAA，获得乙肝病毒多表位融合肽。上述表位连接方式的优点在于，可以实现不同抗原表位和不同表位限制性的交叉，能更有效地激发特异性CTL产生。上述连接肽的优点在于，在体内能有效地被蛋白酶体剪切，有利于表位的加工和提呈。

最后，将上述乙肝病毒多表位融合肽的氨基端与志贺毒素(氨基酸序列为TPDCVTGKVEYTKYNDDDTFTVKVGDKELFTNRWNLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR)的羧基端相连，获得乙肝病毒多表位融合志贺毒素蛋白(SEQ ID No.1)。利用志贺毒素靶向树突状细胞的特性，有效增强机体的CTL应答，清除乙肝病毒。

二、乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的制备

1、重组质粒pET300-STXB-EP的构建

根据乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的氨基酸序列，设计其编码核苷酸序列STXB-EP(SEQ ID No.2)以及PCR扩增引物：上游引物STXB-EP-F：5’-tcccatgggagccgcatgccctcta-3’(SEQ ID No.3)；下游引物STXB-EP-R：5’-gttctagattatcggaagattacct-3’(SEQ ID No.4)，委托上海生工生物工程技术服务公司进行合成。

以合成的STXB-EP序列为模板，采用引物STXB-EP-F和STXB-EP-R进行PCR扩增，扩增条件为：先94℃预变性2分钟，再94℃变性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸1min，共33个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖电泳鉴定(图1)后，切胶回收纯化目的DNA片段(465bp)。将所得目的DNA片段用NcoI和XbaI双酶切，再与经同样双酶切的质粒pET300/NT-DEST(invitrogen公司)在T4DNA连接酶的作用下连接，获得重组质粒pET300-STXB-EP。经NcoI和XbaI双酶切鉴定(图2)，所得重组质粒pET300-STXB-EP中含有目的DNA片段。

2、乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的原核表达与纯化

将重组质粒pET300-STXB-EP转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。挑取一个阳性克隆即pET300-STXB-EP转化菌，分别于温度16、25、37℃诱导目的蛋白表达，诱导剂IPTG的终浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、1mmol/L，诱导时间分别为2、3、4、6小时。表达产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示，在温度37℃、诱导剂终浓度为1mmol/L、诱导时间为4小时的条件下，pET300-STXB-EP转化菌成功表达了携带组氨酸标签的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，且表达量最高(图3)。

利用表达产物携带的组氨酸标签进行亲和纯化：取冻存的pET300-STXB-EP转化菌菌液100μl，加入新鲜培养基10ml，37℃培养过夜，再取新鲜菌液1ml，加入新鲜培养基100ml，37℃培养2.5小时，再加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导培养4小时，收集菌体，10000rpm离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入细菌裂解液10ml和终浓度为1mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)，超声至溶液变清澈，18000rpm离心15分钟，取上清，过Ni²⁺亲和层析柱，先用柱清洗液洗柱3次，再用含有200mmol/L咪唑的上样缓冲液洗脱，收集洗脱液，用0.01mol/L PBS透析去除咪唑和盐离子等，用TEV蛋白酶酶切去除His标签后过Sephadex-G75分子筛，收集通过峰，即得乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白(图4)。

实施例2、乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的免疫保护作用

取HLA-A*0201和HLA-A*1101转基因小鼠70只，平均分为7组：①乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白组(STXB-EP)：以乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白为免疫原；②乙肝病毒多表位融合肽与志贺毒素的混合物对照组(STXB+peptides)：以乙肝病毒多表位融合肽与志贺毒素按摩尔比1:1的混合物为免疫原；③志贺毒素对照组(STXB)：以STXB为免疫原；④乙肝病毒多表位融合肽对照组(peptides)：以乙肝病毒多表位融合肽为免疫原；⑤非治疗对照组(blank)：0.01mol/L PBS缓冲液；⑥安慰剂对照组(placebo)：灭菌双蒸水；⑦乙肝病毒VLP疫苗(在乙型肝炎病毒核心蛋白的第78-79位氨基酸之间插入由HBsAg313-321、HBsAg335-343、Pol150-159、Pol455-463和Padre表位通过连接肽串联而成的乙型肝炎病毒多表位融合肽)。各组免疫方法如下：小鼠尾部皮下注射免疫原，100μg/次/只，1次/周，共免疫3次。

利用定量PCR试剂盒(吉玛公司)检测各组小鼠HBV DNA的拷贝数，利用免疫组化试剂盒(碧云天)检测肝细胞HBcAg表达。结果显示，在HLA-A*0201和HLA-A*1101转基因小鼠中，与其它对照组相比，乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白组的HBV DNA拷贝数和HBcAg表达量均明显下调(图5)，说明乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白存在显著的免疫保护作用，并存在广谱性，同时该疫苗明显优于乙肝病毒VLP疫苗。

实施例3、乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白靶向树突状细胞的能力

为了研究乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白靶向树突状细胞的能力，我们完成了融合蛋白与树突状细胞的结合鉴定实验。具体方案为分别用10μg/ml的融合蛋白和乙肝病毒多表位融合多肽与人树突状细胞共孵育，1个小时后，用PBS清洗细胞3次，用FITC-A标记的HBc抗体与树突状细胞共孵育30分钟，用PBS清洗细胞3次，流式细胞仪检测，结果显示乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白具有靶向人树突状细胞的能力(图6)。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的编码基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。

4.含有权利要求3所述重组表达载体的转化菌。

5.权利要求1所述乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的编码基因克隆入质粒pET300中，获得重组表达载体pET300-STXB-EP；将重组表达载体pET300-STXB-EP转化大肠杆菌BL21(DE3)，用终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷于温度37℃诱导表达4小时，收集菌体，超声破碎，离心取上清，用Ni²⁺亲和层析柱纯化，用TEV蛋白酶酶切去除His和Sumo标签，再过葡聚糖凝胶G75分子筛纯化，即得乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白。

6.权利要求1所述乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白在制备乙肝治疗性疫苗中的应用。