CN104744225A - 白及须根联菲b及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的白及须根联菲B及其制备方法与应用，属于中药技术领域。白及须根联菲B的结构如式一所示。本发明通过95％乙醇回流提取后采用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，氯仿：甲醇梯度洗脱，收集氯仿：甲醇＝(10-50)：1洗脱组份，薄层硅胶板点样，合并相同Rf值的斑点，得到合并物；将合并物进行硅胶柱层析后，进行半制备高效液相，得到白及须根联菲B。新联菲化合物具有很好的抑菌和抗肿瘤作用，其主要存在于白及须根，从而为合理的利用白及须根，提供了有效的手段。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，特别涉及一种新的白及须根联菲B及其制备方法与应用。
背景技术
白及为兰科植物白及(Bletilla sfriata(Thunb.)Reiehb.f.)的干燥块茎，其味苦、甘、涩，微寒，归肺、胃、肝经，具有收敛止血、消肿生肌等功效，用于治疗肺咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒和皮肤皲裂等症。白及主产于贵州、四川、云南、湖南、湖北、安徽、浙江等省。白及药用历史悠久，药用价值明显，国内外学者对其化学成分和药理活性等方面做了很多研究，但在抑菌活性研究上，研究者较少且主要以研究粗提物为主。
根据2010版中国《药典》记载，白及的传统入药部位为块茎，须根在加工过程中被丢弃。有文献报道，白及须根与块茎产量比高达1:4～1:3，即每生产3-4吨白及就有约1吨左右的须根被废弃，这是资源的极大浪费。人参总皂苷为人参有效成分之一，基于主根含人参总苷为5.22％，而须根含11.52％。2010版《药典》记载人参的干燥根和根茎同为入药部位。研究表明，白及须根同样含有含大量和白及块茎相同或类似的化合物，并且，其中有些化合物在须根中的含量远远高于块茎，甚至仅存在于须根中。如何有效的利用白及须根，意义重大。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种新的白及须根联菲B。
本发明的另一目的在于提供所述的白及须根联菲B的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述的白及须根联菲B的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种白及须根联菲B，化学命名为4,7,7'-三甲氧基-9',10'-二氢-[1,3'-联菲]-2,2',5'-三羟基，其结构如式一所示：
所述的白及须根联菲B的制备方法，包括如下步骤：
将白及须根或块茎置于烘箱里，35℃烘干后粉碎，过40目筛，得到白及粉末；取该粉末1.5kg按物料比1：(5-10)加95％乙醇回流提取4次，每次30-100min，过滤，合并滤液，减压浓缩，得到浸膏100-500g；将浸膏混悬于水中，依次用等体积的乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取4次，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物进行硅胶拌样,乙酸乙酯萃取物：硅胶的质量比为1：1，干法上样，氯仿：甲醇按(0-100):(100-0)梯度洗脱，收集氯仿：甲醇＝(10-50)：1洗脱组份，薄层硅胶板点样，合并相同Rf值的斑点，得到合并物；将合并物重复进行硅胶柱层析，然后进行半制备高效液相，得到白及须根联菲B。
所述的白及须根或块茎为晒干的白及须根或块茎。
薄层硅胶板点样，采用紫外观察、I2/KI显色观察、5％硫酸乙醇105℃显色观察检测馏分，合并相同Rf值的斑点。
所述的硅胶柱层析选用2.5×80cm硅胶柱。
所述的半制备高效液相的条件为：流动相-A相为含0.1％三氟乙酸的水溶液，B相为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；洗脱程序：在0-30min，B相从5％-95％。
所述的白及须根联菲B可以应用于制备抗菌制剂或抗肿瘤药物。
所述的抗菌制剂优选为抑制革兰氏阳性致病菌的制剂。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过研究并分离鉴定出白及须根联菲B。白及须根联菲B具有很好的抑菌和抗肿瘤作用，其主要存在于白及须根中，从而为合理的利用白及须根，提供了有效的手段。
附图说明
图1为白及须根联菲B的红外图谱；
图2为白及须根联菲B的1H谱；
图3为白及须根联菲B的13C谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
将晒干的白及须根或块茎置于烘箱里，35℃烘干后粉碎，过40目筛，得到白及粉末；取该粉末1.5kg按物料比1：(5-10)加95％乙醇回流提取4次，每次30-100min，过滤，合并滤液，减压浓缩，得到浸膏100-500g；将浸膏混悬于水中，依次用等体积的乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取4次，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物进行硅胶拌样,乙酸乙酯萃取物：硅胶的质量比为1：1，干法上样，氯仿：甲醇按梯度100:0，70:1，50:1，30:1，10:1，5:1，1:1，0:1进行洗脱，洗脱体积分别为5个柱体积，收集氯仿：甲醇＝(10-50)：1洗脱组份，薄层硅胶板点样，合并相同Rf值的斑点，得到合并物；将合并物重复进行硅胶柱层析(2.5×80cm)，然后进行半制备高效液相，得到白及须根联菲B。
所述的半制备高效液相的条件为：流动相-A相为含0.1％三氟乙酸的水溶液，B相为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；洗脱程序：在0-30min，B相从5％-95％。
白及须根联菲B的鉴定：
白及须根联菲B的红外图谱见图1:IR(KBr)νmax 3205,2936,2837,1610,1586,1459,1437,1351,1274,1203,1139,1009,948,829cm-1；
白及须根联菲B的1H谱见图2(DMCO-d6):H-3,6.98(s)；H-5,9.52(d,9.5)；H-6,7.20(dd,9.5,2.9)；H-8,7.32(d,2.9)；H-9,7.58(d,9.2)；H-10,7.48(d,9.1)；H-1',6.92(s)；H-4',8.27(s)；H-6',6.40(d,2.5)；H-8',6.42(d,2.5)；H2-9',2.81(m)；H2-10',2.81(m)；4-OCH3,4.15(s)；7-OCH3,3.92(s)；4'-OCH3,-；7'-OCH3,3.74(s)；3'-OCH3,-；5'-OCH3,-；
白及须根联菲B的13C谱见图3(DMCO-d6):C-1,114.0；C-2,154.0；C-3,100.4；C-4,159.7；C-4a,116.1；C-5,130.2；C-5a,125.9；C-6,117.1；C-7,157.7；C-8,109.1；C-8a,133.9；C-9,128.2；C-10,126.3；C-10a,134.7；C-1',115.9；C-2',154.6；C-3',120.5；C-4',133.4；C-4a',126.5；C-5',156.1；C-5a',115.7；C-6',101.6；C-7',159.5；C-8',106.2；C-8a',141.5；C-9',31.6；C-10',30.6；C-10a',139.7；4-OCH3,56.0；7-OCH3,55.5；3'-OCH3,-；4'-OCH3,-；5'-OCH3,-；7'-OCH3,55.3。
效果实施例
(一)菌种活化
将金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和变形杆菌分别接种于MH斜面培养基上，放置于37℃培养箱中培养48h，从斜面挑选一个单菌落放入5ml的MH液体培养基中，37℃，140rpm振荡培养过夜，至OD600为0.5，用MH斜面培养基稀释100倍备用，细菌浓度为106cfu/ml。
(二)最小抑菌浓度(MIC)的测定
采用对倍稀释法测定最小抑菌浓度，操作全部在超净台内进行。
(1)将实施例1制备的白及须根联菲B用MH培养基稀释成浓度为256μg/ml，取200μl，加入96孔板中，第一孔200μl，剩余孔中加入100μl MH培养基，从第一孔中取出100μl加入下一孔，混匀后再取出100μl加入下一孔，以此类推，至第6孔为止，取出100μl弃去，第7孔不加药。
(2)在各孔中加入稀释100倍的菌液100μl，此时各孔中白及须根联菲B的浓度分别为128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、0μg/ml。空白对照为MH液体培养液200μl。
(3)将96孔板置于37℃的培养箱中培养24小时，并在0小时和24小时测OD600值，并肉眼观察，将完全抑制指示菌生长的最低浓度定义为最低抑菌浓度(MIC)，结果如表1所示。实验中所有的指示菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA ATCC 43300(Staphylococcus aureus)和耐氨苄西林的表皮葡萄球菌CMCC 26069(Staphylococcus epidermidis)都具有明显的抗菌活性(表1)。从表1可以看出，制备的白及须根联菲B具有良好的抑菌活性。
(三)体外抗肿瘤活性研究
(1)供试药物的配置
精确称取实施例1制备的白及须根联菲B，用DMSO配成一定浓度的母液，取适量体积的母液用DMSO稀释成8mM的稀释液；12000r/min离心10min除菌。细胞加药前取稀释液适量体积以细胞培养液无菌操作稀释成320μM的工作液。
表1白及须根联菲B最低抑菌浓度(MIC)测定结果
(2)加药
将细胞置于96孔板中培养24h后加入上述配制好的工作液中。每孔分别加入供试药物工作液1.25、2.5、5、10、15、20、25μl，共5个药物浓度(4、8、16、32、48、64、80μM)。每个药物浓度做5个复孔，每孔终体积为100μl培养液，然后将细胞培养板置于37℃、5％CO2条件下的CO2培养箱继续培养，46h后对细胞形态进行观察。
(3)细胞培养
取Hela、HepG2、MCF-7、A549冻存细胞复苏，培养条件为：含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃、5％CO2条件下常规培养传代。取对数生长期的上述细胞，用胰酶消化，按每孔5000个细胞(MCF-7为3000)接种于96孔培养板中，100μl细胞培养液，培养箱内静置培养24h后加药。
(4)抗肿瘤活性测定(CCK8法)
观察拍照后，每孔加入10μl的CCK8溶液(注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)，继续培养2h后用酶标仪测定96孔板每个孔在450nm处的吸光度(A)，根据以下公式计算药物对各细胞株的抑制率。
细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100
A(加药)：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白)：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(0加药)：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
细胞抑制率(％)＝100％-细胞活力(％)
结果如表2所示。从表2可以看出，制备的白及须根联菲B对实验中所有测试过的肿瘤细胞均有强烈抑制作用。
表2白及须根联菲B体外抗肿瘤细胞活性测定结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种白及须根联菲B，其结构如式一所示：
2.权利要求1所述的白及须根联菲B的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将白及须根或块茎置于烘箱里，35℃烘干后粉碎，过40目筛，得到白及粉末；取所述的白及粉末1.5kg，按物料比1：(5-10)加95％乙醇回流提取4次，每次30-100min，过滤，合并滤液，减压浓缩，得到浸膏100-500g；将浸膏混悬于水中，依次用等体积的乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取4次，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物进行硅胶拌样,乙酸乙酯萃取物：硅胶的质量比为1：1，干法上样，氯仿：甲醇按100:0，70:1，50:1，30:1，10:1，5:1，1:1，0:1梯度洗脱，收集氯仿：甲醇＝(10-50)：1洗脱组份，薄层硅胶板点样，合并相同Rf值的斑点，得到合并物；将合并物重复进行硅胶柱层析，然后进行半制备高效液相，得到白及须根联菲B。
3.根据权利要求2所述的白及须根联菲B的制备方法，其特征在于，所述的白及须根或块茎为晒干的白及须根或块茎。
4.根据权利要求2所述的白及须根联菲B的制备方法，其特征在于，所述的半制备高效液相的条件为：流动相-A相为含0.1％三氟乙酸的水溶液，B相为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；洗脱程序：在0-30min，B相从5％-95％。
5.权利要求1所述的白及须根联菲B应用于制备抗菌制剂或抗肿瘤药物。
6.根据权利要求5所述的白及须根联菲B的应用，其特征在于，所述的抗菌制剂为抑制革兰氏阳性致病菌的制剂。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN109966410A (zh) * | 2019-05-08 | 2019-07-05 | 中山市沙溪镇食品药品监督所 | 一种抗菌组合物及含有该组合物的伤口敷料 |
| CN111303017A (zh) * | 2019-08-28 | 2020-06-19 | 上海中医药大学 | 一类含9,10-二氢菲骨架的化合物及其制备方法和用途 |
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2015
- 2015-03-17 CN CN201510116559.5A patent/CN104744225A/zh active Pending
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