CN104740625B - 负载新城疫病毒F基因质粒DNA的LDH@SiO2纳米粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
负载新城疫病毒F基因质粒DNA的LDH@SiO2纳米粒的制备方法，涉及一种负载新城疫DNA疫苗纳米粒的制备方法。是要解决现有DNA疫苗抗原肌注给药易被胃肠道内的代谢酶和酸性环境降解，需多次免疫，不能够实现缓释和黏膜免疫，质粒DNA免疫原性较弱，需用较强的免疫佐剂或合适的基因递送系统才能有效诱导免疫应答的问题。方法：一、采用溶胶凝胶法合成SiO2纳米粒；二、pVAX1‑optiF/SiO2纳米粒的合成；三、载新城疫F基因质粒DNALDH@SiO2纳米粒的合成。本发明克服了抗原质粒DNA易被降解、免疫持续时间短、次数多等缺点，方法简单，条件温和，生产成本低、易于规模化生产。用于DNA疫苗领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种负载新城疫DNA疫苗纳米粒的制备方法。
背景技术
作为一种急性高度接触性的家禽传染性疾病——新城疫(ND)，它是由新城疫病毒(NDV)引起的，在世界养殖业范围内造成了巨大的经济危害，同时对于行业发展也有着巨大的潜在威胁。由此可见，新城疫疫苗研制及有效防控对养禽业具有重大的现实意义和较高的经济效益。相对于常规疫苗，DNA疫苗有着独特的优点，具体表现为在根本上解决了返祖问题与基因突变问题，并且无毒力回复、工艺易实现、免疫持续时间长、成本价格低、质量风险较小，同时能够激发机体体液免疫和细胞免疫反应、便于储存和运输等优点，具有一定的应用实践和深远的研究前景。但目前DNA疫苗存在着一些不足，如生物利用度低、未达到细胞前就被降解、免疫应答弱等缺点，另外，其给药方式多数是以肌肉注射形式，对于新城疫这类的由于呼吸道或消化道引起的黏膜传染病，肌注给药后，难以通过扩散方式透过细胞膜，难以到达吞噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞(APCs)中，因此导致了表达出的抗原量低，免疫效果不好。因此，黏膜免疫在新城疫防治中具有举足轻重的作用。
基因递送载体的选择直接影响着基因治疗的效果。目前在基因治疗与基因疫苗的研究中，应用最广泛的基因递送载体是病毒载体。但杰西·哥尔辛格事件使得人们对于病毒基因载体的安全性产生了怀疑。纳米材料作为基因递送载体具有非病毒载体的安全性，又具有其独特的优势。壳-核结构的纳米材料可以将两种纳米材料合二为一，从而发挥各自材料的特点，并且作为基因递送载体具有非病毒载体的安全性，又可以保护DNA不被核酸酶降解，增强其稳定性，延长抗原表达时间，提高转染效率等。
发明内容
本发明是要解决现有DNA疫苗抗原肌注给药易被胃肠道内的代谢酶和酸性环境降解，需多次免疫，不能够实现缓释和黏膜免疫，质粒DNA免疫原性较弱，需用较强的免疫佐剂或合适的基因递送系统才能有效诱导免疫应答的问题，提供一种负载新城疫病毒F基因质粒DNA的LDH@SiO2纳米粒的制备方法。
本发明的技术方案是通过溶胶凝胶方法制备SiO2纳米粒，接着使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)修饰SiO2，使其表面修饰成氨基(APTES-SiO2)，带正电；将模型药 物pVAX1-optiF与APTES-SiO2连接，制备pFDNA-SiO2-NPS；利用共沉淀法在pFDNA-SiO2-NPS表面沉淀层状双氢氧化物(LDH)，合成pFDNA-LDH@SiO2-NPs。
本发明负载新城疫病毒F基因质粒DNA的LDH@SiO2纳米粒的制备方法，按以下步骤进行：
一、采用溶胶凝胶法合成SiO2纳米粒；
二、pVAX1-optiF/SiO2纳米粒(pFDNA-SiO2-NPs)的合成
A、SiO2氨基化：
配制体积百分浓度为1％～1.5％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液，称取1～1.5mg SiO2纳米粒置于上述溶液中，室温下磁力搅拌10～12h，离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀三次，将沉淀室温下干燥，即得氨基化的SiO2纳米粒(APTES-SiO2)；
B、称取氨基化的SiO2纳米粒分散于PBS(pH7.4)缓冲溶液中，配制成1mg/mL的纳米粒悬液，向纳米粒悬液加入质粒DNA pVAX1-optiF，用移液枪缓慢吸打混匀，室温下孵育15min，4℃、10000～11000r/min离心10min收集沉淀，用PBS洗涤三次，沉淀用PBS缓冲液重悬，即得pFDNA-SiO2-NPs；
三、载新城疫F基因质粒DNALDH@SiO2纳米粒(pFDNA-LDH@SiO2-NPs)的合成：
a、称取6.3g NaOH和9.1g NaNO3溶解于72mL煮沸后的去离子水中，得溶液A，将16gMg(NO3)2·6H2O和11.7g Al(NO3)3·9H2O溶解于63mL煮沸后的去离子水中，得溶液B；
b、向溶液A中加入0.8g pFDNA-SiO2-NPs，在N2保护及搅拌条件下，将溶液B以3mL/min的速度缓慢滴加到上述混合液中，滴加完毕后继续在室温下搅拌1～1.5h；离心收集沉淀，用煮沸后的去离子水洗涤沉淀至上清液为中性，室温真空干燥即得pFDNA-LDH@SiO2-NPs。
本发明步骤二中质粒DNA pVAX1-optiF已在申请日以前于《密码子优化增强新城疫病毒DNA疫苗的表达水平和免疫效果》(中国动物传染病学报，2009,17(2)：8-16)中公开发表，可由文章作者获得。
本发明制备的纳米粒子可以保护质粒DNA不被DNA酶降解，粒径可控。
本发明制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs平均粒径为470.1nm，多分散系数为0.005，Zeta电位为+16.82mV，纳米粒子的包封率在90％以上，载药量在45％以上。
本发明的技术方案是采用溶液凝胶法合成不同粒径的介孔SiO2，再用共沉淀法在介孔SiO2表面包覆LDH，形成LDH@SiO2，借助核结构完成对新城疫病毒F基因质粒DNA 的搭载，建立新城疫DNA疫苗纳米化的安全级黏膜免疫递送系统(pDNA-LDH@SiO2-NPs)。本发明合成的LDH@SiO2既具有LDH体内分散性好、对pH敏感、Zeta电位高，又具有能延长抗原滞留、利于DC识别、促进DC成熟和向淋巴结趋化的优势，解决了单纯LDH作为DNA疫苗所面临的问题；同时，LDH@SiO2具有SiO2介孔结构特点，突破了LDH搭载质粒DNA有限的瓶颈。
本发明制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs克服了抗原质粒DNA易被降解、免疫持续时间短、免疫次数多等缺点，且制备方法简单易行，条件温和，生产成本较低、易于规模化生产。
附图说明
图1为实施例1制备的二氧化硅的透射电子显微镜图；
图2为实施例1制备的pFDNA-SiO2-NPs的透射电子显微镜图；
图3为实施例1制备的pFDNA-SiO2-NPs抗DNA酶降解的琼脂糖凝胶电泳图
图4为实施例1制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs的红外光谱图；
图5为实施例1制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs的XRD图；
图6为实施例1制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs的体外释放图；
图7为实施例1制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs的透射电镜图；
图8为实施例1制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs的粒径分布图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式负载新城疫病毒F基因质粒DNA的LDH@SiO2纳米粒的制备方法，按以下步骤进行：
一、采用溶胶凝胶法合成SiO2纳米粒；
二、pVAX1-optiF/SiO2纳米粒(pFDNA-SiO2-NPs)的合成
A、SiO2氨基化：
配制体积百分浓度为1％～1.5％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液，称取1～1.5mg SiO2纳米粒置于上述溶液中，室温下磁力搅拌10～12h，离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀三次，将沉淀室温下干燥，即得氨基化的SiO2纳米粒(APTES-SiO2)；
B、称取氨基化的SiO2纳米粒分散于PBS(pH7.4)缓冲溶液中，配制成1mg/mL的纳米粒悬液，向纳米粒悬液加入质粒DNA pVAX1-optiF，用移液枪缓慢吸打混匀，室温 下孵育15min，4℃、10000～11000r/min离心10min收集沉淀，用PBS洗涤三次，沉淀用PBS缓冲液重悬，即得pFDNA-SiO2-NPs；
三、载新城疫F基因质粒DNALDH@SiO2纳米粒(pFDNA-LDH@SiO2-NPs)的合成：
a、称取6.3g NaOH和9.1g NaNO3溶解于72mL煮沸后的去离子水中，得溶液A，将16gMg(NO3)2·6H2O和11.7g Al(NO3)3·9H2O溶解于63mL煮沸后的去离子水中，得溶液B；
b、向溶液A中加入0.8g pFDNA-SiO2-NPs，在N2保护及搅拌条件下，将溶液B以3mL/min的速度缓慢滴加到上述混合液中，滴加完毕后继续在室温下搅拌1～1.5h；离心收集沉淀，用煮沸后的去离子水洗涤沉淀至上清液为中性，室温真空干燥即得pFDNA-LDH@SiO2-NPs。
本实施方式步骤一中采用溶胶凝胶法合成SiO2纳米粒的具体步骤为：
依次向洁净的烧杯中加入90mL无水乙醇、12.5mL去离子水、2mL浓氨水(NH3含量为28％)，并在室温下200r/min磁力搅拌使其混合均匀；之后，在磁力搅拌下，一次性快速向其中加入10mL TEOS，加入TEOS后溶液逐渐变成乳白色，继续在室温下磁力搅拌2h；反应停止后，4℃、10000r/min离心收集SiO2纳米粒，无水乙醇反复洗涤沉淀三次后将沉淀置于空气中干燥，即获得SiO2纳米粒。
本实施方式所使用的正硅酸乙酯，浓氨水都是普通的化学试剂，生产成本低，适宜大规模生产。本发明制备的SiO2表面光滑、形态规则、呈球形、粒径大小均一、分散性好，无明显黏连、塌陷等现象
新型纳米材料的出现，为获得高品质的DNA疫苗载体提供了可能。层状双金属氢氧化物(LDHs)是一类由带正电荷的金属氢氧化物层和层间填充可交换阴离子所构成的层柱状化合物。LDH作为基因递送载体具有很多优点：1)DNA类生物大分子能稳定存在于LDH纳米复合材料中；2)体内分散性好，在pH 3-5环境中，释药速率快；3)生物相容性和缓释效应好，且有较高Zeta电位，易与细胞表面接触，进入细胞内部，提高转染效率。但LDH作为基因递送载体也存在一些不足：1)LDH层间距离较小，质粒DNA很难插入；2)质粒DNA吸附于LDH表面虽然可以完成搭载，但会使LDH对DNA保护效应减弱，且DNA搭载量非常有限。以介孔SiO2为原料的纳米材料具有以下特点：1)具有高的比孔容，可以容纳更多的DNA大分子；2)富含硅羟基的表面，易于实现功能化；3)具有pH敏感性，可以通过调节pH实现对DNA的释放；4)独特的孔壁结构能够为DNA提供保护。由于壳-核结构的纳米材料可以将两种纳米材料合二为一，发挥各 自材料的特点。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二A中配制体积百分浓度为1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二A中称取1mg SiO2纳米粒置于3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二B中质粒DNA pVAX1-optiF与氨基化的SiO2纳米粒的质量比为1:5。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二B中4℃、10000r/min离心10min收集沉淀。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三b中滴加完毕后继续在室温下搅拌1.5h。其它与具体实施方式一至五之一相同。
实施例：
本实施例负载新城疫病毒F基因质粒DNA的LDH@SiO2纳米粒的制备方法，按以下步骤进行：
一、采用溶胶凝胶法合成SiO2纳米粒：依次向洁净的烧杯中加入90mL无水乙醇、12.5mL去离子水、2mL浓氨水(NH3含量为28％)，并在室温下200r/min磁力搅拌使其混合均匀；之后，在磁力搅拌下，一次性快速向其中加入10mL TEOS，加入TEOS后溶液逐渐变成乳白色，继续在室温下磁力搅拌2h；反应停止后，4℃、10000r/min离心收集SiO2纳米粒，无水乙醇反复洗涤沉淀三次后将沉淀置于空气中干燥，即获得SiO2纳米粒。
此方法制备的二氧化硅的透射电子显微镜图如图1，可见制备的SiO2表面光滑、形态规则、呈球形、粒径大小均一、分散性好，无明显黏连、塌陷等现象。
二、pVAX1-optiF/SiO2纳米粒(pFDNA-SiO2-NPs)的合成
A、SiO2氨基化：
配制体积百分浓度为1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液，称取1mg SiO2纳米粒置于上述溶液中，室温下磁力搅拌12h，离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀三次，将沉淀室温下干燥，即得氨基化的SiO2纳米粒(APTES-SiO2)；
B、称取氨基化的SiO2纳米粒分散于PBS(pH7.4)缓冲溶液中，配制成1mg/mL的纳米粒悬液，向纳米粒悬液加入质粒DNA pVAX1-optiF，用移液枪缓慢吸打混匀，室温 下孵育15min，4℃、10000r/min离心10min收集沉淀，用PBS洗涤三次，沉淀用PBS缓冲液重悬，即得pFDNA-SiO2-NPs。质粒DNApVAX1-optiF与氨基化的SiO2纳米粒的质量比为1:5。
制备的pFDNA-SiO2-NPs的透射电子显微镜图如图2。
三、载新城疫F基因质粒DNALDH@SiO2纳米粒(pFDNA-LDH@SiO2-NPs)的合成：
a、称取6.3g NaOH和9.1g NaNO3溶解于72mL煮沸后的去离子水中，得溶液A，将16gMg(NO3)2·6H2O和11.7g Al(NO3)3·9H2O溶解于63mL煮沸后的去离子水中，得溶液B；
b、向溶液A中加入0.8g pFDNA-SiO2-NPs，在N2保护及搅拌条件下，将溶液B以3mL/min的速度缓慢滴加到上述混合液中，滴加完毕后继续在室温下搅拌1.5h；离心收集沉淀，用煮沸后的去离子水洗涤沉淀至上清液为中性，室温真空干燥即得pFDNA-LDH@SiO2-NPs。
图3为本实施例制备的pFDNA-SiO2-NPs抗DNA酶降解的琼脂糖凝胶电泳图，可见SiO2可以保护质粒DNA不被DNA酶降解；M泳道为Maker，1泳道为加入DNA酶的质粒DNA，2泳道为质粒DNA，3-8泳道为SiO2纳米粒子与质粒DNA的质量比分别是1:5，1:1，5:1，10:1，20:1，30:1。
图4为本实施例制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs的红外光谱图，可见LDH@SiO2特征峰
图5为本实施例制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs的XRD图，可见LDH在包覆pFDNA-SiO2-NPs过程中，晶型和结构都没有发生改变，合成的LDH晶相单一、结晶度好。
图6为本实施例制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs的体外释放图，可见pFDNA-LDH@SiO2-NPs具有明显的缓慢释放特性。
图7为本实施例制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs的透射电镜图，制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs形态十分规则，外形完整，没有明显的粘连，均一性好，LDH与pFDNA-SiO2-NPs能够形成较有效的包覆，包覆在pFDNA-SiO2-NPs外层的LDH已无明显的片状结构，而是以密堆的方式包覆在其表面。
图8为本实施例制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs的粒径分布图，可见制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs平均粒径为470.1nm。
表1为此方法下制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs免疫SPF鸡后产生的IgG抗体效价， 可见制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs可以有效的刺激鸡体产生较高的黏膜免疫应答。
表2为此方法下制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs免疫SPF鸡后产生的IgA抗体效价，可见制备的pFDNA-LDH@SiO2-NPs可以有效的刺激鸡体产生较高的黏膜免疫应答。
表1免疫后血清中IgG抗体效价(单位：Log2)
注：数据均以表示，同一列数据中右上角无相同小写字母表明组间差异显著(p＜0.05)。
表2免疫后血清中IgA抗体效价(单位：pg/mL)
注：数据均以表示，同一列数据中右上角无相同小写字母表明组间差异显著(p＜0.05)。
Claims (1)
1.负载新城疫病毒F基因质粒DNA的LDH@SiO2纳米粒的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、采用溶胶凝胶法合成SiO2纳米粒：依次向洁净的烧杯中加入90mL无水乙醇、12.5mL去离子水、2mL浓氨水，并在室温下200r/min磁力搅拌使其混合均匀；之后，在磁力搅拌下，一次性向其中加入10mL TEOS，加入TEOS后溶液逐渐变成乳白色，继续在室温下磁力搅拌2h；反应停止后，4℃、10000r/min离心收集SiO2纳米粒，无水乙醇反复洗涤沉淀三次后将沉淀置于空气中干燥，即获得SiO2纳米粒；所述浓氨水中NH3含量为28％；
二、pVAX1-optiF/SiO2纳米粒的合成
A、SiO2氨基化：
配制体积百分浓度为1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，称取1mg SiO2纳米粒置于上述溶液中，室温下磁力搅拌12h，离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀三次，将沉淀室温下干燥，即得氨基化的SiO2纳米粒；
B、称取氨基化的SiO2纳米粒分散于PBS缓冲溶液中，配制成1mg/mL的纳米粒悬液，向纳米粒悬液加入质粒DNA pVAX1-optiF，用移液枪吸打混匀，室温下孵育15min，4℃、10000r/min离心10min收集沉淀，用PBS洗涤三次，沉淀用PBS缓冲液重悬，即得pFDNA-SiO2-NPs；质粒DNA pVAX1-optiF与氨基化的SiO2纳米粒的质量比为1:5；
三、载新城疫F基因质粒DNA LDH@SiO2纳米粒的合成：
a、称取6.3g NaOH和9.1g NaNO3溶解于72mL煮沸后的去离子水中，得溶液A，将16g Mg(NO3)2·6H2O和11.7g Al(NO3)3·9H2O溶解于63mL煮沸后的去离子水中，得溶液B；
b、向溶液A中加入0.8g pFDNA-SiO2-NPs，在N2保护及搅拌条件下，将溶液B以3mL/min的速度缓慢滴加到上述混合液中，滴加完毕后继续在室温下搅拌1.5h；离心收集沉淀，用煮沸后的去离子水洗涤沉淀至上清液为中性，室温真空干燥即得pFDNA-LDH@SiO2-NPs。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |