CN104730236A - 一种蛋白质固定试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检测领域，具体公开了一种蛋白质固定试剂及其应用。本发明所述固定试剂括阳离子表面活性剂和阳离子型高分子聚合物中的一种、缓冲液。本发明以阳离子表面活性剂或阳离子型高分子聚合物为主要成分，配合缓冲液等组分组成了一种蛋白质固定试剂，其能够在NC膜免疫诊断试剂的制备过程中，显著改善NC膜固定蛋白质抗原的能力，使得免疫诊断结果更加稳定和准确。

Description

一种蛋白质固定试剂及其应用
技术领域
本发明涉及医学检测领域，具体涉及一种蛋白质固定试剂及其应用。
背景技术
硝酸纤维素膜(NC膜)是一种疏水的膜材料，由于这种材料固定蛋白质能力很强，目前这种膜材已经应用于免疫诊断试纸条的开发，但由于这种膜材是疏水的，诊断试剂厂家很难根据不同厂家的材质进行处理，并且处理操作非常麻烦、诊断试剂性能不一致，因此希望购买的NC膜经过亲水处理。所以现在市场上NC膜的生产厂家都推出经亲水处理的膜材提供给免疫诊断试剂厂家用于生产。
这种亲水的NC膜是通过在NC膜内添加大量的表面活性剂及亲水大分子物质来解决NC膜的亲水性问题。但是这种解决方法却严重影响了NC膜固定蛋白质的能力。因为蛋白质与NC膜的相互作用是一种非特异性吸附作用力，当这些表面活性剂、大分子物质封闭了硝酸纤维素固定蛋白质的非特异性吸附位点后，蛋白质就难以吸附，导致蛋白质固定不牢固。当NC膜固定的是超大分子的抗体时，抗体固定效果还比较稳定，当固定是一种比较小的蛋白质分子(如BSA、HAS等)时，这种蛋白质就非常不牢固，很容易随着层析液的流动而被冲走，从而导致诊断试条的测试结果非常不稳定。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种蛋白质固定试剂及其应用，使其能够提高NC膜上蛋白质固定效果，可以应用于NC膜免疫诊断试纸条的制备中。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种蛋白质固定试剂，包括阳离子表面活性剂和阳离子型高分子聚合物中的一种、缓冲液。
针对现有的NC膜固定蛋白质抗原效果不佳，致使免疫诊断结果不稳定的缺点，本发明提供了一种以阳离子表面活性剂或阳离子型高分子聚合物为主要成分的蛋白质固定试剂，其可以在制备NC膜免疫诊断试纸条中与相应蛋白质抗原一同作为试纸条上T(test)线划膜溶液，增强相应蛋白质抗原固定在NC膜上的效果，从而解决了检测不稳定的问题。其中，所述相应蛋白质抗原视检测和制备需求而确定，如为了制备尿微量白蛋白试纸条，相应蛋白抗原为人血清白蛋白，这种对应关系对于本领域技术人员是十分清楚的，相应蛋白质抗原的工作浓度一般为0.5mg/ml-5mg/ml，优选为1mg/ml-2mg/ml。
作为本发明的优选，所述阳离子表面活性剂质量百分含量为0.005％-0.1％，更优选为0.01％-0.05％，还可以从此范围中选择0.02％、0.03％或0.04％。
作为优选，所述阳离子型高分子聚合物质量百分含量为0.005％-0.1％，更优选为0.02％-0.05％，还可以从此范围中选择0.03％或0.04％。
作为优选，所述缓冲液的浓度为0.005-0.1mol/L。
作为优选，所述缓冲液为磷酸缓冲液，更优选为pH值7.4的磷酸缓冲液。
作为优选，所述阳离子型高分子聚合物选自瓜尔胶、聚丙烯酰胺。
作为优选，所述阳离子表面活性剂选自季铵盐类表面活性剂；更优选地，所述季铵盐类表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵或十二烷基三甲基溴化铵。
此外，为了更好地利于检测，本发明所述固定试剂还包括蛋白质保护剂，所述蛋白质保护剂选自蔗糖、海藻糖、麦芽糖等糖类物质，质量百分含量为0.5％-10％。
与直接用相应蛋白质抗原划膜溶液制备的NC膜免疫诊断试纸条相比，加入了本发明所述固定试剂制备而成试纸条，其T(test)/C(control)面积比更大，说明T线固定的蛋白质抗原越牢固，跟流经T线的样本作用才越强烈，从而才使T/C面积比更大。同时，利用本发明固定试剂制备的试纸条进行多次检测，其CV相比对照更好，结果更稳定。
基于此，本发明提供了本发明任意所述固定试剂在制备NC膜免疫诊断试纸条中的应用。
同时，本发明还提供了一种NC膜免疫诊断试纸条的制备方法，用缓冲液稀释蛋白质抗原，然后加入阳离子表面活性剂或阳离子型高分子聚合物，以此混合溶液作为T线划膜溶液划膜，同时进行C线化膜，划膜完后的NC膜在烘箱中过夜烤干，获得所述NC膜免疫诊断试纸条。
其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液，更优选为pH值7.0-7.4的磷酸缓冲液。
作为优选，所述缓冲液的浓度为0.005-0.1mol/L。
所述稀释蛋白质抗原为稀释蛋白质抗原终浓度至0.5mg/ml-5mg/ml，更优选为1mg/ml-2mg/ml。
作为优选，所述阳离子表面活性剂质量百分含量为0.005％-0.1％，更优选为0.01％-0.05％，还可以从此范围中选择0.02％、0.03％或0.04％。
作为优选，所述阳离子型高分子聚合物质量百分含量为0.005％-0.1％，更优选为0.02％-0.05％，还可以从此范围中选择0.03％或0.04％。
作为优选，所述阳离子表面活性剂选自季铵盐类表面活性剂；更优选地，所述季铵盐类表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵或十二烷基三甲基溴化铵。
本发明所述制备方法还包括加入蛋白质保护剂，所述蛋白质保护剂选自蔗糖、海藻糖、麦芽糖等糖类物质，质量百分含量为0.5％-10％。
由以上技术方案可知，本发明以阳离子表面活性剂或阳离子型高分子聚合物为主要成分，配合缓冲液等组分组成了一种蛋白质固定试剂，其能够在NC膜免疫诊断试剂的制备过程中，显著改善NC膜固定蛋白质抗原的能力，使得免疫诊断结果更加稳定和准确。
具体实施方式
本发明公开了一种蛋白质固定试剂及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的组合物和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明具体实施方式中所采用的NC膜如非特别说明，均为经过亲水化处理的市售NC膜。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：本发明所述蛋白质固定试剂
(1)聚丙烯酰胺0.005％，pH7.4、0.005mol/L磷酸缓冲液；
(2)聚丙烯酰胺0.02％，pH7.4、0.01mol/L磷酸缓冲液；
(3)聚丙烯酰胺0.05％，pH7.4、0.06mol/L磷酸缓冲液；
(4)聚丙烯酰胺0.1％，pH7.4、0.1mol/L磷酸缓冲液。
实施例2：本发明所述蛋白质固定试剂
(1)瓜尔胶0.005％，pH7.4、0.008mol/L磷酸缓冲液；
(2)瓜尔胶0.02％，pH7.4、0.02mol/L磷酸缓冲液；
(3)瓜尔胶0.05％，pH7.4、0.08mol/L磷酸缓冲液；
(4)瓜尔胶0.1％，pH7.4、0.09mol/L磷酸缓冲液。
实施例3：本发明所述蛋白质固定试剂
(1)十六烷基三甲基溴化铵0.005％，pH7.0、0.006mol/L磷酸缓冲液；
(2)十六烷基三甲基溴化铵0.01％，pH7.4、0.03mol/L磷酸缓冲液；
(3)十六烷基三甲基溴化铵0.05％，pH7.4、0.05mol/L磷酸缓冲液；
(4)十六烷基三甲基溴化铵0.1％，pH7.4、0.1mol/L磷酸缓冲液。
实施例4：蛋白质固定效果对比
对照组：1ml终浓度为2mg/ml的HAS(人血清白蛋白)溶液，未加其他任何试剂；
实验组1：1ml包含聚丙烯酰胺0.005％，pH7.4、0.005mol/L磷酸缓冲液，终浓度为2mg/ml的HAS的溶液，未加其他试剂；
实验组2：1ml包含聚丙烯酰胺0.02％，pH7.4、0.01mol/L磷酸缓冲液，终浓度为2mg/ml的HAS的溶液，未加其他试剂；
实验组3：1ml包含聚丙烯酰胺0.05％，pH7.4、0.06mol/L磷酸缓冲液，终浓度为2mg/ml的HAS的溶液，未加其他试剂；
将上述实验组溶液作为MAU(尿微量白蛋白试条)的T(Test)线划膜溶液，C(control)线采用羊抗鼠溶液，所有实验组中C线划膜溶液的配方都一致，然后进行划膜，划膜后在37℃烘箱中烘烤过夜，第二天把板取出，组装成试剂卡进行测试。每个实验组测试2个样本浓度，分别为0、200mg/L，测试原始值按照T/C面积比值进行计算，每个实验组每个浓度重复测试10次，实验结果见表1：
表1
由表1数据可以看出，在测试相同浓度的实验样本时，实验组比对照组的测试值都大，这说明只有T线固定的HSA蛋白质越牢固，跟流经T线的样本作用才越强烈，从而使T/C面积比更大。同时，加入本发明所述固定试剂后，多次检测的结果的CV更小，表明本发明所述固定试剂具有较好固定蛋白质抗原的能力，避免由于蛋白质抗原在NC膜上固定不牢靠造成检测结果的不稳定。
实施例5：蛋白质固定效果对比
对照组：1ml终浓度为2mg/ml的HAS(人血清白蛋白)溶液，未加其他任何试剂；
实验组1：1ml包含瓜尔胶0.005％，pH7.4、0.008mol/L磷酸缓冲液，终浓度为2mg/ml的HAS的溶液，未加其他试剂；
实验组2：1ml包含瓜尔胶0.02％，pH7.4、0.02mol/L磷酸缓冲液，终浓度为2mg/ml的HAS的溶液，未加其他试剂；
实验组3：1ml包含瓜尔胶0.05％，pH7.4、0.08mol/L磷酸缓冲液，终浓度为2mg/ml的HAS的溶液，未加其他试剂；
将上述实验组溶液作为MAU(尿微量白蛋白试条)的T(Test)线划膜溶液，C(control)线采用羊抗鼠溶液，所有实验组中C线划膜溶液的配方都一致，然后进行划膜，划膜后在37℃烘箱中烘烤过夜，第二天把板取出，组装成试剂卡进行测试。每个实验组测试2个样本浓度，分别为0、200mg/L，测试原始值按照T/C面积比值进行计算，每个实验组每个浓度重复测试10次，实验结果见表2：
表2
由表2数据可以看出，在测试相同浓度的实验样本时，实验组比对照组的测试值都大，这说明只有T线固定的HSA蛋白质越牢固，跟流经T线的样本作用才越强烈，从而使T/C面积比更大。同时，加入本发明所述固定试剂后，多次检测的结果的CV更小，表明本发明所述固定试剂具有较好固定蛋白质抗原的能力，避免由于蛋白质抗原在NC膜上固定不牢靠造成检测结果的不稳定。
实施例6：蛋白质固定效果对比
对照组：1ml终浓度为2mg/ml的HAS(人血清白蛋白)溶液，未加其他任何试剂；
实验组1：1ml包含十六烷基三甲基溴化铵0.01％、pH7.4、0.03mol/L磷酸缓冲液、终浓度为2mg/ml的HAS的溶液，未加其他试剂；
实验组2：1ml包含十六烷基三甲基溴化铵0.05％、pH7.4、0.05mol/L磷酸缓冲液、终浓度为2mg/ml的HAS的溶液，未加其他试剂；
实验组3：1ml包含十六烷基三甲基溴化铵0.1％、pH7.4、0.1mol/L磷酸缓冲液、终浓度为2mg/ml的HAS的溶液，未加其他试剂；
将上述实验组溶液作为MAU(尿微量白蛋白试条)的T(Test)线划膜溶液，C(control)线采用羊抗鼠溶液，所有实验组中C线划膜溶液的配方都一致，然后进行划膜，划膜后在37℃烘箱中烘烤过夜，第二天把板取出，组装成试剂卡进行测试。每个实验组测试2个样本浓度，分别为0、200mg/L，测试原始值按照T/C面积比值进行计算，每个实验组每个浓度重复测试10次，实验结果见表3：
表3
由表3数据可以看出，在测试相同浓度的实验样本时，实验组比对照组的测试值都大，这说明只有T线固定的HSA蛋白质越牢固，跟流经T线的样本作用才越强烈，从而使T/C面积比更大。同时，加入本发明所述固定试剂后，多次检测的结果的CV更小，表明本发明所述固定试剂具有较好固定蛋白质抗原的能力，避免由于蛋白质抗原在NC膜上固定不牢靠造成检测结果的不稳定。
实施例7：蛋白质固定效果对比
对照组：1ml终浓度为1.5mg/ml的牛血清蛋白交联的吗啡的溶液，未加其他任何试剂；
实验组1：1ml包含十六烷基三甲基溴化铵0.01％，pH7.0、0.03mol/L磷酸缓冲液，终浓度为1.5mg/ml的牛血清蛋白交联的吗啡的溶液，未加其他试剂；
实验组2：1ml包含十六烷基三甲基溴化铵0.05％，pH7.0、0.05mol/L磷酸缓冲液，终浓度为1.5mg/ml的牛血清蛋白交联的吗啡的溶液，未加其他试剂；
实验组3：1ml包含十六烷基三甲基溴化铵0.1％，pH7.0、0.1mol/L磷酸缓冲液，终浓度为1.5mg/ml的牛血清蛋白交联的吗啡的溶液，未加其他试剂；
将上述实验组溶液作为牛血清蛋白交联的吗啡(吗啡试条)的T(Test)线划膜溶液，C(control)线采用羊抗鼠溶液，然后进行划膜，划膜后在37℃烘箱中烘烤过夜，第二天把板拿出来，组装成试剂卡进行测试。每个实验组测试2个样本浓度，分别为0、300ng/ml，每个实验组每个浓度重复测试10次，实验结果见表4：
表4
由表4数据可以看出，在测试相同浓度的实验样本时，实验组比对照组的测试值都大，这说明只有T线固定的牛血清蛋白交联的吗啡越牢固，跟流经T线的样本作用才越强烈，从而使T/C面积比更大。同时，加入本发明所述固定试剂后，多次检测的结果的CV更小，表明本发明所述固定试剂具有较好固定蛋白质抗原的能力，避免由于蛋白质抗原在NC膜上固定不牢靠造成检测结果的不稳定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种蛋白质固定试剂，其特征在于，包括阳离子表面活性剂和阳离子型高分子聚合物中的一种、缓冲液。
2.根据权利要求1所述固定试剂，其特征在于，所述阳离子表面活性剂质量百分含量为0.005％-0.1％。
3.根据权利要求1所述固定试剂，其特征在于，所述阳离子型高分子聚合物质量百分含量为0.001％-0.05％。
4.根据权利要求1所述固定试剂，其特征在于，所述缓冲液为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液等。
5.根据权利要求1所述固定试剂，其特征在于，所述阳离子型高分子聚合物选自瓜尔胶、聚丙烯酰胺。
6.根据权利要求1所述固定试剂，其特征在于，所述阳离子表面活性剂选自季铵盐类表面活性剂。
7.根据权利要求6所述固定试剂，其特征在于，所述季铵盐类表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵或十二烷基三甲基溴化铵。
8.根据权利要求1所述固定试剂，其特征在于，还包括蛋白质保护剂，所述蛋白质保护剂选自蔗糖、海藻糖、麦芽糖、果糖等糖类物质，质量百分含量在0.5％-10％。
9.权利要求1-8任意一项所述固定试剂在制备NC膜免疫诊断试纸条中的应用。
10.一种NC膜免疫诊断试纸条的制备方法，其特征在于，用缓冲液稀释蛋白质抗原，然后加入阳离子表面活性剂或阳离子型高分子聚合物，以此混合溶液作为T线划膜溶液划膜，同时进行C线划膜，划膜完后的NC膜在烘箱中过夜烤干，获得所述NC膜免疫诊断试纸条。
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