CN104725631A - 一种聚乙二醇单甲醚修饰甘草次酸作为肝靶向给药载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：（1）聚乙二醇单甲醚-对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制备；（2）聚乙二醇单甲醚-邻苯二甲酰亚胺(mPEG-PI)的制备；（3）单端氨基聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH2)的制备；（4）聚乙二醇单甲醚-甘草次酸（mPEG-18β-GA）的制备；该给药载体，具有水溶解性高、肝靶向能力高和纯度高的优点；所述mPEG-OTs的收率为84.54%以上，纯度为95.74%以上，mPEG-PI的收率为88.96%以上，纯度为96.88%以上，mPEG-NH2的收率为88.72%以上，纯度为99.51%以上，mPEG-18β-GA收率为82.43%以上，纯度为99.65%以上。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种聚乙二醇单甲醚修饰甘草次酸作为肝靶向给药载体及其制备方法。
技术背景
目前，肝癌在我们的发病率较高，原发性肝癌发发病率占全球的45%，死亡率在恶性肿瘤中高达第二位，5年之内的存活率仅有5%。目前来看，治疗癌症的方法有器官移植、放疗、化疗等方法。对于肝癌，器官移植收到供体的匮乏的严重限制并存在免疫排斥问题；放疗会直接损伤胆管，一般不用于肝癌的治疗。因此，使用抗肿瘤药物的“化疗法”在肝癌的治疗中占有重要的地位。目前来看，“化疗法”效果不明显，其主要原因是大多抗肿瘤药物的水溶性较差，靶向性较低，毒性大，加之肝脏本身对药物的耐受能力有限，药物剂量小时作用甚微；大剂量用药无疑会严重损伤其它脏器导致器官衰竭。因此发展可控性肝靶向性的给药载体对肝脏肿瘤的治疗十分必要，已成为新一代药物传递系统的重点研究方向。肝靶向给药载体（Hepatic targeted drug delivery System ，HTDDS）可将药物高效输送至肝脏并在病变部位高浓度富集，减轻药物对其它脏器的损害，减少用药剂量和给药次数，提高疗效。
目前，载体胶束作为药物载体已经显示了较好的应用前景，其组成材料具有生物可降解性，毒性小等特点，还可缓释药物，延长药物作用时间；静脉给药后可由肝脏Kuppfer细胞摄取而被动靶向于肝，使药物达到肝器官的目的。但是普通胶束容易被调理素识别，被肝脏以外的其他单核巨噬细胞系统吞噬，存在选择性差，靶向效率低的问题。
Negishi等在证实了离体大鼠肝细胞均浆的细胞膜组分中含有多量甘草次酸（Glycyrrhetinic acid ，GA）特异结合为点，在所有脏器组织中，肝脏的GA结合位点活性最高。GA与该结合位点的结合可成饱和性、高度特异性，且该结合位点具有蛋白质性质。国内也有学者用投射电镜进行观察，证实了肝细胞表面确实存在大量GA受体。随后国内外一些学者纷纷报道了以甘草酸/甘草次酸修饰的脂质体或血清蛋白可以在肝脏组织中富集。
如毛声俊在肝细胞靶向甘草次酸表面修饰脂质体的制备[中国中药杂志，2003年4月第28卷第4期，323-331]以毛声俊在2007年Preparation ，characterization and updtake by primary cultured rat hepatocytes of liposomes sufer-modofied with glycyrrhetinic acid .Pharmazie ，[ORIGINAL ， ARTICLES，2007年，62卷第8期；614-619]中公开了一种甘草次酸表面修饰脂质体，它是将GA与硬脂醇、琥珀酸酐偶联，合成一新型两亲性导向分子，将其掺入脂质体中，介导该修饰脂质体与肝细胞表面的GA受体特异结合，以期达到肝细胞主动靶向作用。该甘草次酸表面修饰脂质体简称LP-SM-GA。制得的甘草次酸修饰的脂质体平均粒径在65～79nm之间，甘草次酸修饰脂质体的摩尔含量最高位10%。又如，中国专利申请CN101006983A公开了甘草酸修饰壳聚糖/羧化壳聚糖复合载药纳米粒的制备方法，甘草酸修饰组可进入鼠肝实质细胞的细胞核中，相同时间内荧光标记的甘草酸盐修饰的纳米粒在肝实质细胞的荧光强度对照组强于对照组，具体是将甘草酸盐为靶向基团，通过静电相互作用制备成载药纳米粒而并未涉及甘草次酸的相关内容（文献报道肝细胞膜上甘草次酸的结合位点多余甘草酸）；中国专利申请CN1743008A公开了甘草次酸修饰的壳聚糖纳米粒子并表现出明显的靶向性，但是甘草次酸直接修饰壳聚糖的制备条件较为意义重大；中国专利CN101254308B制备了甘草次酸-氨基聚乙二醇/壳聚糖或壳聚糖衍生物肝靶向复合纳米粒，体外细胞实验显示对肝细胞有很强的结合能力，可提高给药载体的肝靶向能力，能实现对肝脏的靶向定位。
但现有技术反应收率低，反应产物纯度不高，水溶解性低，肝靶向能力不足，反应成本高，并且反应大多以吡啶作为缚酸剂，中和反应中生成的盐酸，但吡啶毒性大，易损害实验人员健康，而且回收困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚乙二醇单甲醚修饰甘草次酸作为肝靶向给药载体及其制备方法，具有收率高、水溶解性高、纯度、肝靶向能力、毒性小、成本低和回收简单的优点。
为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）聚乙二醇单甲醚-对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制备；
（2）聚乙二醇单甲醚-邻苯二甲酰亚胺(mPEG-PI)的制备；
（3）单端氨基聚乙二醇单甲醚 (mPEG-NH2)的制备；
（4）聚乙二醇单甲醚-甘草次酸（mPEG-18β-GA）的制备。
以下是对上述技术方案的进一步优化：
所述聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法中采用的有机溶剂为：无水乙醚，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。
所述聚乙二醇单甲醚-对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制备方法包括以下步骤：
（1）反应步骤；
（2）提纯步骤。
所述反应步骤中:聚乙二醇单甲醚(mPEG)与对甲苯磺酰氯(TsCl)的摩尔比为1～3：3～9。
所述聚乙二醇单甲醚-邻苯二甲酰亚胺(mPEG-PI)的制备方法包括以下步骤：
（1）反应步骤；
（2）提纯步骤。
所述反应步骤中：聚乙二醇单甲醚-对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)与邻苯二甲酰亚胺钾(PPI)的摩尔比为1～6：3～18。
所述单端氨基聚乙二醇单甲醚 (mPEG-NH2)的制备方法包括以下步骤：
（1）反应步骤；
（2）提纯步骤。
所述聚乙二醇单甲醚-甘草次酸（mPEG-18β-GA）的制备方法包括以下步骤：
（1）反应步骤；
其中单端氨基单甲氧基聚乙二醇 (mPEG-NH2)、18β-GA、DCC和NHS的摩尔比为：3～12：1～4：3～12：3～12；
（2）提纯步骤。
所述mPEG-OTs收率为84.54%以上，mPEG-PI收率为88.96%以上，mPEG-NH2收率为88.72%以上，mPEG-18β-GA收率为82.43%以上。
所述mPEG-OTs的纯度为95.74%以上，mPEG-PI的纯度为96.88%以上，mPEG-NH2的纯度为99.51%以上，mPEG-18β-GA的纯度为99.65%以上。
当甘草次酸的羧基与单氨基聚乙二醇单甲醚反应时，得到聚乙二醇单甲醚-甘草次酸（mPEG-18β-GA）：
mPEG-18β-GA化学结构 （n=45～2000）
反应过程如下：
本发明采用以上技术方案，具有以下有益效果：
1.本发明中mPEG主链在各步反应中未发生断裂，各步产物纯化处理均采用二氯甲烷溶解-无水乙醚沉淀，简单易得。
2. 本发明采用三乙胺为缚酸剂，毒性小，反应回收简单。
3.二氯甲烷直接作本发明反应中的溶剂，减少了操作步骤，操作简单，并可减少反应成本。
4．本发明制得的聚乙二醇单甲醚-甘草次酸药物载体，水溶性高，可包载多种药物，如肝脏疾病治疗药物及其他疾病治疗性药物。制备药物载体可根据药物的理化性质，以载体的粒径、包封率和载药量筛选材料的种类和用量以及较佳的制备方法。
5.实验结果表明：pH2.0下，油水比例1:1，聚乙二醇改性甘草次酸在正辛醇-水体系中的油水分配系数lgP为-0.651；油水比例2:1，聚乙二醇改性甘草次酸在正辛醇-水体系中的油水分配系数lgP为-0.744。pH7.4下，油水比例1:1，聚乙二醇改性甘草次酸在正辛醇-水体系中的油水分配系数lgP为-0.653；油水比例2:1，聚乙二醇改性甘草次酸在正辛醇-水体系中的油水分配系数lgP为-0.780。该实验结果说明经聚乙二醇修饰后的甘草次酸水溶解性显著提高，可作为难溶性药物的给药载体。
6. mPEG-OTs收率为84.54%以上，mPEG-PI收率为88.96%以上，mPEG-NH2收率为88.72%以上，mPEG-18β-GA收率为82.43%以上。
7. mPEG-OTs的纯度为95.74%以上，mPEG-PI的纯度为96.88%以上，mPEG-NH2的纯度为99.51%以上，mPEG-18β-GA的纯度为99.65%以上。
具体实施方式
以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。
实施例1：
（1）聚乙二醇单甲醚-对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制备
精密称取2.0mmol聚乙二醇单甲醚mPEG，置于装有回流冷凝管和机械搅拌器的干燥三口瓶中，加入适量二氯甲烷，待mPEG完全溶解之后，通氮气，少量多次共加入6.0mmol对甲苯磺酰氯TsCl，再加入适量三乙胺TEA，在室温下通氮气保护，搅拌回流反应4h。反应结束后，反应混合物过滤除去不溶性固体，滤液转移至分液漏斗中，用稀盐酸萃取洗涤3次，得到的有机相用饱和碳酸钠溶液中和至pH为7，之后再用蒸馏水洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，静置过夜，抽滤，将滤液于50℃旋转蒸发，得到的浓缩溶液在剧烈搅拌的条件下，加入大量无水乙醚至出现白色沉淀，抽滤，白色滤饼通风除去残留的无水乙醚，得到纯化后的产物1即为mPEG-OTs。
（2）聚乙二醇单甲醚-邻苯二甲酰亚胺(mPEG-PI)的制备
精密称取0.5mmol mPEG-OTs，置于装有温度计、回流冷凝管和机械搅拌器的干燥三口瓶中，加入适量N，N-二甲基甲酰胺DMF，待mPEG-OTs完全溶解之后，通氮气，缓慢升温到120℃以后，加入1.5mmol邻苯二甲酰亚胺钾PPI，在120℃通氮气保护，搅拌回流反应4h。反应结束后，反应混合物冷却至室温，过滤除去未反应的过量PPI，滤液减压蒸馏除去溶剂DMF，得到的残留物溶于适量二氯甲烷，旋转蒸发，得到的浓缩溶液在剧烈搅拌的条件下，加入大量无水乙醚至出现白色沉淀，抽滤，白色滤饼通风除去残留的无水乙醚，得到纯化后的产物2即为mPEG-PI。
（3）单端氨基聚乙二醇单甲醚 (mPEG-NH2)的制备
精密称取0.5mmol mPEG-PI，置于装有温度计、回流冷凝管和机械搅拌器的干燥三口瓶中，加入适量无水乙醇溶液中，待mPEG-PI完全溶解之后，通氮气，缓慢升温到90℃回流开始以后，缓慢滴加适量水合肼至反应液中，在90℃通氮气保护，搅拌回流反应4h。反应结束后，反应混合物冷却至室温，旋转蒸发，除去无水乙醇，残留物溶于适量二氯甲烷，转移至分液漏斗，加入蒸馏水除去水合肼，少量多次用二氯甲烷洗涤水相，合并有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，静置过夜，抽滤，将滤液旋转蒸发，得到的浓缩溶液在剧烈搅拌的条件下，加入大量无水乙醚至出现白色沉淀，抽滤，白色滤饼通风除去残留的无水乙醚，得到纯化后的产物3即为mPEG-NH2。
（4）聚乙二醇单甲醚-甘草次酸（mPEG-18β-GA）的制备
将1.5 mmol单端氨基单甲氧基聚乙二醇 mPEG-NH2，0.5 mmol 18β-GA溶于适量精制的二氯甲烷中，加入1.5 mmol DCC和1.5 mmol NHS，室温下搅拌反应36 h，反应结束后，抽滤，滤液经无水乙醚沉淀后真空干燥，干燥后的产物溶于蒸馏水中，用氢氧化钠调节pH至8.0～9.0后，多次抽提。经过无水乙醚沉淀后再经过活性炭介质分离。用pH为4.0的醋酸缓冲液作为洗脱液，收集吸收波长在248 nm的聚乙二醇组分并用二氯甲烷抽提，无水乙醚沉淀得到mPEG-18β-GA轭合物。
实施例2：
（1）聚乙二醇单甲醚-对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制备
精密称取3.0mmol聚乙二醇单甲醚mPEG ，置于装有回流冷凝管和机械搅拌器的干燥三口瓶中，加入适量二氯甲烷，待mPEG完全溶解之后，通氮气，少量多次共加入9.0mmol对甲苯磺酰氯TsCl，再加入适量三乙胺TEA，在室温下通氮气保护，搅拌回流反应6h。反应结束后，反应混合物过滤除去不溶性固体，滤液转移至分液漏斗中，用稀盐酸萃取洗涤3次，得到的有机相用饱和碳酸钠溶液中和至pH为7，之后再用蒸馏水洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，静置过夜，抽滤，将滤液于50℃旋转蒸发，得到的浓缩溶液在剧烈搅拌的条件下，加入大量无水乙醚至出现白色沉淀，抽滤，白色滤饼通风除去残留的无水乙醚，得到纯化后的产物1即为mPEG-OTs。
（2）聚乙二醇单甲醚-邻苯二甲酰亚胺(mPEG-PI)的制备
精密称取1.5mmol mPEG-OTs，置于装有温度计、回流冷凝管和机械搅拌器的干燥三口瓶中，加入适量N，N-二甲基甲酰胺DMF，待mPEG-OTs完全溶解之后，通氮气，缓慢升温到120℃以后，加入4.5mmol邻苯二甲酰亚胺钾PPI，在120℃通氮气保护，搅拌回流反应6 h。反应结束后，反应混合物冷却至室温，过滤除去未反应的过量PPI，滤液减压蒸馏除去溶剂DMF，得到的残留物溶于适量二氯甲烷，旋转蒸发，得到的浓缩溶液在剧烈搅拌的条件下，加入大量无水乙醚至出现白色沉淀，抽滤，白色滤饼通风除去残留的无水乙醚，得到纯化后的产物2即为mPEG-PI。
（3）单端氨基聚乙二醇单甲醚 (mPEG-NH2)的制备
精密称取1.0mmol mPEG-PI，置于装有温度计、回流冷凝管和机械搅拌器的干燥三口瓶中，加入适量无水乙醇溶液中，待mPEG-PI完全溶解之后，通氮气，缓慢升温到90℃回流开始以后，缓慢滴加适量水合肼至反应液中，在90℃通氮气保护，搅拌回流反应6h。反应结束后，反应混合物冷却至室温，旋转蒸发，除去无水乙醇，残留物溶于适量二氯甲烷，转移至分液漏斗，加入蒸馏水除去水合肼，少量多次用二氯甲烷洗涤水相，合并有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，静置过夜，抽滤，将滤液旋转蒸发，得到的浓缩溶液在剧烈搅拌的条件下，加入大量无水乙醚至出现白色沉淀，抽滤，白色滤饼通风除去残留的无水乙醚，得到纯化后的产物3即为mPEG-NH2。
（4）聚乙二醇单甲醚-甘草次酸（mPEG-18β-GA）的制备
将3.0 mmol单端氨基单甲氧基聚乙二醇 (mPEG-NH2)，1.0 mmol 18β-GA溶于适量精制的二氯甲烷中，加入3.0 mmol DCC和3.0 mmol NHS，室温下搅拌反应48 h，反应结束后，抽滤，滤液经无水乙醚沉淀后真空干燥，干燥后的产物溶于蒸馏水中，用氢氧化钾调节pH至8.0～9.0后，多次抽提。经过无水乙醚沉淀后再经过活性炭介质分离。用pH为4.0的醋酸缓冲液作为洗脱液，收集吸收波长在248 nm的聚乙二醇组分并用二氯甲烷抽提，无水乙醚沉淀得到mPEG-18β-GA轭合物。
实施例3：
（1）聚乙二醇单甲醚-对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制备
精密称取4.0mmol聚乙二醇单甲醚mPEG，置于装有回流冷凝管和机械搅拌器的干燥三口瓶中，加入适量二氯甲烷，待mPEG完全溶解之后，通氮气，少量多次共加入12.0mmol对甲苯磺酰氯TsCl，再加入适量三乙胺TEA，在室温下通氮气保护，搅拌回流反应8h。反应结束后，反应混合物过滤除去不溶性固体，滤液转移至分液漏斗中，用稀盐酸萃取洗涤3次，得到的有机相用饱和碳酸钠溶液中和至pH为7，之后再用蒸馏水洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，静置过夜，抽滤，将滤液于50℃旋转蒸发，得到的浓缩溶液在剧烈搅拌的条件下，加入大量无水乙醚至出现白色沉淀，抽滤，白色滤饼通风除去残留的无水乙醚，得到纯化后的产物1即为mPEG-OTs。
（2）聚乙二醇单甲醚-邻苯二甲酰亚胺(mPEG-PI)的制备
精密称取2.5mmol mPEG-OTs，置于装有温度计、回流冷凝管和机械搅拌器的干燥三口瓶中，加入适量N，N-二甲基甲酰胺DMF，待mPEG-OTs完全溶解之后，通氮气，缓慢升温到120 ℃以后，加入7.5mmol邻苯二甲酰亚胺钾PPI，在120℃通氮气保护，搅拌回流反应8 h。反应结束后，反应混合物冷却至室温，过滤除去未反应的过量PPI，滤液减压蒸馏除去溶剂DMF，得到的残留物溶于适量二氯甲烷，旋转蒸发，得到的浓缩溶液在剧烈搅拌的条件下，加入大量无水乙醚至出现白色沉淀，抽滤，白色滤饼通风除去残留的无水乙醚，得到纯化后的产物2即为mPEG-PI。
（3）单端氨基聚乙二醇单甲醚 (mPEG-NH2)的制备
精密称取1.5mmol mPEG-PI，置于装有温度计、回流冷凝管和机械搅拌器的干燥三口瓶中，加入适量无水乙醇溶液中，待mPEG-PI完全溶解之后，通氮气，缓慢升温到90℃回流开始以后，缓慢滴加适量水合肼至反应液中，在90℃通氮气保护，搅拌回流反应8h。反应结束后，反应混合物冷却至室温，旋转蒸发，除去无水乙醇，残留物溶于适量二氯甲烷，转移至分液漏斗，加入蒸馏水除去水合肼，少量多次用二氯甲烷洗涤水相，合并有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，静置过夜，抽滤，将滤液旋转蒸发，得到的浓缩溶液在剧烈搅拌的条件下，加入大量无水乙醚至出现白色沉淀，抽滤，白色滤饼通风除去残留的无水乙醚，得到纯化后的产物3即为mPEG-NH2。
（4）聚乙二醇单甲醚-甘草次酸（mPEG-18β-GA）的制备
将4.5 mmol单端氨基单甲氧基聚乙二醇 (mPEG-NH2)，1.5 mmol 18β-GA溶于适量精制的二氯甲烷中，加入4.5 mmol DCC和4.5 mmol NHS，室温下搅拌反应60 h，反应结束后，抽滤，滤液经无水乙醚沉淀后真空干燥，干燥后的产物溶于蒸馏水中，用氢氧化钠调节pH至8.0～9.0后，多次抽提。经过无水乙醚沉淀后再经过活性炭介质分离。用pH为4.0的醋酸缓冲液作为洗脱液，收集吸收波长在248 nm的聚乙二醇组分并用二氯甲烷抽提，无水乙醚沉淀得到mPEG-18β-GA轭合物。
实施例4：
（1）聚乙二醇单甲醚-对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制备
精密称取6.0mmol聚乙二醇单甲醚mPEG，置于装有回流冷凝管和机械搅拌器的干燥三口瓶中，加入适量二氯甲烷，待mPEG完全溶解之后，通氮气，少量多次共加入18.0mmol对甲苯磺酰氯TsCl，再加入适量三乙胺TEA，在室温下通氮气保护，搅拌回流反应8h。反应结束后，反应混合物过滤除去不溶性固体，滤液转移至分液漏斗中，用稀盐酸萃取洗涤3次，得到的有机相用饱和碳酸钠溶液中和至pH为7，之后再用蒸馏水洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，静置过夜，抽滤，将滤液于50℃旋转蒸发，得到的浓缩溶液在剧烈搅拌的条件下，加入大量无水乙醚至出现白色沉淀，抽滤，白色滤饼通风除去残留的无水乙醚，得到纯化后的产物1即为mPEG-OTs。
（2）聚乙二醇单甲醚-邻苯二甲酰亚胺(mPEG-PI)的制备
精密称取3.0mmol mPEG-OTs，置于装有温度计、回流冷凝管和机械搅拌器的干燥三口瓶中，加入适量N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，待mPEG-OTs完全溶解之后，通氮气，缓慢升温到120℃以后，加入9.0mmol邻苯二甲酰亚胺钾(PPI)，在120℃通氮气保护，搅拌回流反应8h。反应结束后，反应混合物冷却至室温，过滤除去未反应的过量PPI，滤液减压蒸馏除去溶剂DMF，得到的残留物溶于适量二氯甲烷，旋转蒸发，得到的浓缩溶液在剧烈搅拌的条件下，加入大量无水乙醚至出现白色沉淀，抽滤，白色滤饼通风除去残留的无水乙醚，得到纯化后的产物2即为mPEG-PI。
（3）单端氨基聚乙二醇单甲醚 (mPEG-NH2)的制备
精密称取2.0mmol mPEG-PI，置于装有温度计、回流冷凝管和机械搅拌器的干燥三口瓶中，加入适量无水乙醇溶液中，待mPEG-PI完全溶解之后，通氮气，缓慢升温到90℃回流开始以后，缓慢滴加适量水合肼至反应液中，在90℃通氮气保护，搅拌回流反应8h。反应结束后，反应混合物冷却至室温，旋转蒸发，除去无水乙醇，残留物溶于适量二氯甲烷，转移至分液漏斗，加入蒸馏水除去水合肼，少量多次用二氯甲烷洗涤水相，合并有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，静置过夜，抽滤，将滤液旋转蒸发，得到的浓缩溶液在剧烈搅拌的条件下，加入大量无水乙醚至出现白色沉淀，抽滤，白色滤饼通风除去残留的无水乙醚，得到纯化后的产物3即为mPEG-NH2。
（4）聚乙二醇单甲醚-甘草次酸（mPEG-18β-GA）的制备
将6.0 mmol单端氨基单甲氧基聚乙二醇 (mPEG-NH2)，2.0 mmol 18β-GA溶于适量精制的二氯甲烷中，加入DCC6.0 mmol和6.0 mmol NHS，室温下搅拌反应72 h，反应结束后，抽滤，滤液经无水乙醚沉淀后真空干燥，干燥后的产物溶于蒸馏水中，用氢氧化钾调节pH至8.0～9.0后，多次抽提。经过无水乙醚沉淀后再经过活性炭介质分离。用pH为4.0的醋酸缓冲液作为洗脱液，收集吸收波长在248 nm的聚乙二醇组分并用二氯甲烷抽提，无水乙醚沉淀得到mPEG-18β-GA轭合物。
本发明中mPEG主链在各步反应中未发生断裂，各步产物纯化处理均采用二氯甲烷溶解后用无水乙醚沉淀，简单易得。
本发明采用三乙胺为缚酸剂，毒性小，反应回收简单。
二氯甲烷直接作本发明反应中的溶剂，减少了操作步骤，操作简单，并可减少反应成本。
经实验测得：mPEG-OTs收率为84.54%以上，mPEG-PI收率为88.96%以上，mPEG-NH2收率为88.72%以上，mPEG-18β-GA收率为82.43%以上。mPEG-OTs的纯度为95.74%以上，mPEG-PI的纯度为96.88%以上，mPEG-NH2的纯度为99.51%以上，mPEG-18β-GA的纯度为99.65%以上。
通过检识反应、红外光谱与核磁共振氢谱分析共同证实了最终反应产物与目标分子mPEG-18β-GA的结构相吻合。将GA引到mPEG的高分子链上，其水溶性可得到有效改善，延长体内循环时间，高效发挥保肝抗炎作用。因为肝细胞表面具有丰富的GA结合位点，因此还可作为药物载体材料，负载抗肿瘤药物主动靶向于肝脏病变部位，从而为后续实验研究提供科学依据。
本发明采用摇瓶法测定聚乙二醇单甲醚修饰甘草次酸前后作为药物载体的油水分配系数。
具体操作步骤如下:
① 制备不同pH值缓冲溶溶液。
② 制备不同pH下预报和油相和水相。
③ 制备贮备液（GA和mPEG-18β-GA）。
④ 测定不同油水比例不同pH值下GA的表观油水分配系数
⑤ 测定不同油水比例不同pH值下mPEG-18β-GA的表观油水分配系数。
实验结果表明：
pH2.0下，油水比例1:1，聚乙二醇改性甘草次酸在正辛醇-水体系中的油水分配系数lgP为-0.651；
油水比例2:1，聚乙二醇改性甘草次酸在正辛醇-水体系中的油水分配系数lgP为-0.744。
pH7.4下，油水比例1:1，聚乙二醇改性甘草次酸在正辛醇-水体系中的油水分配系数lgP为-0.653；
油水比例2:1，聚乙二醇改性甘草次酸在正辛醇-水体系中的油水分配系数lgP为-0.780。
该实验结果说明经聚乙二醇修饰后的甘草次酸水溶解性显著提高，可作为难溶性药物的给药载体。
以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
（1）聚乙二醇单甲醚-对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制备；
（2）聚乙二醇单甲醚-邻苯二甲酰亚胺(mPEG-PI)的制备；
（3）单端氨基聚乙二醇单甲醚 (mPEG-NH2)的制备；
（4）聚乙二醇单甲醚-甘草次酸（mPEG-18β-GA）的制备。
2.如权利要求1所述的聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法中采用的有机溶剂为：无水乙醚，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。
3.如权利要求1所述的聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇单甲醚-对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制备方法包括以下步骤：
（1）反应步骤；
（2）提纯步骤。
4.如权利要求3所述的聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法，其特征在于：所述反应步骤中:聚乙二醇单甲醚(mPEG)与对甲苯磺酰氯(TsCl)的摩尔比为1～3：3～9。
5.如权利要求1所述的聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇单甲醚-邻苯二甲酰亚胺(mPEG-PI)的制备方法包括以下步骤：
（1）反应步骤；
（2）提纯步骤。
6.如权利要求5所述的聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法，其特征在于：所述反应步骤中：聚乙二醇单甲醚-对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)与邻苯二甲酰亚胺钾(PPI)的摩尔比为1～6：3～18。
7.如权利要求1所述的聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法，其特征在于：所述单端氨基聚乙二醇单甲醚 (mPEG-NH2)的制备方法包括以下步骤：
（1）反应步骤；
（2）提纯步骤。
8.如权利要求1所述的聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇单甲醚-甘草次酸（mPEG-18β-GA）的制备方法包括以下步骤：
（1）反应步骤；
其中单端氨基单甲氧基聚乙二醇 (mPEG-NH2)、18β-GA、DCC和NHS的摩尔比为：3～12：1～4：3～12：3～12；
（2）提纯步骤。
9.如权利要求1所述的聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法，其特征在于：所述mPEG-OTs收率为84.54%以上，mPEG-PI收率为88.96%以上，mPEG-NH2收率为88.72%以上，mPEG-18β-GA收率为82.43%以上。
10.一种聚乙二醇单甲醚-甘草次酸作为肝靶向给药载体的制备方法制备的聚乙二醇单甲醚-甘草次酸，其特征在于：所述mPEG-OTs的纯度为95.74%以上，mPEG-PI的纯度为96.88%以上，mPEG-NH2的纯度为99.51%以上，mPEG-18β-GA的纯度为99.65%以上。
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