CN104711277A - 玉米丝氨酸消旋酶基因作为筛选标记在南抗杨转化体系中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用玉米丝氨酸消旋酶基因作为筛选标记在南抗杨转化体系中的应用。本发明以玉米自交系B73三叶期的cDNA为模板克隆得到的一段基因序列(ZmSR)，将该基因替换双元表达载体pCAMBIA1301上的GUS标记基因，将该载体命名为pBI1301-ZmSR。以南抗杨组培苗的叶片为对象，通过农杆菌介导的遗传转化，将pBI1301-ZmSR载体导入到南抗杨中，并以南抗杨的叶片和不定芽分别进行D-丝氨酸的抗性筛选，从而获得转基因南抗杨植株。与传统筛选标记相比，丝氨酸消旋酶为一种无抗性选择标记基因，对转化植物中的D-丝氨酸具有解毒作用，对生态环境不会造成污染，是一种安全的筛选标记基因。

Description

玉米丝氨酸消旋酶基因作为筛选标记在南抗杨转化体系中的应用

技术领域

本发明涉及组织培养技术和植物基因工程领域，提供了一种玉米丝氨酸消旋酶基因作为筛选标记在南抗杨遗传转化中的应用。

背景技术

杨树，是全世界上栽培面积最大、木材产量最高，同时也是对碳固定贡献最大的树种。杨树作为林业研究中的模式植物，具有优良的实验特性，容易进行种间杂交和无性繁殖；已建立完善遗传转化系统并且生长迅速；除此之外，杨属植物具有丰富的遗传多样性。采用常规育种方法改良林木，不仅抗性周期长、工序复杂、费时费工，而且容易受到气候、地域和水分等的影响，基因工程的发展为杨树新品种的培育开辟了一条经济且有效的途径。

植物的遗传转化研究主要是通过将具有优良性状的外源目的基因导入到植物基因组中，用标记基因筛选出真正含有目的基因片段的转化体，并使其完整再生，通过这种方式获得遗传性状改良的转化植株。其中标记基因可以在遗传转化中筛选和鉴定出转化的植物细胞、植物组织和转基因植株，起到区分转化和非转化细胞的关键作用。根据筛选方法的不同可分为选择基因(SeIective gene)和报告基因(reporter gene)。选择基因通常是指抗生素和除草剂抗性基因，而报告基因有葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、荧光素酶基因(LUC)和绿色荧光蛋白基因(GFP)等。出于对生态环境以及转基因食品的生物安全性等方面的考虑，标记基因又可分为传统的选择标记基因(traditional selective marker gene)和生物安全性标记基因(biosafetymarker gene)。随着科研方面开展更多的在田间的转基因植物实验，以及在消费市场中逐步投放的转基因产品，使得社会越来越关注转基因生物安全性问题，相关科学工作者对这个问题也引起了高度的重视，因此对于开展生物安全性标记基因的研究有其必然性以及极其重要的意义。

玉米丝氨酸消旋酶(serine racemase，SR)是一类依赖PLP型酶，同时具有消旋酶和脱水酶的两种活性。SR的酶活反应需要金属离子，哺乳动物SR还需要ATP的参与，植物SR则不需要ATP的参与。不仅能将L-/D-丝氨酸转化成相应的D-/L-丝氨酸；而且可以将L-/D-丝氨酸转化成丙酮酸。之前的一些学者一直认为动植物体内的氨基酸不存在D-型氨基酸，都是以L-型氨基酸存在的。自从在细菌的细胞壁中发现了D-丙氨酸和D-谷氨酸后，人们开始研究微生物中的氨基酸消旋酶。之后从水稻、大麦、拟南芥等物种中分离纯化出丝氨酸消旋酶，并进一步的研究了该酶的性质。丝氨酸消旋酶作为一种无抗性选择标记基因，对于植物中的D-丝氨酸具有解毒的功能，并且对于生态环境不会造成污染，是一种安全的筛选标记基因。因此研究该标记基因能否能在木本植物中高效表达，具有重要的科学意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米丝氨酸消旋酶基因及其表达载体，以及该基因作为筛选标记在南抗杨遗传转化中的应用。本发明所提供的玉米丝氨酸消旋酶基因为ZmSR，其来源于玉米属玉米(Zea mays L.)，该基因片段大小为1014bp。

本发明所涉及的设计方案为一种玉米丝氨酸消旋酶基因，具有序列表中SED ID NO:1项下的序列。ZmSR通过B73自交系三叶期cDNA为模板克隆获得，经过测序其为1014bp，与NCBI网站公布的玉米丝氨酸消旋酶基因(NM_001143028.1)序列一致。

本发明还提供了一种玉米丝氨酸消旋酶基因表达的载体，其特征在于能作为筛选标记在南抗杨遗传转化中的应用。利用前述的玉米丝氨酸消旋酶基因将替换双元表达载体pCAMBIA1301上的GUS标记基因，将该载体命名为pBI1301-ZmSR。以南抗杨组培苗的叶片为对象，通过农杆菌介导的遗传转化，将pBI1301-ZmSR载体导入到南抗杨。先对南抗杨的叶片和不定芽分别进行D-丝氨酸的敏感性试验，确定各自的筛选的临界浓度分别为15mM和12.5mM。再以南抗杨组培苗的叶片为材料，通过农杆菌介导法将pBI1301-ZmSR导入到叶片以及愈伤组织进行遗传转化，并以含有GUS基因的pBI121转化南抗杨的叶片以及愈伤组织作为对照，对比试验发现转GUS基因的南抗杨叶片以及愈伤组织比转pBI1301-ZmSR分化率高，但转pBI1301-ZmSR的污染率较转含有GUS基因的pBI121的污染率低从而获得转基因南抗杨植株。筛选转化植株，最后共获得12株D-丝氨酸抗性苗，经分子检测共有3株植。对转基因植株的表型性状进行观察，非转基因植株作为对照，结果表明转pBI1301-ZmSR的叶片生长状况优于非转基因和转含有GUS基因的pBI121的南抗杨，且转pBI1301-ZmSR的南抗杨株高明显高于转含有GUS基因的pBI121的南抗杨。

在另一个实施方案中，本发明提供了所述基因作为筛选标记在南抗杨遗传转化中的应用。

在其他实施方案中，本发明提供了包含所述玉米丝氨酸消旋酶基因的植物表达载体。在一个实施方案中，所述载体是用所述玉米丝氨酸消旋酶基因取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的GUS基因，从而构建得到的植物表达载体。在另一实施方案中，所述植物表达载体能作为一种筛选标记基因在南抗杨遗传转化应用。

有益效果：本发明提供了一个玉米丝氨酸消旋酶能作为一种筛选标记基因在南抗杨遗传转化应用。该基因第一次作为筛选标记应用于南抗杨的遗传转化体系中，是一种无抗性选择标记基因，较抗生素作为筛选标记不仅可以筛选出阳性抗性植株，而且可以对植株体内的D-丝氨酸具有解毒功能，具有低污染率，对植株生长发育以及对环境安全、无危害。因此，研究该标记基因对植物转基因，尤其是在对大规模转基因南抗杨苗的筛选具有重要的科学意义和应用前景。

附图说明

图1pBI1301-ZmSR载体双酶切结果

M，DL-2000Marker 1，Nco I和Bstp I双酶切条

图2D-丝氨酸临界浓度筛选试验

A，叶片分化抗性筛选结果；B，生根抗性筛选结果。

图3转基因株检测图

M，DL2000； 1，ddH₂O； 2，为未转化植株叶片基因组(阴性对照)； 3，重组质粒(阳性对照)； 4-6，D-丝氨酸抗性植株叶片基因组；

图4转基因植株的对比结果图

CK，未转化植株；GUS，转含GUS基因pBI121载体载体植株；SR，转pBI1301-ZmSR载体植株

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

具体实施方式

所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，上海生工公司测序；Taq酶、Trans5α感受态及相关的试剂盒购置北京全式金公司；限制性内切酶Nco I和Bstp I，T₄连接酶购自TaKaRa公司；相应的抗生素来自上海生工和SIGMA公司；其余试剂均为国产分析纯。本研究所用的表达载体pBI121以及根癌农杆菌LBA4404由本实验室保存，双元表达载体pCAMBIA1301由生命科学学院作物生物重点实验室惠赠。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1.载体构建与转化

以玉米B73自交系三叶期cDNA为模板克隆获得，根据NCBI网站公布序列(NM_001143028.1)设计引物，上游加NcoI(CCATGG)酶切位点，下游加Bstp I(GGTAACC)酶切位点，引物如下：

引物1(上游引物)：5’-CATGCCATGGATGGGAAGTAAAGACGGCACCGG-3’

引物2(下游引物)：5’-GGGTAACCTCAGTGTTTGTACATAGACTG-3’

PCR得到约1000bp条带，回收后，将回收产物用Nco I和BstP I双酶切获得酶切之后的序列A。将pCAMBIA1301载体用Nco I和BstP I双酶切，回收线性化的质粒。用T₄连接酶连接得酶切之后的序列A和线性化的质粒获得重组载体，重组载体命名为pBI1301-ZmSR，重组载体转入Trans5α感受态中获得转化菌株，将菌液送生工测序，得到结果与报道的序列一致，转入的基因为玉米丝氨酸消旋酶基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。酶切体系如下：

将验证正确的pBI1301-ZmSR和含有GUS基因的pBI121载体载体转化到农杆菌LBA4404中，用无菌牙签挑取YEP平板上的单菌落，接种于适量的液体YEP培养基含Kan100μg/mL、利福平(Rifampicin，Rif)100μg/mL中，振荡培养过夜培养。对LBA4404的质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图1所示，获得含pBI1301-ZmSR载体的农杆菌LBA4404并低温保存。

实施例2.南抗杨叶片和不定芽生根对D-丝氨酸浓度的确定

(1)南抗杨叶片的D-丝氨酸的敏感性试验：

将南抗杨的组培苗叶片剪成0.5cm×0.5cm的大小后，接种到普通MS分化培养基上，预培养3d后，转入到含有不同D-丝氨酸浓度(0mM、10mM、12.5mM、15mM、20mM)的分化培养基上，每10d换一次培养基，30d后统计观察结果，3次重复试验，结果如图2A所示，叶片对于D-丝氨酸非常敏感，随着浓度的增明显可以看出，叶片的分化能力越差，甚至出现死亡；且随着浓度的升高原本绿色叶片的颜色逐渐变黄、出现褐化甚至白化的现象。当外植体在含0mM D-丝氨酸的培养基生长时，南抗杨的叶片呈现绿色，且叶片的边缘可见分化芽；当外植体在含10mM D-丝氨酸的培养基生长时，南抗杨叶片的边缘部分枯萎，且叶片开始变黄；在含12.5mM D-丝氨酸的培养基上生长的外植体，叶片边缘出现白化现象，且大部分叶片变黄；而当D-丝氨酸的浓度达到15mM时，外植体分化率为0，大部分叶片出现褐化，小部分叶片出现枯黄；当外植体在含20mM D-丝氨酸的培养基生长时，南抗杨叶片全部褐化且叶片中间出现白化现象。因此，本试验选择15mM作为合适的转化植株筛选浓度。

(2)南抗杨不定芽生根的D-丝氨酸的敏感性试验：

在南抗杨的生根培养基中，加入D-丝氨酸的浓度分别为(0mM、10mM、12.5mM、15mM)，30d后记录观察结果，3次重复试验，结果如图2B所示。当D-丝氨酸的浓度为0时，10d左右茎段底部膨大，12d左右就能产生不定根；当把茎段接种到不同浓度的D-丝氨酸生根培养基上时，生根时间延迟且生根率明显下降且植株的叶片的生长状态也变差。当D-丝氨酸浓度为0mM时，组培苗全部生根；当浓度为5mM时，大部分的组培苗生根，但小部分的组培苗受到D-丝氨酸的影响，出现抑制现象；当浓度为10mM时，只有46.7％的组培苗生根，且不定根的数目也较少，说明D-丝氨酸对植株的生根产生了不利的影响，不利于产生不定根；当浓度达到12.5mM时，植株生根率较低；当浓度达到15mM时，不生根，植株也逐渐变黄直至死亡。所以选取12.5mM这一浓度作为筛选生根的选择压。

实施例3.目的基因转化南抗杨

(1)受体材料的预培养

将待培养的南抗杨叶片剪成0.5cm×0.5cm的块状，接种在叶片不定芽诱导培养基上进行预培养7d，待叶片切口处刚刚开始膨大时即可进行培养。

(2)正负对照的设置

每次进行转化时，都要设置正负对照。用来检测该次试验结果是否可靠。正对照指外植体不经农杆菌侵染，也无抗生素的选择压力，直接放置在分化培养基上。而负对照则是指外植体不经农杆菌侵染，但置于和转化的外植体一样的筛选培养基上。正常情况下，正对照应该表现为分化情况良好，负对照应该表现为没有分化。正负对照的设立，能够初步核查试验过程中可能出现的差错，提高转化效率。

(3)工程菌制备

从-70℃冰箱取出含pBI1301-ZmSR载体的农杆菌LBA4404，蘸取少量菌体，接种于含Kan 50mg/L，Rif 50mg/L的YEP平板上，于28℃遮光培养24h后，从活化平板上挑取单菌落接种于有抗生素的YEP液体培养基中，28℃，220rpm培养约24h，视菌液浓度用不含抗生素的YEP液体培养基按1:50或1:100的比例进行稀释，28℃220rpm振荡培养4h，至相应OD₆₀₀值时，4℃，5000rpm离心5min收集菌体，用相同体积的MS液体培养基(含AS，浓度为200μmol/L)悬浮备用。

(4)侵染与共培养

将菌液倒入三角瓶中，将经过7d预培养的叶片浸入菌液中，180rpm，侵染20min以后，再把叶片接种到含AS的共培养培养基上，22℃左右遮光进行共培养3d。

(5)菌的清洗

待培养基中出现可见菌落就可以进行清洗农杆菌，先用无菌水洗叶片6次。再用400mg/L头孢霉素(Cephalosporin，Cef)浸泡叶片，放入恒温摇床中振荡半个小时，用装有滤纸的培养皿吸干，最后接种到含D-丝氨酸和Cef、Kan 400mg/L的恢复培养基，25℃左右遮光进行恢复培养7d。

(6)抗性愈伤组织的筛选与分化

将恢复培养7d后的材料用含D-丝氨酸(15mM)、Cef(400mg/L)和Kan(50mg/L)分化培养基上，25℃左右光照条件下培养，每20d转入新配制的分化培养基。分别进行3次筛选培养，最终获得抗性苗。

(7)生根选择培养

待不定芽苗长到1cm以上，转入含有插入生根培养基1/2MS+IBA 2mg/L+Kan 50mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L和1/2MS+IBA 2mg/L+D-丝氨酸12.5mM+蔗糖20g/L+琼脂6g/L上进行筛选培养上进行生根培养。

(8)炼苗和移栽

在室内炼苗7d后，取出苗。洗净根部后栽入营养钵中，浇蒸馏水浸湿，然后转移至光照培养箱中，炼苗2周左右，待新的根系形成，浇一次复合肥水，5d后将成活的幼苗移入大棚(冬季)，获得转基因杨树。如夏季炼苗，成活后可直接栽入大田，获得转基因杨树。

实施例4.含有GUS基因的pBI121载体和pBI1301-ZmSR转化南抗杨的对比试验

(1)转化南抗杨叶片的对比试验

将南抗杨无菌苗的叶片在分化培养基上预培养3d后，叶片底部稍有膨大。然后进行侵染和共培养，共培养时需要22℃暗培养4d，此时转含有GUS基因的pBI121载体的南抗杨叶片和转pBI1301-ZmSR的南抗杨叶片相对比无明显差异，叶片底部继续膨大，叶片仍呈绿色。洗菌之后放入恢复培养基中培养7d，南抗杨叶片底部继续膨大，一些叶片与培养基接触的部分颜色略微变黄。再转入到筛选培养基培养约20d后，转GUS基因和转ZmSR基因的叶片与筛选培养基接触的部分变为黄色，且部分转GUS基因叶片的边缘出现密集的小芽点。进行第二轮的筛选培养之后，转含有GUS基因的pBI121载体和转pBI1301-ZmSR的部分叶片长势开始减缓，部分叶片出现白化现象，且叶片上的黄褐色面积变大。转含有GUS基因的pBI121载体和转pBI1301-ZmSR的南抗杨叶片均出现了白色小芽点，据实验统计转GUS基因南抗杨叶片上的小芽点多于转ZmSR基因的小芽点。进行完第三轮筛选之后，部分长势较好的叶片边缘长出绿色的小芽点，转两种基因的叶片上部分小芽点逐渐变大，形成小芽。此时转含有GUS基因的pBI121载体的南抗杨形成的小芽数明显多于转pBI1301-ZmSR的南抗杨。在筛选培养基中继代3次后，转到增殖培养基中培养，每20d转接一次，直到抗性芽长成比较健壮的芽苗为止，再将芽苗转接到含有D-丝氨酸和Cef的生根培养基中。

本实验共进行8轮含有GUS基因的pBI121载体和pBI1301-ZmSR的转化，3次重复试验。同时对于转化率也进行了统计，以在筛选培养基上培养60d后产生分化外植体数作为转化效率评价指标。分化率＝分化出芽的外植体总数/接种时总的外植体数×100％；污染率＝转化过程中被污染的外植体个数/接种时总的外植体数×100％。转化率统计结果表明，D-丝氨酸对转pBI1301-ZmSR的南抗杨叶片的分化率影响较大，南抗杨叶片对于D-丝氨酸非常敏感，而转含有GUS基因的pBI121载体的南抗杨叶片对卡那霉素具有很高耐受性，叶片分化率较高。而转含有GUS基因的pBI121载体的南抗杨叶片的污染率较转pBI1301-ZmSR的污染率更为严重，表明导入到南抗杨中pBI1301-ZmSR对于农杆菌侵染的毒害作用抗性更强。

(2)转化南抗杨愈伤组织的对比试验

预培养前期叶片边缘出现卷曲、膨胀，部分叶片表面略微拱起，培养一段时间之后观察到叶片切口的侧脉以及脉梢处产生白色以及淡绿色的愈伤组织。侵染后进行4d共培养，此时，转含有GUS基因的pBI121载体和转pBI1301-ZmSR的南抗杨愈伤组织无明显的变化。7d恢复培养后愈伤组织略微变大，叶片切口边缘密生绿色愈伤组织。之后转入筛选培养基中培养20d，重复筛选3次，筛选过程中愈伤组织迅速增殖膨大呈瘤状，其中部分出现褐化。转含有GUS基因的pBI121载体的愈伤比转pBI1301-ZmSR的愈伤组织块生长速度略快，也较早出现褐化现象。60d后转两种基因的外植体都分化出小芽。但转含有GUS基因的pBI121载体的愈伤出现白化以及玻璃化的现象。3次重复试验。

转化率统计结果表明，转含有GUS基因的pBI121载体的愈伤组织分化出的芽苗要比转pBI1301-ZmSR分化出的芽苗要多。导致这个结果的原因可能是筛选试剂D-丝氨酸的筛选效率较高，未转化的愈伤组织无法充分吸收营养，逐渐褐化，抗性芽也随之死亡。而转含有GUS基因的pBI121载体的外植体污染率要高于转pBI1301-ZmSR，有可能转含有GUS基因的pBI121载体的愈伤组织对于农杆菌的毒害作用抵抗力较低。对比两种基因的转南抗杨叶片以及转南抗杨愈伤组织的实验，结果发现转南抗杨愈伤组织虽然生长速率略快于转南抗杨叶片，但其分化率却远不如转南抗杨叶片。究其原因主要是转南抗杨愈伤组织的污染率较高所导致的，由于愈伤组织在分裂状态时对农杆菌的毒害作用也表现的更为敏感。

实施例5.转化植株的检测和表型性状的观察

(1)转化植株的PCR鉴定

常规方法提取实施例3获得的转基因杨树的基因组，以提取的转基因杨树的基因组DNA为模板，用引物进行PCR扩增，扩增的片段大小为340bp，PCR反应总体系为25μL，DNA模板1μL，10×buffer 2.5μL，10mM dNTP 2μL，10μM引物各1μL，Taq酶0.25μL，加灭菌ddH₂O至25μL；PCR反应条件为：预变性：94℃10min；变性：94℃30s；退火：55℃30s；延伸：72℃1min，34个循环；总延伸：72℃10min。

上游引物：5’-GGTTTAATTTCTGGTGTGGCCCT-3’

下游引物：5’-TCCCTATCTTGCTGCTCTCGTGC-3’

PCR反应中，以非转基因植株为阴性对照，重组质粒为阳性对照，结果如图3所示，初步证明ZmSR基因整合到南抗杨中。

(2)表型性状的观察

对长大成苗的转含有GUS基因的pBI121载体以及转ZmSR基因的南抗杨植株进行炼苗移栽，非转基因植株作为对照，20d后观察长势，发现转pBI1301-ZmSR的叶片生长状况优于非转基因和转含有GUS基因的pBI121载体的南抗杨的叶片，且转ZmSR基因的南抗杨株高明显高于转GUS基因的南抗杨(图4)。

Claims (9)

1.一种用于南抗杨遗传转化筛选标记的基因，其特征为所述基因为玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR。

2.一种获得如权利要求1所述玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的方法，其特征为步骤如下：

以玉米B73自交系三叶期cDNA为模板克隆获得，根据NCBI网站公布序列(NM_001143028.1)设计引物，上游加NcoI(CCATGG)酶切位点，下游加Bstp I(GGTAACC)酶切位点，引物如下：

引物1(上游引物)：5’-CATGCCATGGATGGGAAGTAAAGACGGCACCGG-3’

引物2(下游引物)：5’-GGGTAACCTCAGTGTTTGTACATAGACTG-3’

PCR得到约1000bp条带，回收后，将回收产物用Nco I和BstPⅠ双酶切获得酶切之后的序列。

3.权利要求1所述的玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR作为南抗杨遗传转化的筛选标记基因的应用。

4.一种制备含玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的植物表达载体的方法，其特征为步骤如下：

(1)以玉米B73自交系三叶期cDNA为模板克隆获得，根据NCBI网站公布序列(NM_001143028.1)设计引物，上游加NcoI(CCATGG)酶切位点，下游加Bstp I(GGTAACC)酶切位点，引物如下：

引物1(上游引物)：5’-CATGCCATGGATGGGAAGTAAAGACGGCACCGG-3’

引物2(下游引物)：5’-GGGTAACCTCAGTGTTTGTACATAGACTG-3’

(2)PCR得到约1000bp条带，回收后得回收产物A，将回收产物用Nco I和BstPI双酶切获得酶切之后的序列A；将pCAMBIA1301载体用Nco I和BstP I双酶切，回收线性化的pCAMBIA1301载体；用T₄连接酶连接得酶切之后的序列A和线性化的pCAMBIA1301载体获得重组载体，重组载体命名为pBI1301-ZmSR，即包含如权利要求1所述的玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的植物表达载体pBI1301-ZmSR，pBI1301-ZmSR载体转入Trans5α感受态中获得转化菌株，将菌液送生工测序，得到结果与报道的序列一致，转入的基因为玉米丝氨酸消旋酶基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

酶切体系如下：

5.一种含植物表达载体pBI1301-ZmSR的农杆菌的制备方法，其特征为步骤如下：将验证正确的pBI1301-ZmSR载体通过液氮冻融法转化到农杆菌LBA4404中，用无菌牙签挑取YEP平板上的单菌落，接种于适量的含Kan(100μg/mL)、Rif(100μg/mL)的液体YEP培养基中，振荡培养过夜培养；对农杆菌LBA4404的质粒进行酶切鉴定确认，获得含pBI1301-ZmSR载体的农杆菌LBA4404。

6.权利要求4所述的植物表达载体pBI1301-ZmSR作为表达南抗杨遗传转化的筛选标记基因的应用。

7.根据权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于能以根癌农杆菌LBA4404作为宿主，导入到南抗杨叶片和愈伤组织中。

8.一种向南抗杨组织转入如权利要求1所述玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的方法，其特征为步骤如下：

(1)以玉米自交系B73三叶期的cDNA为模板克隆得到的基因序列，引入Nco I和Bstp I为上下游酶切位点，替换双元表达载体pCAMBIA1301上的GUS标记基因获得载体pBI1301-ZmSR，将载体pBI1301-ZmSR导入到根癌农杆菌LBA4404中；

(2)分别对南抗杨叶片分化和不定芽生根进行D-丝氨酸的敏感性试验，确定叶片分化和生根时的临界浓度；

(3)以南抗杨组培苗的叶片为材料，通过农杆菌介导法将载体pBI1301-ZmSR导入到叶片以及愈伤组织进行遗传转化，并以含有GUS基因的pBI121转化南抗杨的叶片以及愈伤组织作为对照；

(4)通过PCR分子检测转化株的阳性率。

9.一种向南抗杨组织转入如权利要求1所述玉米丝氨酸消旋酶基因ZmSR的方法，其特征为步骤如下：

(1)受体材料的预培养

将待培养的南抗杨叶片剪成0.5cm×0.5cm的块状，接种在叶片不定芽诱导培养基上进行预培养7d，待叶片切口处刚刚开始膨大时即可进行培养；

(2)工程菌制备

从-70℃冰箱取出含pBI1301-ZmSR载体的农杆菌LBA4404，蘸取少量菌体，接种于含Kan 50mg/L，Rif 50mg/L的YEP平板上，于28℃遮光培养24h后，从活化平板上挑取单菌落接种于有抗生素的YEP液体培养基中，28℃，220rpm培养约24h，视菌液浓度用不含抗生素的YEP液体培养基按1:50或1:100的比例进行稀释，28℃220rpm振荡培养4h，至相应OD₆₀₀值时，4℃，5000rpm离心5min收集菌体，用相同体积的含200μmol/L AS的MS液体培养基悬浮备用；

(3)侵染与共培养

将菌液倒入三角瓶中，将经过7d预培养的叶片浸入菌液中，180rpm，侵染20min以后，再把叶片接种到含AS的共培养培养基上，22℃左右遮光进行共培养3d；

(4)菌的清洗

待培养基中出现可见菌落就可以进行清洗农杆菌，先用无菌水洗叶片6次；再用400mg/L头孢霉素浸泡叶片，放入恒温摇床中振荡半个小时，用装有滤纸的培养皿吸干，最后接种到含D-丝氨酸和Cef、Kan 400mg/L的恢复培养基，25℃左右遮光进行恢复培养7d

(5)抗性愈伤组织的筛选与分化

将恢复培养7d后的材料用含15mM D-丝氨酸、400mg/L Cef和50mg/LKan分化培养基上，25℃左右光照条件下培养，每20d转入新配制的分化培养基；分别进行3次筛选培养，最终获得抗性苗；

(6)生根选择培养

待不定芽苗长到1cm以上，转入含有插入生根培养基1/2MS+IBA 2mg/L+Kan 50mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L和1/2MS+IBA 2mg/L+D-丝氨酸12.5mM+蔗糖20g/L+琼脂6g/L上进行筛选培养上进行生根培养；

(7)炼苗和移栽

在室内炼苗7d后，取出苗；洗净根部后栽入营养钵中，浇蒸馏水浸湿，然后转移至光照培养箱中，炼苗2周左右，待新的根系形成，浇一次复合肥水，5d后将成活的幼苗移入大棚(冬季)，获得转基因杨树；如夏季炼苗，成活后可直接栽入大田，获得转基因杨树。