CN104688843B - 一种瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位的用途,该瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位是从维药瘤果黑种草籽中采用常规方法萃取后得到的,通过体内外试验表明了该瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位具有改善胰岛素抵抗的能力,它显著降低了由高脂饲料和链脲菌素(STZ)诱发的糖尿病模型大鼠的血糖,并增加了肌肉肝脏组织中糖原含量,激活了己糖激酶(HK)和与抗氧化相关的酶,显示出其具有改善胰岛素抵抗的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种维吾尔医常用药材--瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位在制备改善胰岛素抵抗的药物和保健品的用途。通过体外和动物实验证实的它具有改善胰岛素抵抗的功效。
背景技术
黑种草属植物属毛茛科植物金莲花亚科,其中有三种药用植物,分别是:瘤果黑种草(Nigella glandulifera Freyn.),又名腺毛黑种草;果黑种草(Nigella sativa)又名家黑种草以及黑种草(Nigella damascena L.)。种子为黑种草属常用药材。果黑种草广泛分布在地中海地区;黑种草主要分布在欧洲地区;瘤果黑种草主产地新疆,是新疆特有的植物资源。目前国外的研究主要集中在果黑种草上,果黑种草子具有祛痰、提神发汗、通经和催乳的作用。黑种草子在维吾尔医临床多用于生发、乌发、止痛、止痒等。瘤果黑种草(Nigellaglandulifera Freyn.),也是我国新疆维吾尔常用药材,它干燥成熟种子呈三棱状卵形,长2.5-3mm,宽约1.5mm。表面黑色,粗糙,顶端较狭而尖,下端稍钝,有不规则的突起。质坚硬,断面灰色,有油性。气微香,味辛。具有调理胃火、助消化、固齿、抗肿瘤及提高免疫力的作用。主要用于耳鸣健忘、经闭乳少、胸闷气促、乳腺肿块等疾病的治疗。
目前,对瘤果黑种草籽的研究主要集中在化学成分分析以及醇提取物的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性,瘤黑种草籽油的抗炎、抗血栓、降糖、降脂作用研究。研究表明,不饱和脂肪酸、单萜类是发挥这些生物活性的主要特征性成分。已有研究表明果黑种草籽具有降糖的作用,鉴于果黑种草和瘤果黑种草是同属植物,我们对瘤果黑种草籽进行了降糖方面的研究,我们已经申请瘤果黑种草籽油降糖用途专利并获得授权,现又通过实验证实瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位具有改善胰岛素抵抗的作用。
黑种草属植物属毛茛科植物金莲花亚科,其中有三种药用植物,分别是:瘤果黑种草(Nigella glandulifera Freyn.),又名腺毛黑种草,还有果黑种草(Nigella sativa),又名家黑种草以及黑种草(Nigella damascena L.),它们的种子是常用的药用部分。目前国外的研究主要集中在果黑种草上。瘤果黑种草原产地为地中海沿岸及中亚地区,在我国仅新疆有栽培。
研究证实,2型糖尿病(T2DM)患者的脂肪细胞,骨骼肌和肝脏中蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase1B,PTP1B)活性增强或过度表达,当蛋白酪氨酸磷酸酶被剔除后,不仅胰岛素敏感性增高,而且糖尿病症状也有所改善,PTP1B在胰岛素信号的传导中起负调控作用,PTP1B活性增强或过度表达使激活的胰岛素受体去磷酸化而终止胰岛素信号的传导。因此PTP1B是引起胰岛素抵抗的重要原因,抑制PTP1B是防治糖尿病的有效途径。
胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要特征,是脂肪细胞、肌肉细胞和肝细胞对正常浓度的胰岛素不敏感。在肌肉细胞内,胰岛素抗性降低了葡萄糖的吸收使肌糖元含量降低;而在肝细胞内,降低肝糖原的储备,两者共同导致血糖含量的提高。在脂肪细胞内,胰岛素抗性导致储存的甘油三酸酯的水解,进而提高血浆内自由脂肪酸的含量。
长期处于高糖环境使机体的抗氧化防御系统受损,氧自由基产生和清除的动态平衡遭到破坏而导致氧化应激,氧自由基的生成增多可引起多元醇通路的激活、晚期糖基化终末产物(AGEs)的形成及氨基已糖途径的激活,氧化应激是糖尿病及其并发症、高血压、动脉粥样硬化、肾脏病变等疾病的重要原因。正常情况下,自由基生成与清除之间的动态平衡是靠以总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)为主的酶系统和非酶类抗氧化防御系统来维持。T-SOD是机体内惟一能特异性地清除超氧自由基的抗氧化酶,能将过量的氧自由基歧化为过氧化氢,后者在CAT及GSH-PX的催化下转变为水,从而避免自由基对细胞的损害。丙二醛(MDA)是细胞膜脂质过氧化的终产物,GSH-PX可使脂质过氧化物还原为脂肪酸的醇类,与T-SOD共同组成清除自由基的防御体系。
综上所述,高血糖、氧化应激与糖尿病及其并发症有着密切的关系。因此降血糖的同时调整糖尿病患者体内的氧化应激状态是改善胰岛素抵抗治疗的重要手段。
本发明利用常规方法获得了瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位,并通过体外实验和动物实验证实了具有体外抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B的作用,并在细胞中促进细胞对培养基中葡萄糖的消耗,在动物试验中,它显著降低了由高脂饲料和链脲菌素(STZ)诱发的糖尿病模型大鼠的血糖,并增加了肌肉肝脏组织中糖原含量,激活了己糖激酶(HK)和与抗氧化相关的酶,显示出其具有改善胰岛素抵抗的作用。
在传统维吾尔医学中,瘤果黑种草籽在维吾尔医药中,黑种草具有利尿、补脑、补肾、活血、解毒、下乳、通经、止咳、乌发、抗衰老等功效,是维吾尔医学中一种习惯用药。到目前为止,有关于瘤果黑种草籽挥发油抗炎的报道,瘤果黑种草籽挥发油是瘤果黑种草的干燥成熟种子中提取的化学组分,其油脂部分的降糖功效我们已经申报过专利,并获得授权,但对其乙酸乙酯部位降糖的研究尚未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位的用途,该瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位是从维药瘤果黑种草籽中采用常规方法提取、萃取后得到的,通过体内外试验表明了该瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位具有改善胰岛素抵抗的能力,它显著降低了由高脂饲料和链脲菌素(STZ)诱发的糖尿病模型大鼠的血糖,并增加了肌肉肝脏组织中糖原含量,激活了己糖激酶(HK)和与抗氧化相关的酶,显示出其具有改善胰岛素抵抗的作用。
本发明所述的一种瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位的用途,所述瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位在制备改善胰岛素抵抗的药物中的用途。
一种瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位的用途,所述瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位在制备改善胰岛素抵抗的保健品中的用途。
本发明所述的瘤果黑种草籽采取常规提取法获得的瘤果黑种草籽乙酸乙酯提取物,具体操作按下列步骤进行:
按常规方法用石油醚对瘤果黑种草籽进行脱脂,取干燥的脱脂后瘤果黑种草籽,粉碎后,用浓度为50-95%乙醇按重量体积比瘤果黑种草籽∶乙醇=1:10浸泡或热回流提取(25-80℃),得到醇提物,将醇提物进行减压蒸馏,除去其中的乙醇,得到浓缩液,再将浓缩液用水或0-20%的乙醇分散后,用乙酸乙酯萃取,将萃取液减压蒸至糖浆状,40-45℃干燥,得到瘤果黑种草籽乙酸乙酯提取物。
附图说明
图1为本发明L6肌管细胞葡萄糖消耗图,其中-100纳摩尔/升胰岛素,+100纳摩尔/升胰岛素;
图2为本发明L6肌管细胞葡萄糖消耗与时间关系图,其中50微克/毫升瘤果黑种草籽乙酸乙酯提取物+100纳摩尔/升胰岛素;
图3为本发明L6肌管细胞乳酸产量图,其中-100纳摩尔/升胰岛素,+100纳摩尔/升胰岛素。
具体实施方式
实施例1
按常规方法用石油醚对瘤果黑种草籽进行脱脂,取干燥的脱脂后瘤果黑种草籽,粉碎后,采用浓度为50%乙醇按重量体积比瘤果黑种草籽∶乙醇=1:10常温浸泡3天,得到醇提物,将醇提物进行减压蒸馏除去其中的乙醇,得到浓缩液,再将浓缩液用水分散,再用乙酸乙酯萃取,将萃取液减压蒸至糖浆状,温度40℃干燥,得到瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位。
实施例2
按常规方法用石油醚对瘤果黑种草籽进行脱脂,取干燥的脱脂后瘤果黑种草籽,粉碎后,用浓度为50%乙醇按重量体积比瘤果黑种草籽∶乙醇=1:10,温度80℃热回流提取得到醇提物,将醇提物进行减压蒸馏除去其中的乙醇,得到浓缩液,将浓缩液用浓度为5%的乙醇分散,再用乙酸乙酯萃取,将萃取液减压蒸至糖浆状,温度42℃干燥,得到瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位。
实施例3
按常规方法用石油醚对瘤果黑种草籽进行脱脂,取干燥的脱脂后瘤果黑种草籽,粉碎后,采用浓度为70%乙醇按重量体积比瘤果黑种草籽∶乙醇=1:10,温度60℃热回流提取得到醇提物,将醇提物进行减压蒸馏除去其中的乙醇,得到浓缩液,浓缩液用浓度为10%的乙醇分散,再用乙酸乙酯萃取,将萃取液减压蒸至糖浆状,温度43℃干燥,得到瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位。
实施例4
按常规方法用石油醚对瘤果黑种草籽进行脱脂,取干燥的脱脂后瘤果黑种草籽,粉碎后,采用浓度为75%乙醇按重量体积比瘤果黑种草籽∶乙醇=1:10,温度40℃热回流提取得到醇提物,将醇提物进行减压蒸馏除去其中的乙醇,得到浓缩液,浓缩液用浓度为15%的乙醇分散,再用乙酸乙酯萃取,将萃取液减压蒸至糖浆状,温度45℃干燥,得到瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位。
实施例5
按常规方法用石油醚对瘤果黑种草籽进行脱脂,取干燥的脱脂后瘤果黑种草籽,粉碎后,采用浓度为95%乙醇按重量体积比瘤果黑种草籽∶乙醇=1:10,温度35℃热回流提取得到醇提物,将醇提物进行减压蒸馏除去其中的乙醇,得到浓缩液,浓缩液用浓度为20%的乙醇分散,再用乙酸乙酯萃取,将萃取液减压蒸至糖浆状,温度45℃干燥,得到瘤果黑种草籽乙酸乙酯提取物。
实施例6
将实施例1-5获得的瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位作为改善胰岛素抵抗的用途的生物活性筛选:
筛选方法:利用瘤果黑种草籽乙醇提取后经乙酸乙脂萃取部分对马血清诱导小鼠L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的改善作用;小鼠L6骨骼肌细胞传代后在高糖培养基+10%胎牛血清(FBS)培养基中培养经2%马血清和20nM胰岛素诱导三天后2%马血清诱导三天成肌管细胞,加入不同浓度的乙酸乙酯部位(12.5、25、50、75μg/mL+100nM胰岛素)以及在不同时间收集上清液,测其葡萄糖消耗。研究表明瘤果黑种草乙酸乙酯部位具有协同胰岛素促进肌管细胞对葡萄糖消耗的作用,并呈剂量与时间依赖关系;在50μg/mL,2h时葡萄糖消耗达到最大,且乳酸产量呈下降趋势,因此瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位具有改善胰岛素抵抗的作用(图1-图3)。
实施例7:
将实施例1-5获得的瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位作为蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的药物或保健品的用途的生物活性筛选:
筛选方法:用对-硝基苯基磷酸二钠(pNPP)作为底物,以在阳性药物钒酸钠为对照,利用酶标仪进行PTP1B酶抑制剂的高通量筛选,根据PTP1B水解pNPP的磷酸基团而产生颜色反应来测定PTP1B的活性。酶反应体系组成如下:PBS缓冲液(pH7.4),PTP1B融合蛋白,pNPP,PTP1B特异抑制剂钒酸钠(100μg/mL),反应体系混匀后闭光放置30min,置比色仪上测定405波长条件下的吸收值(A),测定结果减去本底值后计算酶活性;
筛选结果表1:
结论:
从实验结果表明,瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位具有蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂功效。
实施例8:
将实施例1-5获得的瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位作为改善胰岛素抵抗的药物或保健品的用途的生物活性筛选:
筛选方法SD雄性大鼠,(200±20)g,室温18-20℃,湿度50-60%,明暗周期12/12h,自由摄食、饮水。给予标准大鼠饲料(含碳水化合物53%,脂肪5%,蛋白质23%),适应性饲养一周后:空白组给予普通标准饲料,模型组及治疗组给予高糖高脂饲料喂养4周后,禁食8-10小时,于第29天测量空腹血糖、血脂,并静脉注STZ 45mg·kg-1。72h后,取禁食后8-10h大鼠尾静脉血,测空腹血糖,选择血糖值高于11.1mmol·L-1者,视为血糖造模成功,再随机抽取6只大鼠眼部取血,分离血清,测得大鼠血脂四项,血清总胆固醇含量与空白组比较,明显升高者视为高血脂动物模型造模成功,分组:空白对照组10只,动物模型随机分为5组,每组10只;
给药:造模成功后,各组每日8:00-9:00给予相应的药物,连续给药4周,空白对照组(control):基础饲料加相应体积蒸馏水;模型对照组(model):高脂饲料加相应体积蒸馏水;二甲双胍(Metformin)对照组:高脂饲料加二甲双胍片100mg·kg-1体重灌胃;血脂康对照组:NEE低剂量组(low):高脂饲料+50mg·kg-1体重灌胃,NEE中剂量组(middle):高脂饲料加100mg·kg-1体重灌胃;NEE高剂量组(high):高脂饲料200mg·kg-1体重灌胃,结果显示瘤果黑种草籽乙酸乙酯提取物在三个剂量组都具有很好的降糖效果,中剂量组效果最佳(表2),给药4周后处死实验动物,取肝组织分别测定己糖激酶(HK)(己糖激酶是糖酵解中的关键酶,是将葡糖糖降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应中的第一阶段的关键酶)和肝糖原含量,取肌肉组织测定肌糖元含量。研究表明,瘤果黑种草乙酸乙酯提取物处理的糖尿病大鼠,大鼠肝脏中HK活力升高,差异有显著性(P<0.01),肝糖原含量上升,差异有显著性(P<0.05),大鼠肌肉组织中肌糖原含量上升,差异有显著性(P<0.01)(表2):
表2大鼠肝脏中己糖激酶活力、肝糖原和肌糖原含量
取肝脏组织对肝脏中抗氧化酶过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)进行测定;一氧化氮(NO)含量高低是检测组织细胞损伤严重程度,NO由一氧化氮合酶(NOS)催化生成,NOS主要有两种结构型(cNOS)和诱导性(iNOS),iNOS在生理状态下不表达,当细胞受到外界刺激,iNOS催化合成非生理浓度的大量NO;取肝脏组织对一氧化氮(NO)、总一氧化氮合酶(TNOS)和诱导性一氧化氮合酶(iNOS)活力检测肝脏受损程度;实验表明:瘤果黑种草乙酸乙酯部位处理的糖尿病大鼠,大鼠肝组织中抗氧化酶T-SOD、CAT、GSH-PX活力明显提高,差异有显著性(P<0.05、P<0.05、P<0.01),MDA的含量降低,差异有显著性(P<0.01);肝脏组织中iNOS以及NO含量明显降低,差异有显著性(P<0.01、P<0.01),TNOS活力明显升高,差异有显著性(P<0.05)。实验表明,瘤果黑种草乙酸乙酯提取物在提升糖代谢酶活力达到降糖的同时还可以明显升高机体抗氧化酶系的活力(表2)。瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位能增强大鼠的抗应激能力,增加抗氧化酶活性,清除自由基,抑制或降低脂质过氧化反应而实现改善胰岛素抵抗。与此同时,瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位还能够有效降低大鼠因氧化应激而导致肝脏受损程度。
表3大鼠肝脏中抗氧化酶活力、一氧化氮酶活力、NO含量
结果表明,对体外小鼠骨骼肌胰岛素抵抗对葡萄糖消耗实验及大鼠肝脏、肌肉降糖和抗氧化实验表明瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位是通过降低血糖、降低氧化应激的方式达到改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗。
Claims (2)
1.一种瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位的用途,其特征在于所述瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位在制备改善胰岛素抵抗的药物中的用途,具体操作按下列步骤进行:
用石油醚对瘤果黑种草籽进行脱脂,取干燥的脱脂后瘤果黑种草籽,粉碎后,用浓度为50-95%乙醇按重量体积比瘤果黑种草籽∶乙醇=1:10浸泡或热回流提取,温度25-80℃,得到醇提物,将醇提物进行减压蒸馏,除去其中的乙醇,得到浓缩液,再将浓缩液用水或0-20%的乙醇分散后,用乙酸乙酯萃取,将萃取液减压蒸至糖浆状,温度40-45℃干燥,得到瘤果黑种草籽乙酸乙酯提取物。
2.根据权利要求1所述的一种瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位的用途,其特征在于所述瘤果黑种草籽乙酸乙酯部位在制备改善胰岛素抵抗的保健品中的用途。
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