CN104686811A - 利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法 - Google Patents

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CN104686811A CN201510148978.7A CN201510148978A CN104686811A CN 104686811 A CN104686811 A CN 104686811A CN 201510148978 A CN201510148978 A CN 201510148978A CN 104686811 A CN104686811 A CN 104686811A
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寇明钰
戴亚
薛芳
施丰成
沈怡
谭兰兰
丁为
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Abstract

本发明公开了一种利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，将烟草废弃物粉碎后按照粉碎料质量10％～20％的喷施比例喷洒具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌液，然后按照粉碎料质量5％～10％的喷施比例喷洒具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌液，混合均匀后在遮阴、排水通畅的角落堆放3～5天降解蛋白质和烟碱，获得饲料配料，将所述饲料配料按照牲畜饲料质量10％～30％的比例添加到牲畜饲料中喂养牲畜。本发明利用降蛋白微生物和降烟碱微生物对烟草废弃物进行处理，处理后的烟草碎末按照10％～30％的比例添加到牲畜常用的饲料中，提高了饲料中蛋白质的吸收率，节约了牲畜饲养成本，增加了烟叶作为牲畜饲料配料的适用性和安全性。

Description

利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法
技术领域
本发明的实施方式涉及烟田废弃物回收再利用技术领域，更具体地，本发明的实施方式涉及一种利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法。
背景技术
我国是世界上烤烟产量最高、种植面积最大的国家，2014年度全国烤烟原烟调拨量达到4100万担(一担为50公斤)，种植面积约为2000万亩。烟草植株一生经历苗期、团棵期、旺长期和成熟期，除了具有工业适用性的烟叶叶片外，烟草植株其他部位，如烟杆、烟根、烟花、烟杈、腋芽、打叶除掉的顶叶和脚叶作为烟草废弃物，大量丢弃在田间，既造成了污染，也是巨大的浪费。
2011年3月份国家烟草专卖局提出了“优化等级结构，提高优质烟叶的有效供给能力”的战略部署，对于大田烟叶的采收标准提出了更高的要求，势必造成田间产生更多的工业不适用烟叶，而烟草叶片中含有多种丰富的营养物质，如蛋白质、糖类、纤维素、果胶等，其中蛋白质含量达到8％-15％。蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。一种好的牲畜饲料，要求含有较高比例的优质蛋白质，而田间打叶去除掉的烟草顶叶和脚叶中，蛋白质含量高，且蛋白质质量好。虽然豆类植物蛋白质含量丰富，是牲畜饲料的优质来源，但豆类如豌豆中，含有胰蛋白酶抑制因子、外源植物凝集素、致胃肠胀气因子，不宜生喂。蛋白质被吸收的最终形态是氨基酸和部分小分子多肽，直接将饲料中的蛋白质降解为氨基酸和多肽，能提高蛋白质的吸收率。此外，烟叶中由于含有2％～4％左右的烟碱，利用降烟碱菌株将烟叶中的烟碱大部分代谢，转化为氨基酸和其他含氮化合物，提高其作为饲料的安全性。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供一种利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，有效利用降蛋白微生物对废弃烟叶进行处理，将大分子蛋白质部分降解为小分子多肽和氨基酸，利用降烟碱微生物将烟碱代谢转化为氨基酸和其他含氮化合物，将处理后的烟叶作为常规饲料的配料对牲畜进行喂养，丰富了原常规饲料的营养并降低喂养成本。
为解决上述的技术问题，本发明的一种实施方式采用以下技术方案：
一种利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，它包括以下步骤：
(1)将废弃的烟草顶叶和脚叶粉碎得到粉碎料，粉碎料的直径为0.75～0.85cm；
(2)将具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养使菌液中菌体浓度达到107～1010cfu/ml，然后按照步骤(1)所述粉碎料质量10％～20％的喷施比例将菌液喷洒在所述粉碎料的表面；
(3)将具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养使菌液中菌体浓度达到107～1010cfu/ml，然后按照步骤(1)所述粉碎料质量5％～10％的喷施比例将菌液喷洒在所述粉碎料的表面；
(4)将喷洒了上述两种菌液的粉碎料混合均匀后在遮阴、排水通畅的角落堆放3～5天获得饲料配料；
(5)将所述饲料配料按照牲畜饲料质量10％～30％的比例添加到牲畜饲料中喂养牲畜。
步骤(2)所述的菌液和步骤(3)所述的菌液可以同时喷洒在粉碎料上，也可以先喷洒步骤(2)所述的菌液，再喷洒步骤(3)所述的菌液，或者先喷洒步骤(3)所述的菌液，再喷洒步骤(2)所述的菌液。
进一步的技术方案是：所述具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株的制备方法是：
A、初筛
先用酪蛋白20.0g/L、NaCl5.0g/L、琼脂15.0g/L制培养基，调pH为7.2，灭菌后备用；称取烟田土壤样品10g加入90ml无菌水中，在摇床上室温振荡20min，静置20～30s即成10-1稀释液；吸取1ml10-1稀释液加入9ml无菌水中，吹吸3次即成10-2稀释液；以此类推，连续稀释制成10-3、10-4、10-5稀释液；取各种稀释度菌液1ml放入直径9cm的无菌培养皿内，将上述培养基熔化后冷却至50℃，迅速倒入无菌培养皿中，每皿15ml，混合均匀，待凝固后在37℃恒温培养7天，挑取产生透明圈的菌落分离纯化后接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中得到菌液，30℃、120rpm条件下振荡培养18～20h，备用；
B、复筛
将麸皮、水、浓度1％的葡萄糖溶液按照1kg:1L:1L的比例混合均匀制成复筛培养基，将复筛培养基分装在三角瓶中，灭菌，趁热抖散，冷却至40℃以下后接种步骤A备用的菌液，接种量为三角瓶中复筛培养基质量的10％，35～37℃培养48h，39℃烘干后测定中性蛋白酶活性，筛选出产蛋白酶能力最强的菌株；
C、烟叶发酵
将步骤B筛选出来的产蛋白酶能力最强的菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养18h得到种子培养液备用；取烟叶50g放入三角瓶中，灭菌，冷却后接种种子培养液50ml，30℃静置培养30天，检测烟叶中蛋白质含量，蛋白质含量最低的三角瓶中为具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株。
具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株能够降解蛋白质，将大分子蛋白质部分降解为小分子多肽和氨基酸，提高蛋白质利用率。
更进一步的技术方案是：步骤A所述接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基得到的菌液振荡培养至OD值达到0.7～0.8时停止振荡培养。
更进一步的技术方案是：步骤B中所述三角瓶分装复筛培养基的量为每500ml三角瓶分装麸皮干重30～40g的复筛培养基。
更进一步的技术方案是：所述具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株的制备方法是：
a、制备培养基
富集培养基的制备：按照蛋白胨5.0g/L、NaCl1.0g/L、K2HPO41.0g/L、琼脂1.5g/L溶解于水中，调pH为7.0，灭菌，冷却后加入烟碱2000mg/L；
初筛培养基和复筛培养基的制备：按照K2HPO41.0g/L、MgSO40.5g/L、浓度0.1％的MnSO4溶液1ml/L、浓度0.1％的FeSO4溶液3ml/L、琼脂1.5g/L溶解于水中，调pH为6.0～7.0，灭菌，若冷却后加入烟碱4000mg/L得到初筛培养基，若冷却后加入烟碱2000mg/L得到复筛培养基；
种子培养基的制备：按照牛肉膏3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、NaCl3.0g/L溶解于水中，调pH为7.0，灭菌；
发酵培养基的制备：将50g烟叶盛于三角瓶中，灭菌；
b、初筛
在烟叶基地取烟田土壤10g，加入100ml富集培养基中，30℃静置培养48h获得富集培养液，然后取1ml富集培养液接种于装有50℃初筛培养基的培养皿中，混合均匀，凝固后于30℃恒温培养箱7天，挑取菌落划线分离纯化三次后保藏备用；
c、复筛
将初筛得到的菌株接种于复筛培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养96小时，HPLC检测发酵液中烟碱的含量，挑选出烟碱含量降低的培养基，获得其中的菌株；
d、烟叶发酵
将复筛得到的菌株接种于种子培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养18小时，转接入发酵培养基，于30℃静置培养30天，检测到烟碱含量降低，该复筛得到的菌株即为具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株。
具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株能够降低烟叶废料中的烟碱，从而减少烟碱对牲畜的影响。
更进一步的技术方案是：所述灭菌的条件是121℃灭菌30～35分钟。
更进一步的技术方案是：步骤(2)所述菌液的喷施比例为质量分数15％～20％。
更进一步的技术方案是：步骤(3)所述菌液的喷施比例为质量分数8％～10％。
本发明所述牲畜是指兔子、猪、牛、羊、鸡等。在喷洒两种菌液到粉碎料表面时，两种菌液的喷洒可以同时进行，也可以先后实施。
与现有技术相比，本发明的有益效果之一是：本发明合理利用了烟草废弃物，即是对废弃资源的回收再利用，又是对环境污染的有效控制。将大田被扔弃的烟草顶叶和脚叶利用生物手段，即利用降蛋白微生物将烟叶中的大分子蛋白质降解为小分子多肽和氨基酸，接近蛋白质在动物体内吸收的最终形态，提高了蛋白质的有效利用率，利用降烟碱微生物对烟叶中的烟碱进行降解，得到产物为氨基酸和其他含氮化合物，增加了烟叶作为牲畜饲料配料的适用性和安全性。在此过程中，废弃烟叶被粉碎为直径0.8cm左右的碎末，提高了微生物菌株的作用效果，发酵后的烟草碎末按照10％～30％的比例添加到牲畜常用的饲料中，提高了饲料中蛋白质的吸收率，节约了牲畜饲养成本。
将本专利处理得到的烟草碎末按照10％～30％添加到常规饲料中对牲畜进行饲养，对照组比空白组牲畜体重平均增加5％～10％，节约经济成本8％～25％。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株的分离纯化：
A、初筛
先用酪蛋白20.0g、NaCl5.0g、琼脂15.0g与蒸馏水定容为1L制培养基，调pH为7.2，灭菌后备用；称取烟田土壤样品(重庆丰都太平烟叶基地)10g加入90ml无菌水中，在摇床上室温振荡20min，静置25s即成10-1稀释液；吸取1ml10-1稀释液加入9ml无菌水中，吹吸3次即成10-2稀释液；以此类推，连续稀释制成10-3、10-4、10-5稀释液；取各种稀释度菌液1ml放入直径9cm的无菌培养皿内，将上述培养基熔化后冷却至50℃，迅速倒入无菌培养皿中，每皿15ml，混合均匀，待凝固后在37℃恒温培养7天，挑取产生透明圈的菌落分离纯化后接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中得到菌液，30℃、120rpm条件下振荡培养18～20h，备用；
B、复筛
将麸皮、水、浓度1％的葡萄糖溶液按照1kg:1L:1L的比例混合均匀制成复筛培养基，将复筛培养基分装在三角瓶中，灭菌，趁热抖散，冷却至40℃以下后接种步骤A备用的菌液，接种量为三角瓶中复筛培养基质量的10％，35℃培养48h，39℃烘干后测定中性蛋白酶活性，筛选出产蛋白酶能力最强的菌株；
C、烟叶发酵
将步骤B筛选出来的产蛋白酶能力最强的菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养18h得到种子培养液备用；取烟叶50g放入三角瓶中，灭菌，冷却后接种种子培养液50ml，30℃静置培养30天，检测烟叶中蛋白质含量，蛋白质含量最低的三角瓶中为具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株，该菌株用于制备牲畜饲料。
二、具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株的分离纯化：
富集培养基：将蛋白胨5.0g、NaCl1.0g、K2HPO41.0g、琼脂1.5g和水定容为1L，pH7.0，121℃灭菌30min，冷却后加入烟碱2000mg。
初筛培养基：将K2HPO41.0g、MgSO40.5g、浓度0.1％的MnSO4溶液1ml、浓度0.1％的FeSO4溶液3ml、琼脂1.5g与水定容为1L，pH6.0，121℃灭菌30min，冷却后加入烟碱4000mg得到初筛培养基。
复筛培养基的制备：将K2HPO41.0g、MgSO40.5g、浓度0.1％的MnSO4溶液1ml、浓度0.1％的FeSO4溶液3ml、琼脂1.5g与水定容为1L，pH6.0，121℃灭菌30min，冷却后加入烟碱2000mg得到复筛培养基；
种子培养基：将牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、NaCl3.0g水定容为1L，pH7.0，121℃灭菌30min。
发酵培养基：将50g烟叶盛于三角瓶中，121℃灭菌30min。
7月在重庆丰都太平烟叶基地采集烟田土壤10g，加入100ml富集培养基中，30℃静置培养48h获得富集培养液，然后取1ml富集培养液接种于装有50℃初筛培养基的培养皿中，混合均匀，凝固后于30℃恒温培养箱7天，挑取菌落划线分离纯化三次，接种于复筛培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养96小时，HPLC检测发酵液中烟碱的含量，挑选出烟碱含量降低最多的培养基，获得其中的菌株；将该菌株接种于种子培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养18小时，转接入发酵培养基，于30℃静置培养30天，检测烟碱含量是否降低，若明显降低则复筛得到的菌株即为具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株，该菌株用于制备牲畜饲料。
实施例1
将大田废弃的烟草顶叶和脚叶100kg用粉碎机制备成大小均一，直径为0.8cm左右的颗粒末；将具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养，菌体浓度达到1010cfu/ml，按照20％的比例喷施粉粹的烟叶表面；将具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养，菌体浓度达到1010cfu/ml，按照10％的比例喷施粉粹的烟叶表面，将已经喷洒了两种菌液的颗粒末混合均匀后堆放在遮阴、排水通畅的角落，经过5天，排干发酵液体；将发酵好的烟草碎末按照28％的比例添加到牛常用的饲料中，对牛进行喂养，喂养150天后，对照组比空白组牛的体重平均增加9.2％，节约经济成本22.5％左右。
实施例2
将大田废弃的烟草顶叶和脚叶100kg用粉碎机制备成大小均一，直径为0.8cm左右的颗粒末；将具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养，菌体浓度达到109cfu/ml，按照10％的比例喷施粉粹的烟叶表面；同时将具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养，菌体浓度达到1010cfu/ml，按照10％的比例喷施粉粹的烟叶表面，将已经喷洒了两种菌液的颗粒末混合均匀后堆放在遮阴、排水通畅的角落，经过4天，排干发酵液体；将发酵好的烟草碎末按照20％的比例添加到羊常用的饲料中，对羊进行喂养，喂养70天后，对照组比空白组羊的体重平均增加6％，节约经济成本13％左右。
实施例3
将大田废弃的烟草顶叶和脚叶100kg用粉碎机制备成大小均一，直径为0.8cm左右的颗粒末；将具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养，菌体浓度达到109cfu/ml，按照18％的比例喷施粉粹的烟叶表面；将具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养，菌体浓度达到1010cfu/ml，按照10％的比例喷施粉粹的烟叶表面，将已经喷洒了两种菌液的颗粒末混合均匀后堆放在遮阴、排水通畅的角落，经过4天，排干发酵液体；将发酵好的烟草碎末按照22％的比例添加到猪常用的饲料中，对猪进行喂养，喂养70天后，对照组比空白组猪的体重平均增加8％，节约经济成本17％左右。
实施例4
将大田废弃的烟草顶叶和脚叶100kg用粉碎机制备成大小均一，直径为0.8cm左右的颗粒末；将具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养，菌体浓度达到109cfu/ml，按照15％的比例喷施粉粹的烟叶表面；将具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养，菌体浓度达到108cfu/ml，按照6％的比例喷施粉粹的烟叶表面，将已经喷洒了两种菌液的颗粒末混合均匀后堆放在遮阴、排水通畅的角落，经过3天，排干发酵液体；将发酵好的烟草碎末按照12％的比例添加到猪常用的饲料中，对猪进行喂养，喂养70天后，对照组比空白组猪的体重平均增加5％，节约经济成本8％左右。
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims (8)

1.一种利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)将废弃的烟草顶叶和脚叶粉碎得到粉碎料，粉碎料的直径为0.75～0.85cm；
(2)将具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养使菌液中菌体浓度达到107～1010cfu/ml，然后按照步骤(1)所述粉碎料质量10％～20％的喷施比例将菌液喷洒在所述粉碎料的表面；
(3)将具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养使菌液中菌体浓度达到107～1010cfu/ml，然后按照步骤(1)所述粉碎料质量5％～10％的喷施比例将菌液喷洒在所述粉碎料的表面；
(4)将喷洒了上述两种菌液的粉碎料混合均匀后在遮阴、排水通畅的角落堆放3～5天获得饲料配料；
(5)将所述饲料配料按照牲畜饲料质量10％～30％的比例添加到牲畜饲料中喂养牲畜。
2.根据权利要求1所述的利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于所述具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株的制备方法是：
A、初筛
先用酪蛋白20.0g/L、NaCl5.0g/L、琼脂15.0g/L制培养基，调pH为7.2，灭菌后备用；称取烟田土壤样品10g加入90ml无菌水中，在摇床上室温振荡20min，静置20～30s即成10-1稀释液；吸取1ml10-1稀释液加入9ml无菌水中，吹吸3次即成10-2稀释液；以此类推，连续稀释制成10-3、10-4、10-5稀释液；取各种稀释度菌液1ml放入直径9cm的无菌培养皿内，将上述培养基熔化后冷却至50℃，迅速倒入无菌培养皿中，每皿15ml，混合均匀，待凝固后在37℃恒温培养7天，挑取产生透明圈的菌落分离纯化后接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中得到菌液，30℃、120rpm条件下振荡培养18～20h，备用；
B、复筛
将麸皮、水、浓度1％的葡萄糖溶液按照1kg:1L:1L的比例混合均匀制成复筛培养基，将复筛培养基分装在三角瓶中，灭菌，趁热抖散，冷却至40℃以下后接种步骤A备用的菌液，接种量为三角瓶中复筛培养基质量的10％，35～37℃培养48h，39℃烘干后测定中性蛋白酶活性，筛选出产蛋白酶能力最强的菌株；
C、烟叶发酵
将步骤B筛选出来的产蛋白酶能力最强的菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养18h得到种子培养液备用；取烟叶50g放入三角瓶中，灭菌，冷却后接种种子培养液50ml，30℃静置培养30天，检测烟叶中蛋白质含量，蛋白质含量最低的三角瓶中为具有降蛋白作用的芽孢杆菌菌株。
3.根据权利要求2所述的利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于步骤A所述接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基得到的菌液振荡培养至OD值达到0.7～0.8时停止振荡培养。
4.根据权利要求2所述的利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于步骤B中所述三角瓶分装复筛培养基的量为每500ml三角瓶分装麸皮干重30～40g的复筛培养基。
5.根据权利要求1所述的利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于所述具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株的制备方法是：
a、制备培养基
富集培养基的制备：按照蛋白胨5.0g/L、NaCl1.0g/L、K2HPO41.0g/L、琼脂1.5g/L溶解于水中，调pH为7.0，灭菌，冷却后加入烟碱2000mg/L；
初筛培养基和复筛培养基的制备：按照K2HPO41.0g/L、MgSO40.5g/L、浓度0.1％的MnSO4溶液1ml/L、浓度0.1％的FeSO4溶液3ml/L、琼脂1.5g/L溶解于水中，调pH为6.0～7.0，灭菌，若冷却后加入烟碱4000mg/L得到初筛培养基，若冷却后加入烟碱2000mg/L得到复筛培养基；
种子培养基的制备：按照牛肉膏3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、NaCl3.0g/L溶解于水中，调pH为7.0，灭菌；
发酵培养基的制备：将50g烟叶盛于三角瓶中，灭菌；
b、初筛
在烟叶基地取烟田土壤10g，加入100ml富集培养基中，30℃静置培养48h获得富集培养液，然后取1ml富集培养液接种于装有50℃初筛培养基的培养皿中，混合均匀，凝固后于30℃恒温培养箱7天，挑取菌落划线分离纯化三次后保藏备用；
c、复筛
将初筛得到的菌株接种于复筛培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养96小时，HPLC检测发酵液中烟碱的含量，挑选出烟碱含量降低的培养基，获得其中的菌株；
d、烟叶发酵
将复筛得到的菌株接种于种子培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养18小时，转接入发酵培养基，于30℃静置培养30天，检测到烟碱含量降低，该复筛得到的菌株即为具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株。
6.根据权利要求2或5所述的利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于所述灭菌的条件是121℃灭菌30～35分钟。
7.根据权利要求1所述的利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于步骤(2)所述菌液的喷施比例为质量分数15％～20％。
8.根据权利要求1所述的利用微生物处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于步骤(3)所述菌液的喷施比例为质量分数8％～10％。
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