CN104686327A - 一种单叶刺槐组培快繁体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单叶刺槐组培快繁体系的建立方法，涉及刺槐（Robinia. pseudoacacia）通过植物组织培养技术短时间内快速获得大量刺槐优良木苗的方法。本发明以单叶刺槐一年生木质化带芽茎段为外植体，经过启动培养、继代与增殖培养、壮苗与生根培养、炼苗及移栽等过程建立了单叶刺槐组培快繁体系，为其规模化生产提供技术支持，并为进一步进行分子育种奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种单叶刺槐组培快繁体系的建立方法。
背景技术
刺槐（Robinia. pseudoacacia）是豆科刺槐属落叶乔木，是良好的用材、保持水土、防风固沙、改良土壤和“四旁”绿化树种。刺槐原产于美国，天然分布于美国东部阿柏拉契亚山脉和奥萨克山脉，由于其具有较强的适应性和速生性，被多个国家引种栽培，与杨树、桉树一起称为世界上引种最成功的三大树种之一。自1877年被引入我国以来，刺槐在中国已经实现了乡土化，并形成了不少地方类型。刺槐木材质重而坚硬，抗压强度高，宜作矿柱材和桩材。其纹理细致，耐磨、耐腐，亦可作家具、农具、机械部件、水工和木工用材。枝叶和树根易燃、火力强、发烟少、燃时长，是良好薪材。刺槐因具有较强的滞尘抗烟能力，而且对氟化氢、氯气、臭氧、二氧化硫等气体的抗性较强，具有一定的吸收功能，被广泛用于城市绿化、工矿绿化的园林树种。
刺槐林是我国落叶林中栽植范围最广泛的人工林，其适应性强、耐干旱瘠薄，在石灰性、酸性、中性以及轻度盐碱的土壤中均能正常生长，因此在贫瘩山区、盐碱地大力发展刺槐种植，对土壤改良、水土保持具有重要的意义。目前，刺槐种苗主要是采用扦插法、埋根法、嫁接法和播种法进行繁育，由于这些方法繁殖系数低、周期长，远远不能满足大规模造林对刺槐种苗的需要。因此很有必要建立完整的刺槐离体快繁体系，为生产实践提供优质的刺槐种苗。
发明内容
本发明的目的在于提供出一种单叶刺槐组培快繁体系的建立方法，本发明以单叶刺槐一年生木质化带芽茎段为外植体，经过启动培养、继代与增殖培养、壮苗与生根培养、炼苗及移栽等过程建立了单叶刺槐组培快繁体系，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种单叶刺槐组培快繁体系的建立方法，包括以下的步骤：
（1）启动培养：选取健壮单叶刺槐植株一年生木质化带芽茎段作为外植体，剪去叶片，切成3.0～5.0长的带有2～3个腋芽的节段先用洗衣粉水冲洗1～3h，再用软毛刷轻轻刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗1～3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5～30s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒10～25min，用无菌水冲洗4～6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后接种到启动培养基进行诱导培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～7天，然后置于每天光照10～12小时，光照强度为1500～3000lx，直至诱导形成丛生芽。
（2）继代与增殖培养：将步骤（1）培养已萌发的腋芽剪切成带芽的小段并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养，多次反复切割进行继代培养，以得到更多的萌芽。
（3）生根培养：将步骤（1）或（2）过程获得的高度约为2.5～3.5cm的丛生芽芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照11～12小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根。
（4）炼苗移栽：将步骤（3）获得的高约6～8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5～7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：沙土＝2:1混合成的基质,置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田。
上述步骤（1）所述的启动培养基为：MS+1～3mg/L6-BA+0.1～1mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（2）所述的增殖培养基为：N6+0.5～1.5mg/LNAA+1～3mg/L 6-BA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（3）所述的生根培养基为：1/2MS+0.1～1mg/L NAA+0.1～1mg/L IBA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
与现有技术相比本发明的优点是：本发明通过植物组织培养技术短时间内快速获得大量刺槐优良木苗的方法。以单叶刺槐一年生木质化带芽茎段为外植体，经过启动培养、继代与增殖培养、壮苗与生根培养、炼苗及移栽等过程建立了单叶刺槐组培快繁体系，为其规模化生产提供技术支持，并为进一步进行分子育种奠定基础。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
（1）启动培养：选取健壮单叶刺槐植株一年生木质化带芽茎段作为外植体，剪去叶片，切成3.0～5.0长的带有2～3个腋芽的节段先用洗衣粉水冲洗1h，再用软毛刷轻轻刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗1h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5s后用无菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒10min，用无菌水冲洗4次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后接种到启动培养基进行诱导培养，接种后先在28℃条件下全暗培养2天，然后置于每天光照10小时，光照强度为1500lx条件下培养5天即可开始形成丛生芽，污染率低到5%以下，芽诱导率为87%。所述的启动培养基为：MS+1mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。
（2）继代与增殖培养：将步骤（1）培养已萌发的腋芽剪切成带芽的小段并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在28℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照12小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为28℃的条件下培养35天后增殖苗可长至3.74cm，增殖系数为5.09.多次反复切割进行继代培养，以得到更多的萌芽。所述的增殖培养基为：N6+0.5mg/LNAA+1.5mg/L 6-BA+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。
（3）生根培养：将步骤（1）或（2）过程获得的高度约为2.5～3.5cm的丛生芽芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照11小时，光照强度为2000lx，培养温度为28℃的条件下培养至生根，生根率为88.3%，平均生根条数达3.62条。所述的生根培养基为：1/2MS+0.3mg/L NAA+0.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。
（4）炼苗移栽：将步骤（3）获得的高约6～8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：沙土＝2:1混合成的基质,置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率为83.7%。
实施例2：
（1）启动培养：选取健壮单叶刺槐植株一年生木质化带芽茎段作为外植体，剪去叶片，切成3.0～5.0长的带有2～3个腋芽的节段先用洗衣粉水冲洗1h，再用软毛刷轻轻刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗2h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒8s后用无菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒15min，用无菌水冲洗4次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后接种到启动培养基进行诱导培养，接种后先在28℃条件下全暗培养2天，然后置于每天光照11小时，光照强度为1500lx条件下培养7天即可开始形成丛生芽，污染率低到8%以下，芽诱导率为83%。所述的启动培养基为：MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.6。
（2）继代与增殖培养：将步骤（1）培养已萌发的腋芽剪切成带芽的小段并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在28℃条件下全暗培养2天，然后置于每天光照12小时，光照强度为1500lx，置于培养温度为28℃的条件下培养37天后增殖苗可长至3.28cm，增殖系数为4.59.多次反复切割进行继代培养，以得到更多的萌芽。所述的增殖培养基为：N6+0.3mg/LNAA+1.8mg/L 6-BA+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.6。
（3）生根培养：将步骤（1）或（2）过程获得的高度约为2.5～3.5cm的丛生芽芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，培养温度为28℃的条件下培养至生根，生根率为85.9%，平均生根条数达3.12条。所述的生根培养基为：1/2MS+0.6mg/L NAA+0.4mg/L IBA+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.6。
（4）炼苗移栽：将步骤（3）获得的高约6～8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：沙土＝2:1混合成的基质,置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率为90.1%。
Claims (4)
1.一种单叶刺槐组培快繁体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）启动培养：选取健壮单叶刺槐植株一年生木质化带芽茎段作为外植体，剪去叶片，切成3.0～5.0长的带有2～3个腋芽的节段先用洗衣粉水冲洗1～3h，再用毛刷刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗1～3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5～30s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒10～25min，用无菌水冲洗4～6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后接种到启动培养基进行诱导培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～7天，然后置于每天光照10～12小时，光照强度为1500～3000lx，直至诱导形成丛生芽；
（2）继代与增殖培养：将步骤（1）培养已萌发的腋芽剪切成带芽的小段并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养，多次反复切割进行继代培养，得到萌芽；
（3）生根培养：将步骤（1）或（2）过程获得的高度约为2.5～3.5cm的丛生芽芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照11～12小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根；
（4）炼苗移栽：将步骤（3）获得的高约6～8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5～7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：沙土＝2:1混合成的基质,置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度，待幼苗成活后再移栽大田。
2.根据权利要求1所述的一种单叶刺槐组培快繁体系的建立方法，其特征在于步骤（1）所述的启动培养基为：MS+1～3mg/L6-BA+0.1～1mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
3.根据权利要求1所述的一种单叶刺槐组培快繁体系的建立方法，其特征在于步骤（2）所述的增殖培养基为：N6+0.5～1.5mg/LNAA+1～3mg/L 6-BA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
4.根据权利要求1所述的一种单叶刺槐组培快繁体系的建立方法，其特征在于步骤（3）所述的生根培养基为：1/2MS+0.1～1mg/L NAA+0.1～1mg/L IBA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
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