CN104684407A - 口部制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及口部组合物,所述口部组合物包含挥发性硫化合物呼气臭味控制量的甲基硫醇氧化酶。所述口部组合物可以在用于控制对象中呼气臭味的方法中使用,所述方法包括将所述组合物施用到对象的口腔中。本发明还提供了具有甲基硫醇氧化酶活性的多肽,其中所述多肽是:(a)包含SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列的多肽;(b)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少50%的序列同一性的氨基酸序列的多肽;(c)由包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3示出的多核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽;或(d)(a)、(b)或(c)定义的多肽的片段。
Description
发明领域
本发明涉及口部组合物(oral composition)。本发明还涉及用于控制呼气臭味的方法,所述方法包括:提供根据前述权利要求中任意一项的口部组合物;并且将所述组合物施用到口腔(oral cavity)。本发明还提供了用于控制呼气臭味的口部组合物以及所述口部组合物用于制造用于控制呼气臭味的药物的用途。本发明还提供了甲基硫醇氧化酶多肽、编码此多肽的多核苷酸、包含此多核苷酸的核酸构建体和宿主细胞、生产甲基硫醇氧化酶多肽的方法和包含此多肽的组合物。
发明背景
在大多数情况下(85-90%),口气源自口(mouth)本身。白天口气的强度由于食用某些食物(如大蒜、洋葱、肉、鱼和乳酪),肥胖,吸烟和饮酒而不同。由于口被暴露于较少的氧并且在夜间不活动,臭味通常在睡醒时更重(“晨起口气”)。口气可能是短暂的,往往在饮食、刷牙、使用牙线或用专门的漱口剂冲洗之后消失。口气也可能是持续的(慢性口气),这是更严重的情况,以不同程度影响大约25%的人群。
大多数报告现在同意口臭最常见(80-90%)的来源在于口腔中并且包括细菌储积处(bacteria reservoirs)如舌面、唾液和牙周袋,其中厌氧细菌降解含硫氨基酸,产生恶臭的挥发性硫化合物(volatile sulphur compounds,VSCs)。虽然有些人的确认为其他臭味挥发物如某些胺和脂肪酸可能起作用,但这些VSCs是口腔恶臭的主要因素。
大多数医生和牙医对慢性口臭并未很好地理解,所以一直不容易找到有效的治疗。可能会建议以下策略:
(i)每日两次轻轻地清洁舌头表面是控制口气的最有效方法;这可以使用牙刷、舌头清洁器或舌刷/舌刮来擦掉细菌生物层、残渣和粘液来实现。在舌头表面涂刷少量的抗菌口腔清洗剂或舌头凝胶(tongue gel)将进一步抑制细菌活动。
(ii)进食有粗糙食物的健康早餐帮助清洁舌头的最后部。
(iii)由于口干可增加细菌的堆积,引起或加重口臭,咀嚼无糖口香糖可以帮助生产唾液,从而有助于减少口气。当口干时或当不能在用餐(尤其是餐品富含蛋白质)之后进行口腔卫生程序时,咀嚼可能尤其有用。这有助于提供唾液,唾液冲走口部细菌,具有抗菌特性并促进帮助清洁口的机械活动。
(iv)虽然漱口剂可能含有被大多数牙膏中存在的皂剂失活的活性成分,但有时建议睡前用有效漱口剂漱口。因此,避免在用牙膏刷牙后直接使用漱口剂(也见漱口剂,下方)是推荐的。
(v)益生菌治疗,特别是Streptococcus salivarius K12已经显示抑制恶臭细菌的生长。
但是,还没有一个记载的医疗案例是用任何目前可用的漱口剂成功治愈慢性口臭的。而且,漱口剂经常含有抗菌剂包括氯化十六烷吡啶、氯己定,其可引起牙齿的临时染色,具有令人不快的味道,并且重要的是,可干扰有益口部细菌菌群的生长。漱口剂也可含有酒精,酒精是干燥剂并可恶化慢性口气。
应避免口部组合物例如漱口剂和口香糖的抗菌/杀菌活性,因为它们影响口部生态系统。例如,含有氯己定的漱口剂将口部硝酸盐还原力削弱90%并由此削弱血浆亚硝酸盐水平的水平25%,导致2-3.5mm的血压升高(Kapil等人Free Radical Biology and Medicine 55(2013)93-100)。这是高度显著的,因为Cook等人(Archives of Internal Medicine 155(7)(1995)701-9)估计年龄在35-64岁的白种美国受试者的人口平均舒张血压的2mm Hg的降低将导致高血压患病率减少17%,中风风险减少15%以及冠心病风险减少6%。
虽然口气主要会带来尴尬或烦扰,然而最主要造成口臭的VSCs也会潜在损害口中的组织,并且可以导致牙周炎(牙龈和支撑牙齿的韧带的炎症)。特别地,已发现VSCs通过切割二硫键来破坏结缔组织中的胶原蛋白和蛋白聚糖组分。胞外基质的这种解聚集使得微生物渗入口部粘膜。随着细菌进一步在牙齿附近形成的袋中积聚,牙周疾病以及口臭发展。如果牙周疾病显著恶化,整体的系统健康可受到危害;例如,牙周细菌的副产物可以进入血流并可导致心脏疾病、中风和婴儿出生体重过轻。
很明显,口臭影响美容和健康。
因此,需要可以用来控制口气并避免相关健康问题的改进的口部组合物。理想情况下,这些组合物应当是口感中性,避免染色牙齿并且是非抗菌性的。
发明概要
本发明涉及控制呼气臭味(breath-odour),特别是控制挥发性硫化合物(VSCs)的组合物。已经发现用口呼气的感官评分测量的口部内口臭的程度和口呼气中VSCs硫化氢(H2S)和甲基硫醇(CH3SH)的浓度之间的强相关性。
根据本发明,由此提供了包含挥发性硫化合物呼气臭味控制量的甲基硫醇氧化酶(MM-氧化酶)的口部组合物。然而,该酶尚未被克隆并且无序列信息可用;而且,所述酶仅仅曾从细胞培养物中分离。已知的表达MMO-氧化酶的微生物种的培养物是不普通的,需要使用非标准的培养基以及恶臭或有毒的基质。因此,目前没有可以用于本发明制剂的方便的、节省成本的MMO-氧化酶来源。鉴于此,本文中描述了鉴定MMO-氧化酶的基因序列以及它们在容易培养的微生物中表达的策略。
该策略的使用促成了新的MM-氧化酶的鉴定。虽然几种硫细菌的基因组已经被测序,它们之中没有一个包含本文所鉴定的MM-氧化酶基因序列(具有SEQ ID NO:2示出的氨基酸,实施例中也被称为HDEA00816)。获得这种酶的序列使得其能用常规的酶表达技术来生产,提供MM-氧化酶的方便的来源。
因此,本发明提供了含有MM-氧化酶的组合物,所述组合物可以容易地以节省成本的方式来生产。本发明的组合物中使用的MM-氧化酶可以是任何MM-氧化酶,例如本文所描述的MM-氧化酶。
因此,本发明提供了包含挥发性硫化合物呼气臭味控制量的甲基硫醇氧化酶的口部组合物。酶组合物已知是非抗菌的/非杀菌的(有一些公知的例外,例如氯过氧化物酶和乳过氧化物酶)。因此,本发明的MM-氧化酶组合物是有利的,因为它们不会干扰口部菌群。此外,这样的组合物是无味的,不像例如被提出用于口部组合物并且具有很强的芥末味的异硫氰酸烯丙酯。
本发明另外提供了具有甲基硫醇氧化酶活性的多肽,其中所述多肽是:
(a)包含SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列的多肽;
(b)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少50%的序列同一性的氨基酸序列的多肽;
(c)由包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3示出的多核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽;或
(d)(a)、(b)、(c)或(d)定义的多肽的片段。
这样的多肽可以用于本发明的口部组合物。
本发明还提供了:
-编码本发明的多肽的多核苷酸;
-包含本发明的多核苷酸的核酸构建体;
-包含本发明的多核苷酸或核酸构建体的宿主细胞;
-生产本发明的多肽的方法,其包括:
(a)在有益于由所述宿主细胞(host cell)生产所述多肽的条件下培养本发明的宿主细胞;以及,任选地
(b)回收所述多肽;
-组合物,例如口部组合物,包含本发明的多肽和至少一种另外的成分;
-用于控制对象(host)中呼气臭味的方法,所述方法包括:
提供本发明的组合物,例如包含本发明的多肽的组合物;并且
将所述组合物施用到对象的口腔中;
-用于控制呼气臭味的本发明的口部组合物;以及
-本发明的口部组合物用于制备用于控制呼气臭味的药物的用途;
附图描述
图1示出了通过DEAE和羟基磷灰石层析纯化的DMSO生长的Hyphomicrobium EG细胞的裂解物的SDS-PAGE。泳道1:分子量标记;泳道2:DEAE层析后的细胞提取物;泳道3和4:羟基磷灰石柱的流过物(flow-through);泳道5、6和7:从羟基磷灰石柱洗脱的第一蛋白峰的峰级分;泳道8、9和10:从羟基磷灰石柱洗脱的第二蛋白峰的峰级分。
图2示出了多种E.coli克隆MMO1(‘101’)、MMO2(‘102’,三个不同的转化体)、MMO3(‘103)和MMO4(‘104)的裂解物中存在的乙基硫醇氧化酶活性。‘参照(Ref)’是指来自没有Hyphomicrobium基因插入物的转化体的E.coli裂解物。酶活力单位:1单位=在30℃下每分钟转化1微摩尔乙基硫醇。
图3示出了如顶空分析(headspace analysis)测试的通过与Zendium牙膏混合的不同羟基磷灰石酶级分的甲基硫醇随着时间的降解。
序列表描述
SEQ ID NO:1示出了名为MMO2的开放阅读框的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2示出了HDEA00816蛋白(MMO2)的氨基酸序列,其没有推定的信号肽MAFSLGVTPSSA。
SEQ ID NO:3示出了5′端引入NdeI位点和3′端引入终止密码子和AscI和HindIII位点的E.coli优化的MMO2基因(命名MMO2E)的核苷酸序列。
发明内容
在本申请的整个说明书和所附权利要求书中,词语“包括”、“包含”和“具有”及其变化形式应被解释为包含性的。也就是说,在上下文允许时,这些词语旨在传达可能包括未明确指出的其他要素或整体数。
在本文中没有数量词修饰时用于表示一或多于一(即一或至少一)的客体。例如,“元件”可表示一个/种元件或多于一个/种元件。
本发明涉及控制呼气臭味的口部组合物。也就是说,本发明的口部组合物旨在减少可造成呼气臭味的一种或更多种挥发性硫化合物(VSCs)的量。因此,在本发明的上下文中,挥发性硫化合物呼气臭味控制量的甲基硫醇氧化酶是减少一种或更多种VSCs的存在使得呼气臭味减少(例如如化学测定或感官测定的)的量。
本文中,术语呼气臭味(breath-odour)、口臭(halitosis)、恶臭(malodour)等都旨在表示存在臭味的VSCs。
术语“口部恶臭(oral malodour)”已被使用在文献中来指源自口的口气。然而,Tangerman和Winkel(J Clin.Perodontol.34,748-755,2007)区分使用了术语“口内口臭(intra-oral halitosis)”而非口部恶臭,以便将其与口外口臭(extra-oral halitosis)区分。口内口臭和口外口臭之间的区分可以通过比较口呼气与鼻呼气来进行。
Tangerman和Winkel认为,在口部口臭中,相比H2S,口呼气中的VSC甲基硫醇MM(CH3SH)的存在是口部恶臭的更主要致病因素。
本发明的组合物包含甲基硫醇氧化酶(MM-氧化酶)。MM-氧化酶是具有能够氧化甲基硫醇的活性的任何酶。也就是说,MM-氧化酶(EC1.8.3.4)是催化下述化学反应的任何酶:
该酶的3个底物是甲硫醇(甲基硫醇)、O2和H2O,而其3个产物是甲醛、硫化氢和H2O2。
所述酶属于氧化还原酶家族,特别是以氧作为受体作用在供体的硫基团的那些。该酶类别的系统名称是甲硫醇:氧氧化还原酶。适合用于本发明的酶可以被称作甲硫醇氧化酶、甲基硫醇(methylmercaptan)氧化酶、甲基硫醇(methyl mercaptan)氧化酶、(MM)-氧化酶或MT-氧化酶。
适合用于本发明的MM-氧化酶可以是来自任何来源的任何MM-氧化酶。本发明的口部组合物可以包含源自或可源自Hyphomicrobium种特别是Hyphomicrobium EG、Rhodococcus种例如Rhodococcus rhodochrous或Thiobacillus种例如Thiobacillus thioparus的甲基硫醇氧化酶。
术语“源自”在本文中也包括术语“由......起源”、“由......获得”、“由......能够获得”、“由......分离”和“由......产生”并且一般表示一个特定的材料由另一个特定的材料起源或者具有可以参照另一个特定的材料来描述的特征。如本文所用,“源自”微生物的物质(例如核酸分子或多肽)优选地是指所述物质对该微生物而言是本源的(native)。
由任何上述微生物物种传统生产MM氧化酶经济上是不可行的。尤其是因为相关基质的毒性或不良气味,以及因为这样的生物体在最大化所期望的MM-氧化酶活性的生产所需的基质上的非常低的生长率。因此,通常需要通过重组DNA技术过表达所述酶来为本发明的口部组合物提供MM-氧化酶。
本文描述了可以通过重组手段来表达的MM-氧化酶。当涉及细胞、核酸、蛋白质或载体时,术语“重组”表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰,或所述细胞是源自如此修饰的细胞。因此,例如,重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中没有发现的基因或表达否则异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。术语“重组”与“遗传修饰”是同义的。
因此,本发明提供了具有MM-氧化酶活性的多肽。这样的多肽可以选自由以下组成的组:
(a)包含SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列的多肽;
(b)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少50%的序列同一性的氨基酸序列的多肽;
(c)由包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3示出的多核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽;或
(d)(a)、(b)或(c)定义的多肽的片段。
这样的多肽可以包含与SEQ ID NO:2有至少60%序列同一性、优选至少约70%、更优选至少约80%、更优选至少约85%、甚至更优选至少约90%、甚至更优选至少约93%、甚至更优选至少约95%、甚至更优选至少约96%、优选至少约97%、甚至更优选至少约98%并且甚至最优选至少约99%的序列同一性的氨基酸序列。
也就是说,本发明涉及包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽并涉及其变体(如上所示与SEQ ID NO:2具有序列同一性)。如本文所用,术语“变体”、“衍生物”、“突变体”或“同源物”可以互换使用。它们可以指多肽(或指核酸等。变体相对于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽在一个或更多个位置包含替换、插入、缺失、截短、颠换(transversion)和/或倒位(inversion)。变体可以例如通过位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、定位诱变和定向进化以及多种其他重组方法来制备。变体多肽可以有少数氨基酸残基不同于参考多肽,并且可以通过一级氨基酸序列与参考多肽的同源性/同一性的水平来定义。
优选地,变体多肽与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽具有至少50%、至少60%、至少70%70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的氨基酸序列同一性。
本发明的变体可以是包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的等位变体。“多肽的等位变体”在此定义为由基因的等位变体编码的多肽。术语“基因的等位变体”在本文中是指占据相同染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式的任意种。基因的等位变体可以包括沉默的(导致由该基因编码的多肽的氨基酸序列没有变化)基因突变;其可以包括导致具有改变的氨基酸序列的多肽的基因突变,或者其可以两者均包括。
用于测定同一性百分比的方法是本领域已知的并在本文中被描述。一般地,变体保留了参考多肽的特征性质,但在一些特定方面具有改变的特性。例如,变体可具有改变的最佳pH、改变的底物结合能力、改变的对酶促降解或其他降解的抗性、增加的或降低的活性、改变的温度稳定性或氧化稳定性,但保留其特征性功能。变体还包括具有化学修饰的多肽,所述化学修饰更改参考多肽的特征。
对于核酸,术语“变体”可以指编码变体多肽的核酸,其与包含SEQID NO:1或3示出的核酸序列的多核苷酸具有特定程度的同源性/同一性。优选地,变体多核苷酸与包含SEQ ID NO:1或3示出的核酸序列的多核苷酸具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的核酸序列同一性,测定同一性百分比的方法是本领域已知的并在本文被描述。
本文所指的序列同一性可以相对于成熟多肽或相对于前原肽或原肽来测定。术语“成熟多肽”在本文定义为最终形式的并且在mRNA翻译成多肽且所述多肽在翻译后修饰之后获得的多肽。翻译后修饰包括N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化和如本文所定义通过切割除去例如信号肽、原肽和/或前原肽的前导序列。术语“前原肽”在本文中被定义为存在于多肽的氨基末端的信号肽和原肽,其中所述原肽同框连接(或融合)至多肽的氨基末端并且所述信号肽同框连接(或融合)至原肽区的氨基末端。术语“信号肽”在本文被定义为同框连接(或融合)至多肽的氨基末端并指引多肽进入细胞“分泌途径的肽。原肽可以在信号肽和多肽的氨基末端之间存在。术语“原肽”是同框连接(或融合)至具有生物活性的多肽的氨基末端的氨基酸序列,其中所得到的多肽已知为原酶或原多肽(或在某些情况下酶原)。原多肽一般无生物活性并且能通过自原多肽催化或自催化切割原肽而被转化为成熟的活性多肽。
如本文所用,术语“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸残基并且含有多于5个氨基酸残基的分子。所述氨基酸由单字母或三字母代码识别。本文所用的术语“蛋白质”与术语“多肽”是同义的并且也可以指两个或更多个多肽。因此,术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用。多肽可以被任选地修饰(如糖基化、磷酸化、酰基化、法呢基化、异戊二烯基化(prenylated)、磺化等)来添加功能性。表现活性的多肽可被称为酶。应当理解的是,由于遗传密码的简并性,可以产生编码给定多肽的诸多核苷酸序列。
所述多肽可以包含在组合物中。优选地,所述组合物富含这样的多肽。所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要的酶组分,例如单组分组合物。或者,所述组合物可以包含多种酶活性。所述多肽组合物可以根据本领域已知的方法制备,并且可以是液体形式或干的组合物形式。例如,所述多肽组合物可以是颗粒或微粒(microgranulate)的形式。将要包括在组合物中的多肽可以根据本领域已知的方法稳定。本发明的多肽组合物的剂量和所述组合物被使用的其他条件取决于所述组合物的最终用途。
术语“多肽片段”在本文被定义为从亲本多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或更多个氨基酸的多肽。
本发明的MM-氧化酶多肽可以是分离的形式或基本上纯的形式。
本文使用的术语“分离的多肽”是指从与其天然相关联的至少一种组分(例如其他多肽材料)移出的多肽。因此,如SDS-PAGE所测定,分离的多肽可以含有至多10%、至多8%、更优选至多6%、更优选至多5%、更优选至多4%、更优选至多3%、甚至更优选至多2%、甚至更优选至多1%以及最优选至多0.5%与其天然相关联的其他多肽材料。分离的多肽可以没有任何其他杂质。如SDS-PAGE或适合此目的且本领域技术人员已知的任何其他分析方法测定,分离的多肽可以是至少50%纯,例如至少60%纯、至少70%纯、至少75%纯、至少80%纯、至少85%纯、至少80%纯、至少90%纯或至少95%纯、96%纯、97%纯、98%纯、99%纯、99.5%纯、99.9%纯。
关于多肽,术语“基本上纯(substantially pure)”指含有至多50重量%的其他多肽材料的多肽制剂。本文所公开的多肽优选是基本上纯的形式。特别地,本文所公开的多肽优选是“实质上纯的形式(essentially pureform)”,即所述多肽制剂实质上不含有其他多肽材料。任选地,所述多肽也可以实质上不含例如核酸、脂质、培养基成分等非多肽材料。本文中,术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离的形式的多肽”是同义的。关于多核苷酸,术语“基本上纯的”是指含有至多50重量%的其他多核苷酸材料的多核苷酸制剂。本文所公开的多核苷酸优选是基本上纯的形式。特别地,本文所公开的多核苷酸优选是“实质上纯的形式”,即所述多核苷酸制剂实质上不含其他多核苷酸材料。任选地,所述多核苷酸也可以实质上不含例如多肽、脂质、培养基组分等非多核苷酸材料。本文中,术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”是同义的。
本发明的多肽可以是“天然存在的”。本文所用的术语“天然存在的”指的是以其在自然界的相关形式发生的过程、事件或事物。相比之下,“非天然存在的”指的是其存在或形式涉及人力的过程、事件或事物。一般地,关于多肽或核酸,术语“天然存在的”可以与术语“野生型”或“天然的”互换使用。其指的是多肽或编码多肽的核酸具有与自然界中发现的氨基酸序列或多核苷酸序列分别相同的氨基酸序列或多核苷酸序列。天然存在的多肽包括天然多肽,例如那些天然表达的多肽或在特定宿主中发现的多肽。天然存在的多核苷酸包括天然的多核苷酸,例如在特定宿主的基因组中天然发现的那些多核苷酸。此外,野生型序列或天然存在的序列可以指变体或合成的序列源自其的序列。
本发明还提供了编码本发明的多肽的多核苷酸。这样的多核苷酸可以选自由以下组成的组:
(a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多核苷酸序列有至少50%的序列同一性的多核苷酸序列的多核苷酸序列;
(b)由于遗传密码的简并性为(a)或(b)中任一项所定义的多核苷酸序列的简并体(degenerate)的多核苷酸序列;或
(c)为(a)、(b)或(c)所定义的核苷酸序列的反向互补体的多核苷酸序列。
这样的多核苷酸可与SEQ ID NO:1或3有至少60%、优选至少70%、更优选至少80%、最优选至少90%、最优选至少93%、最优选至少约95%、最优选至少约96%、最优选至少约97%、甚至最优选至少约98%和甚至更优选至少99%的序列同一性。
术语“反向互补体”与术语“互补链”和“互补体”可以互换使用。核酸链的反向互补体可以是编码链的反向互补体或非编码链的反向互补体。当指双链核酸时,编码多肽的核酸的反向互补体指编码氨基酸序列的链的反向互补链,或是指含有其的任何核酸分子。
与本发明的多核苷酸或核酸序列有关的术语“简并体”指的是包含一个或更多个简并密码子的核酸序列(相对于编码多肽的参考核酸分子)。简并密码子含有不同的核酸三联体,但编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三联体均编码Asp)。密码子简并性是指遗传密码允许核酸序列的变化但不会影响所编码的多肽的氨基酸序列的性质。本领域技术人员熟知由特定宿主细胞使用核酸密码子来描述给定的氨基酸时展示的“密码子偏好”。
本发明的多核苷酸可以是cDNA的形式。“cDNA”(互补DNA)在本文中被定义为能够通过由mRNA分子的反转录制备的DNA分子。在原核生物中,mRNA分子由细胞中存在的基因的基因组DNA的转录获得。在真核细胞中,基因含有外显子即编码序列和内含子即位于外显子之间的间隔序列(intervening sequences)。因此,在真核细胞中,由基因的基因组DNA转录获得的初始、一级RNA在呈现为mRNA之前通过一系列的步骤被加工。这些步骤包括通过称为剪接(splicing)的过程除去内含子序列。由mRNA衍生的cDNA仅含有编码序列并且可以直接被翻译为相应的多肽产物。
本发明的多核苷酸可以是“分离的”形式。“分离的多核苷酸”或“分离的核酸”是从与其天然相关联的其他多核苷酸移出的多核苷酸。因此,分离的多核苷酸可以含有至多10重量%、至多8重量%、更优选至多6重量%、更优选至多5重量%、更优选至多4重量%、更优选至多3重量%、甚至更优选至多2重量%、甚至更优选至多1重量%并且最优选至多0.5重量%的与其天然相关联的其他多核苷酸材料。所述分离的多核苷酸可以不含有任何其他杂质。所述分离的多核苷酸可以按重量计是至少50%纯,例如至少60%纯、至少70%纯、至少75%纯、至少80%纯、至少85%纯、至少90%纯、或至少95%纯、96%纯、97%纯、98%纯、99%纯、99.5%纯、99.9%纯。
本发明提供了包含本发明多核苷酸的核酸构建体。这样的核酸构建体可以是表达载体,其中本发明的多核苷酸序列可操作地连接到在宿主细胞中表达多核苷酸序列的至少一个控制序列。
术语“核酸构建体”在本文中指单链的或双链的核酸分子,其从天然存在的基因分离或被修饰来含有下述核酸区段,所述核酸区段以天然不会存在的方式组合和并置。当所述核酸构建体含有表达编码序列需要的全部控制序列时,术语核酸构建体与术语“表达盒”是同义的,其中所述控制序列可操作地连接至所述编码序列。
本文所用的术语“可操作地连接”指的是物理地连接并且彼此之间处于功能性关系的两个或更多个核酸序列元素。例如,如果启动子能够启动或者调节编码序列的转录或表达,则所述启动子可操作地连接到编码序列,在这种情况下,编码序列应理解为在启动子的“控制之下”。一般地,当两个核酸序列可操作地连接,它们将取向相同并且还通常在同一阅读框中。它们通常是实质上连续的,尽管这可能不是必需的。
术语“控制序列”与术语“调节表达核酸序列”可以互换使用。本文所用的术语是指在特定宿主生物体或体外的可操作地连接的编码序列的表达所必要的和/或影响在特定宿主生物体或体外的可操作地连接的编码序列的表达的核酸序列。当两个核酸序列是可操作地连接时,它们通常取向相同并且在相同的阅读框内。它们通常是实质上连续的,虽然这可能不是必需的。调节表达核酸序列(特别例如适合的转录起始、终止、启动子、前导物、信号肽、原肽、前原肽或增强子序列;Shine-Delgarno序列、阻遏子或激活子序列;有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号;稳定细胞质mRNA的序列;增强翻译效率的序列(例如核糖体结合位点);增强蛋白质稳定性的序列;以及当期望时,增强蛋白质分泌的序列)可以是在所选择的宿主生物体中显示活性的任何核酸序列并且可以源自对于宿主生物体是同源的或异源的编码蛋白质的基因。每个控制序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然的或外源的。当期望时,所述控制序列可以具有接头,目的在于引入促进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接的特异性限制位点。控制序列可以针对其特定目的而被优化。
本发明还提供了包含编码本发明多肽的多核苷酸的表达载体,所述多核苷酸可操作地连接到用于在体外或在多核苷酸的宿主细胞中表达和/或翻译的适当的控制序列(例如启动子,以及转录和翻译终止信号)。
本发明的表达载体可以是任何载体(例如,质粒或病毒),其可以方便地进行重组DNA步骤并且可以带来多核苷酸的表达。所述载体的选择通常依赖于载体与该载体被导入的细胞的相容性。所述载体可以是线性的或闭合的环状质粒。所述载体可以是自主复制型载体,即作为染色体外主体存在的载体,其复制其不依赖于染色体的复制,例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。
或者,载体可以是当导入宿主细胞时整合到基因组中并与其整合进入的染色体一起复制的载体。整合型克隆载体可以随机整合或在宿主细胞的染色体的预定靶基因座整合。
载体系统可以是单个载体或质粒,或两个或更多个载体或质粒,其共同含有将被导入到宿主细胞基因组的总的DNA,或转座子。
本发明的载体优选含有一个或更多个选择标记,其允许容易地选择被转化的细胞。选择标记是下述基因:所述基因允许选择用这样的基因转化的细胞并且提供抗生素或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等。选择标记可以作为表达盒在表达载体中被引入到细胞中,或在单独的表达载体上被引入。
优选的选择标记包括但不限于赋予对药物的抗性或弥补宿主细胞缺陷的那些。它们包括例如可以被用于转化大多数丝状真菌和酵母的通用标记基因,例如乙酰胺酶基因或cDNA(amdS、niaD、facA基因或来自A.nidulans,A.oryzae或A.niger的cDNA)或对像G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素、氨甲喋呤、腐草霉素提供抗性的基因或苯菌灵抗性基因(benA)。或者,可以使用特定的选择标记,例如需要相应突变体宿主菌株的营养缺陷型标记,例如URA3(来自S.cerevisiae或来自其他酵母的类似基因)、pyrG或pyrA(来自A.nidulans或A.niger)、argB(来自A.nidulans或A.niger)或trpC。在一个优选实施方案中,在引入表达构建体后选择标记从转化的宿主细胞中缺失以便获得没有选择标记基因的转化的宿主细胞。
其他标记包括ATP合成酶、亚基9(oliC)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶(pvrA)、细菌G418抗性基因(这也可在酵母中使用,但是不能在真菌中使用)、氨苄青霉素抗性基因(E.coli)、新霉素抗性基因(Bacillus)以及E.coliuidA基因,编码β-葡萄糖醛酸酶(GUS)。
术语选择标记涵盖用于筛选的标记基因,即一旦导入宿主细胞即赋予所述细胞可见的表型并且使所述细胞看起来不同的标记基因。用于筛选的标记实例是引起细胞在UV光下发出绿色光的绿色荧光蛋白的编码基因。
本发明还提供了包含本发明的多核苷酸或核酸构建体的宿主细胞。本文所定义的宿主细胞是适于遗传操作的生物体并且可以在用于目标产物的工业生产的细胞密度下培养的生物体。合适的生物体可以是微生物,例如可以被保持在发酵设备中的微生物。宿主细胞可以是在自然界发现的宿主细胞或在遗传操作或传统诱变后由亲本宿主细胞衍生的宿主细胞。
宿主细胞可以是原核宿主细胞、古细菌宿主细胞或真核宿主细胞。
原核宿主细胞可以是但不限于细菌宿主细胞。真核宿主细胞可以是但不限于酵母、真菌、变形虫、藻类、动物、昆虫宿主细胞。
真核宿主细胞可以是真菌宿主细胞。“真菌”包括Eumycotina亚门的所有种(Alexopoulos,C.J.,1962,In:Introductory Mycology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。术语真菌因此包括丝状真菌和酵母等。
“丝状真菌”在本文被定义为包括Eumycotina和Oomycota亚门的所有丝状形式的真核微生物(如Hawksworth等人,1995,同上所定义)。丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。通过菌丝延长进行营养生长并且碳代谢是专性需氧的。丝状真菌的菌株包括但不限于Acremonium、Aspergillus、Agaricus、Aureobasidium、Cryptococcus、Corynascus、Chrysosporium、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Monascus、Mucor、Myceliophthora、Mortierella、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Phanerochaete Podospora、Pycnoporus、Rhizopus、Schizophyllum、Sordaria、Talaromyces、Rasmsonia、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trametes和Trichoderma的菌株。可以用作宿主细胞的优选的丝状真菌菌株属于Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Aspergillus fumigatus、Penicillium chrysogenum、Penicillium citrinum、Acremonium chrysogenum、Trichoderma reesei、Rasamsonia emersonii(之前称为Talaromyces emersonii)、Aspergillussojae、Chrysosporium lucknowense、Myceliophtora thermophyla种。用于转化的和非转化细胞的发酵特征的比较的参考宿主细胞包括例如:Aspergillus niger CBS120.49、CBS 513.88,Aspergillus oryzaeATCC16868、ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892,Aspergillus fumigatusAF293(CBS101355),P.chrysogenum CBS 455.95,Penicillium citrinumATCC 38065,Penicillium chrysogenum P2,Acremonium chrysogenumATCC 36225、ATCC 48272,Trichoderma reesei ATCC 26921、ATCC56765、ATCC 26921,Aspergillus sojae ATCC11906,Chrysosporiumlucknowense ATCC44006以及所有这些菌株的衍生物。特别优选作为丝状真菌宿主细胞的是Aspergillus niger CBS 513.88及其衍生物。
真核宿主细胞可以是酵母细胞。优选的酵母宿主细胞可以选自下列属:Saccharomyces(例如S.cerevisia、S.bayanus、S.pastorianus、S.carlsbergensis),Kluyveromyces,Candida(例如C.revkaufi、C.pulcherrima、C.tropicalis、C.utilis),Pichia(例如P.pastoris),Schizosaccharomyces,Hansenula,Kloeckera,Schwanniomyces以及Yarrowia(例如Y.lipolytica(之前被归类为Candida lipolytica))。
原核宿主细胞可以是细菌宿主细胞。细菌宿主细胞可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。细菌的实例包括但不限于属于以下属的细菌:Bacillus(例如Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii、Bacillus coagulans、Bacillus firmus、B.halodurans、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus puntis、Bacillus pumilus、Bacillusstearothermophilus、Bacillus subtilis或Bacillus thuringiensis),Acinetobacter,Nocardia,Xanthobacter,Escherichia(例如E.coli(例如DH1OB、Stbl2、DH5-alpha、DB3、DB3.1菌株),DB4,DB5,JDP682和ccdA-over(例如美国申请号09/518,188)),TOP10F′,TOP10,DH10B,DH5a,HB101,W3110,BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS和Escherichiacoli K-12菌株,例如DH1,HB101,RV308,RR1,W3110,C600).Streptomyces(例如Streptomyces lividans或Streptomyces murinus)Erwinia,Klebsiella,Serratia(例如S.marcessans),Pseudomonas(例如P.aeruginosa),Salmonella(例如S.typhimurium、S.typhi)。细菌还包括但不限于光合细菌(例如绿色非硫细菌(例如Choroflexus细菌(例如C.aurantiacus),Chloronema(例如C.gigateum)),绿色硫细菌(例如Chlorobium bacteria(例如C.limicola),Pelodictyon(例如P.luteolum),紫色硫细菌(例如Chromatium(例如C.okenii))以及紫色非硫细菌(例如Rhodospirillum(例如R.rubrum),Rhodobacter(例如R.sphaeroides,R.capsulatus)以及Rhodomicrobium细菌(例如R.vanellii))。
宿主细胞可以是来自非微生物有机体的宿主细胞。这样的细胞的实例包括但不限于昆虫细胞(例如Drosophila(例如D.melanogaster),Spodoptera(例如S.frugiperda Sf9或Sf21细胞)和Trichoplusa(例如,High-Five细胞);线虫细胞(例如C.elegans细胞);禽类细胞;两栖动物细胞(如Xenopus laevis细胞);爬行动物细胞;和哺乳动物细胞(例如NIH3T3、293、CHO、COS、VERO、C127、BHK、Per-C6、Bowes黑素瘤和HeLa细胞)。
本发明进一步提供了生产本发明多肽的方法,包括:
(a)在有益于由宿主细胞生产所述多肽的条件下培养本发明的宿主细胞;以及,任选地
(b)回收所述多肽。
因此,本发明的多肽的过表达可以通过本领域公知的的方法来完成。适合用于本发明多肽的表达的原核细胞和真核细胞如上所述。
使用被选择的启动子以及与被设计表达的宿主细胞相容的其他表达调节信号来建立所需要的优选的宿主细胞中的过表达。在一个优选实施方案中,启动子序列可以由细菌来源,例如如上所述的Bacillus菌株或Escherichia菌株获得。
合适的启动子位点的实例包括Bacillus lentus碱性蛋白酶基因(aprH)的启动子、Bacillus licheniformis碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因)的启动子、Bacillus subtilis果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的启动子、Bacillus subtilis α-淀粉酶基因(amyF)的启动子、Bacillus licheniformis α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、Bacillus stearothermophilus产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、Bacillus amyloliquefaciens α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子。还有另一个实例是“-35”区域具有TTGACA序列和“-10”区域具有TATAAT序列的“共有(consensus)”启动子。以及另外地,Bacilluslicheniformis青霉素酶基因(penP)启动子和Bacillus subtilis xylA和xylB基因的启动子。
或者,E.coli可以用作宿主细胞。合适的载体是常常用于克隆和表达的载体并且本领域技术人员已知的载体,例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、1-PR或1-PL启动子。用于E.coli的表达的合适载体的实例例如在Makrides,S.C.,Microbiological Reviews,Vol.60,No.3,(1996),512-538的表1中给出。优选地,所述载体含有克隆位点上游的启动子,所述克隆位点含有编码MM-氧化酶的核酸序列,其可以在宿主已经被培养表达具有MM-氧化酶活性的相应多肽之后开启。可被开启和关闭的启动子是本领域技术人员已知的并且例如是lac启动子、araBAD启动子、T7启动子、trc启动子、tac启动子和trp启动子。在本发明的框架内特别有用的例如是WO00/66751描述的载体,例如没有插入的青霉素G酰化酶基因的pKAFssECtrp或pKAFssECaro。
所述载体的选择有时可取决于宿主的选择,反之亦然。如果例如使用具有araBAD启动子的载体,无法分解阿拉伯糖诱导物(ara-)的E.coli宿主菌株是强烈优选的。
编码MM-氧化酶的核酸序列可以整合到宿主细胞的基因组中,其常常不含有本发明的核酸序列并且被(过)表达。这可以根据本领域技术人员已知的方法来完成。
本发明的MM-氧化酶的表达可以通过培养如本文所述的宿主细胞来进行。发酵后,可以通过离心或过滤收获宿主细胞。然后通过公知的方法将细胞重悬浮和裂解,例如用溶菌酶孵育或使用法式压滤(Frenchpresss)。如果宿主细胞使用E.coli,所述细胞可以优选地通过冷冻细胞然后用溶菌酶处理来裂解。
裂解的细胞物质然后再次过滤或离心来获得溶解于滤液或上清液的MM-氧化酶。如果需要的话,可以通过任何合适的色谱法例如关于MM-氧化酶的现有科学文献中描述的选择沉淀或色谱法对MM-氧化酶进行纯化。
因此,本发明涉及组合物,例如口部组合物,其包含本发明的多肽和至少一种另外的成分。
本发明的口部组合物(其包含任何MM-氧化酶,例如本发明的多肽)可以是使得其可以被施用到口腔的任何合适的形式。通常,本发明的口部组合物可以是液体或固体组合物。
如本文所用的术语“液体制剂”是指制剂,即根据配方的两种或更多种组分的混合物,其在大气压下在至少约2℃或更高的温度下是液体。所述液体制剂可以含有水或有机液体或它们的混合物。有机液体在此被定义为有机物质或两种或更多种有机物质的混合物,所述有机物质在大气压下在至少2℃或更高的温度下是液体。有机物质是由含有碳的分子制成的。所述液体制剂可以通过加入一种或更多种稳定剂来稳定以产生稳定的液体制剂。稳定的液体制剂是,在特定条件下储存时,其中包含的活性成分实质上保留了它们的化学、物理和/或生物活性的液体制剂。例如,稳定的液体制剂在冷藏温度(2-8℃)下可以稳定至少12个月,优选地2年,更优选地3年;或者在室温(23-27℃)下可以稳定至少3个月,优选地6个月,并且更优选地1年。
术语“固体制剂”是指下述制剂,即根据配方的两种或更多种组分的混合物,其为固体状态而不是液体或气体。所述固体制剂在100℃或更低的温度下优选是固体状态。液体、分散液(dispersions)和溶液不属于该词的含义范围。此外,半固体例如凝胶、软膏、膏剂和霜剂也不属于该词的含义范围。所涵盖的固体制剂的代表性实例包括胶囊、片剂、丸剂、颗粒和粉剂。
其中可掺入MM-氧化酶例如本发明的多肽来提供具有控制呼气臭味的能力的组合物的本发明的固体口部组合物包括例如口香糖(例如压缩的口香糖),糖果(例如硬糖(hard boiled candy)、慢煮糖(low boiled candy)和咀嚼糖(chewy candies)),宠物咀嚼物或饼干,牛轧糖(nougats),巧克力,太妃糖,糖衣丸(dragees),焦糖,锭剂(lozenges),润喉糖(throat drop),压制片诸如压制薄荷糖(pressed mint),胶囊,可食性膜,坚果,泡沫剂,洁齿剂例如牙膏、牙粉和它们的组合。
本发明的液体组合物可以是漱口水(mouthrinse)/漱口剂(mouthwash)或口喷雾例如或糖浆。
口香糖是任何类型的胶状物,所述胶状物例如由糖胶树胶,一种天然胶乳产物,或例如已知为聚异丁烯的合成橡胶制成。
牙膏是膏剂或凝胶状洁齿剂,通常与作为配件的牙刷一起使用以清洁和维护牙齿美观和健康。
漱口剂或漱口水是任何用来增强口部卫生的液体产品,其通常通过漱口然后吐出而使用。
一般而言,本发明的口部组合物可以通过本领域的普通技术人员已知的任何手段或方法来制备。然而,口部组合物通常通过以下方法制备,所述方法包括将MM-氧化酶与口部组合物的一种或更多种组分接触来形成混合物。
例如,所述方法通常包括将所述酶例如以包封的形式放置在含有口部组合物的一种或更多种组分的容器中,或者除包封的酶外已完成的口部组合物(即包封的酶最后加入)。一般地,所述方法还包括将组分的混合物形成用于口部消耗的合适的形状。
虽然MM-氧化酶能够氧化存在的甲烷硫醇的氧化中形成的H2S(如原文所述),所述酶也可以与已知结合H2S的化学物质例如锌盐,特别是有机锌盐组合。适合以该方式使用的有机锌盐包括抗坏血酸锌、乙酸氢锌、乳酸锌、柠檬酸锌、葡萄糖酸锌和它们的组合。
此外,可以配制组合物来增加口中的停留时间。例如,WO2007/143989公开了包含疏水酶制剂的口香糖,所述疏水酶制剂减少酶从口香糖的释放使得酶在口中的停留时间增加。
也可配制组合物来含有下述化合物,所述化合物调节口的pH至对MM-氧化酶最佳的pH。
口部组合物可以是包含MM-氧化酶的洁齿剂的形式。含酶的洁齿剂组合物是本领域技术人员公知的。例如US4,150,113和美国专利号4,178,362分别公开了酶性牙膏和含有葡萄糖氧化酶的酶性可咀嚼洁齿剂。另一些含酶的洁齿剂被公开在例如US 4,537,764、U.S.4,578,365、US 4,564,519、US 5,176,899、US 4,564,519和US 4,578,265中。这些文件详细描述了酶至洁齿剂例如牙膏的配制,并可以应用于MM-氧化酶至洁齿剂组合物的配制。
本发明的口部组合物可以是口香糖的形式,所述口香糖可包含:
不溶于水的基质;
水溶性部分;
挥发性硫化合物呼气臭味控制量的甲基硫醇氧化酶;以及任选地甜味剂和/或调味剂。
这样的口香糖中的MM-氧化酶可以包含在多种不同的口香糖组合物中。所述口香糖可以是许多不同的结构。例如,口香糖可以是单件,例如棒、板或其他单元性结构(unitary structure)。
另一方面,口香糖可以包含外包衣(over-coated)制剂。
在这方面,如果期望,MM-氧化酶可以位于基本上包裹胶质中心的包衣内或壳内。在一个实施方案中,所述包衣可以包含约40%至约75%的口香糖组合物。除了MM-氧化酶,所述包衣可以包括掩蔽剂来改进含有MM-氧化酶的包衣的味道。
多种掩蔽剂均可使用,包括:三氯蔗糖、葡萄糖酸锌、乙基麦芽酚、甘氨酸、安赛蜜-k、阿斯巴甜、糖精、果糖、木糖醇、喷雾干燥的甘草根、甘草甜素、葡萄糖、葡糖酸钠、葡糖酸-δ-内酯、乙基香草醛、香草醛、普通和高强度甜味剂以及多种适当的调味剂。可以使用足量的掩蔽剂来掩盖MM-氧化酶酶制剂的味道。如期望,可以使用多于一种掩蔽剂。
可以使用多种方法制作包衣的口香糖。例如,所述包衣可以以三阶段操作被应用至口香糖中心。
在第一阶段,交替施用的糖浆和粉末的粗包衣被施用到中心。这之后是称为磨光包衣(finishing coating)的第二阶段,其中使用细粉和较长的滚光(tumbling)来产生光滑的磨光。最后,进行以虫胶处理和抛光的第三阶段,从而提供光泽度高的光滑磨光。如期望,可以省去第二阶段和第三阶段。包衣可以围绕如下所述的多种不同类型的胶质中心组合物。
在本发明的另一个实施方案中,可压缩的赋形剂被制成片剂然后用包含MM-氧化酶的口香糖产物包被。通过举例的方式但非限制,所述制成片剂的赋形剂可以包括葡萄糖、蔗糖或其他糖类,山梨糖醇,甘露糖醇,异麦芽糖醇,其他可压缩的糖醇或它们的组合。所述制成片剂的可压缩的赋形剂基本上由胶的包衣包围。所述包衣包含MM-氧化酶,并且在一个实施方案中,包含至少50重量%的产物。此外,所述涂层可以包含掩蔽剂和口香糖。
现在涉及本发明的口香糖,口香糖可以优选是低水分的,含糖的或无糖的,含蜡的或无蜡的,低热量的(通过高基(high base)或低热量增量剂)和/或可含有其他牙科剂和/或药剂。
一般地,口香糖通常包括水溶性增量部分、不溶于水的可咀嚼胶质基质部分以及任选地调味剂和/或甜味剂。在咀嚼过程中水溶性部分随着调味剂经时间消散。所述胶质基质部分在整个咀嚼过程中保留在口中。术语口香糖指一般意义上的口香糖和泡泡糖。
不溶性胶质基质通常包括弹性体、树脂、脂肪和油、软化剂和无机填料。胶质基质可以包含或不包含蜡。不溶性胶质基质可以构成口香糖的约5重量%至约95重量%,更常见地,胶质基质构成10重量%至约50重量%的胶,并且在一些优选的实施方案中,约15重量%至约35重量%的口香糖。
本发明的口香糖胶质基质可以含有约20重量%至约60重量%的合成弹性体,约0重量%至约30重量%的天然弹性体,约5重量%至约55重量%的弹性体增塑剂,约4重量%至约35重量%的填料,约5重量%至约35重量%的软化剂以及任选的少量(约1重量%或更少)的杂项成分例如着色剂、抗氧化剂等。
弹性体提供胶的弹性、粘性,其根据成分的化学结构以及其与其他成分如何复合而不同。合成的弹性体可以包括但不限于聚异丁烯、异丁烯-异戊二烯共聚物(丁基橡胶)、苯乙烯-丁二烯、具有约1∶3至约3∶1比例的苯乙烯-丁二烯的共聚物、聚乙酸乙烯酯、具有共聚物的约5重量%至约50重量%的月桂酸乙烯酯含量的乙酸乙烯酯月桂酸乙烯酯共聚物,以及它们的组合。
天然弹性体可以包括天然橡胶,例如烟熏乳胶或液体乳胶和银胶菊,以及天然胶例如节路顿胶(ielutong)、乐驰卡斯皮胶(lechi caspi)、紫苏胶(perillo)、索马胶(sorva)、二齿铁线子胶(massaranduba balata)、巧克力铁线子(massaranduba chocolate)、佩罗胶(nispero)、rosindinha、糖胶树胶(chicle)、古塔胶(gutta hang kang)以及它们的组合。优选的合成弹性体和天然弹性体浓度根据其中使用了基质的口香糖是粘性的或常规的,泡泡胶或常规胶与否而不同。优选的天然弹性体包括节路顿胶、糖胶树胶、索马胶和二齿铁线子胶。
弹性体增塑剂可以包括但不限于,松香酯例如松香的甘油酯、松香的甲基酯、松香的季戊四醇酯;由α-蒎烯,β-蒎烯和/或d-柠檬烯衍生的萜烯树脂;以及前述的任何合适的组合。所述树脂增粘剂调节最终胶的粘结性(cohesiveness)和粘性(tackiness)。优选的弹性体增塑剂还根据特定的应用以及所使用的弹性体的类型而变化。
填充剂/调质剂(texturizer)可以包括碳酸镁和碳酸钙,石灰石粉,硅酸类例如硅酸镁和硅酸铝,粘土,氧化铝,滑石,氧化钛,单磷酸钙、二磷酸钙和三磷酸钙,纤维素聚合物例如木材和它们的组合。填料修饰胶质基质的质地。填料也可以是有机的粉末,例如聚乙烯、燕麦纤维、木纤维、苹果纤维、玉米醇溶蛋白、谷蛋白、麦醇溶蛋白、酪蛋白等。MM-氧化酶粉末可以在制备基质时作为填料被加入来达到可导致MM-氧化酶的更长释放的更好的包封。
软化剂/乳化剂可以包括动物脂,氢化动物脂,氢化和部分氢化的植物油,可可脂,单硬脂酸甘油酯,三乙酸甘油酯,卵磷脂,来自棉籽、大豆、棕榈、棕榈仁、椰子和红花来源的非氢化的、部分氢化的和完全氢化的单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯,以及其他的中链甘油三酯,乙酰化甘油单酯,脂肪酸(例如硬脂酸、棕榈酸(plasmatic acid)、油酸和亚油酸)以及它们的组合。
这样的软化剂/乳化剂通过在咀嚼过程中引入急剧的溶化转变(sharp melting transitions)修饰胶质基质的质地。
着色剂和增白剂可以包括FD&C型染料和色淀、水果和蔬菜提取物、二氧化钛以及它们的组合。口香糖配制过程着色剂赋予特征并去除或掩盖不期望的特征。
胶质基质可以包含或不包含蜡。无蜡胶质基质的实例在美国专利号5,286,500中公开,其公开的内容在此通过引用并入。蜡辅助胶质基质的固化并改进货架期和最终胶产品的质地。蜡晶还改进风味从最终产品中的释放。
这样的胶质基质通常通过向具有约10℃至约115℃的温度的预加热的Sigma叶片式混合器添加一定量的弹性体、树脂增粘剂或柔软剂以及填料来制备。构成不溶性胶质基质的初始质量的成分的初始量可以通过混合釜的工作容量来确定以便获得适当的稠度,以及通过分解和软化弹性体所期望的复合程度来确定。复合的时期越长以及胶质基质成分的分子量或软化点越低会导致最终胶质基质的粘度和硬度越低。
除了不溶于水的胶质基质部分,通常口香糖组合物包括水溶性增量部分,所述水溶性增量部分可以任选地含有一种或更多种调味剂和/或甜味剂。
因此,水溶性部分可以包括增量甜味剂、高强度甜味剂、调味剂、软化剂、乳化剂、色素、酸化剂、填料、抗氧化剂、药物以及提供期望属性的其他组分。
软化剂被添加到口香糖中来优化胶的咀嚼性和口感。软化剂也被称为增塑剂和塑化剂,一般构成口香糖的约0.5重量%至约25重量%。所述软化剂可以包括甘油、卵磷脂以及它们的组合。例如含有山梨糖醇、氢化淀粉水解产物、玉米糖浆以及它们的组合的水性甜味剂溶液也可以被用作口香糖中的软化剂和结合剂。
增量甜味剂包括糖组分和无糖组分。增量甜味剂一般构成口香糖的约5重量%至约95重量%,更通常地胶的约20重量%至约80重量%,更常见地,胶的约30重量%至约60重量%。糖甜味剂一般包括口香糖技术领域中公知的含糖组分,包括但不限于蔗糖,葡萄糖,麦芽糖,糊精,干燥的转化糖,果糖,左旋糖,半乳糖,玉米糖浆固体等,单独使用或组合使用。无糖甜味剂包括但不限于糖醇,如山梨糖醇,甘露糖醇,木糖醇,氢化淀粉水解产物,麦芽糖醇等,单独或组合使用。
也可以单独使用或与上述组合使用高强度人造甜味剂。优选的甜味剂包括但不限于三氯蔗糖,阿斯巴甜,安赛蜜的盐,阿力甜(altitame),糖精及其盐,环拉酸及其盐,甘草酸酯/盐(glycerrhizinate),二氢查耳酮,奇异果甜蛋白,应乐果甜蛋白等,单独或组合使用。这些甜味剂在口香糖制剂中的范围通常可以为约0.02至约0.10重量%的阿力甜、奇异果甜蛋白和二氢查耳酮,以及约0.1至约0.2重量%的阿斯巴甜,三氯蔗糖,安赛蜜和糖精。
为了提供更持久的甜味和风味的感官,可期望包封或以其他方式控制至少一部分的人造甜味剂的释放。可以使用例如湿法造粒,蜡造粒,喷雾干燥,喷雾激冷,流化床包衣,凝聚法和纤维伸展法的技术来获得所期望的释放特征。
可以在口香糖中使用糖甜味剂和/或无糖甜味剂的组合。此外,软化剂也可以提供另外的甜度例如用水性糖或糖醛溶液。
如果期望低热量的胶,可以使用低热量增量剂。低热量增量剂的实例包括但不限于:聚葡萄糖;Raftilose、Raftilin;低聚果糖(NutraFlora);帕拉金糖;瓜尔豆胶水解产物(Sun Fiber);或不易消化的糊精(Fibersol)。但是,也可以使用其他的低热量增量剂。
如期望,可以使用多种调味剂。像着色剂的调味剂在赋予口香糖组合物特征和去除或掩盖不期望的特征方面是有用的。通过这样的方式,调味剂增加了本发明的口香糖组合物在口腔的接触时间。通过这样的方式,口香糖组合物增强了MM-氧化酶组分的可用性,并通过将酶逐渐从口香糖组合物中释放延长了酶促效果。
调味剂可以以胶的约0.1重量%至约15重量%,优选地约0.2重量%至约5重量%的量使用。调味剂可以包括精油、合成调味剂或其混合物,包括但不限于,由植物和水果衍生的油,例如柑桔油、水果香精(fruitessences)、胡椒薄荷油、留兰香油、其他薄荷油、丁香油、冬青油、茴香等。也可使用人造调味剂和调味组分。天然调味剂和人造调味剂例如可可粉和热改性的氨基酸可以作为本发明的调味剂,并且可以以任何感觉上可接受的方式进行组合。
调味剂也可包括清凉剂来增强产品的风味和被感知的呼气清新。除了薄荷醇之外,清凉剂可以包括例如乙基-对薄荷烷甲酰胺、N-2,3-三甲基-2-异丙基丁酰胺、薄荷基戊二酸酯、薄荷基琥珀酸酯、薄荷醇PG碳酸酯、薄荷醇EG碳酸酯、薄荷基乳酸酯、薄荷酮甘油缩酮、薄荷醇甘油醚、N-叔丁基-对-薄荷烷-3-甲酰胺、对-薄荷烷-3-羧酸甘油酯、甲基-2-异丙基-二环(2.2.1)、庚烷-2-甲酰胺、薄荷醇甲醚及它们的组合。本发明的口香糖也可以任选地包括其他呼气清新成分或抗微生物成分,包括抗微生物精油和调味剂组分,例如也可以使用胡椒薄荷、甲基水杨酸酯、百里酚、桉油醇、肉桂醛、聚磷酸酯、焦磷酸酯以及它们的组合。
本发明的口香糖组合物可以用口香糖领域已知的制造程序制备。一般地,口香糖通过将多种口香糖成分依次加到本领域已知的市售混合器中制造。
MM-氧化酶一般可以在制造过程期间的任何时间加入,但优选在接近混合结束时加入来最小化酶在可能使酶变性的热量中的暴露。在初始成分充分混合后,将胶质物质从混合器中排出并塑造成所期望的形式,例如通过卷成片并切成条,挤压成块或铸成丸或球,然后其可被包衣或淘洗(panned)。
一般地,所述成分通过首先将胶质基质熔化并加入到运行的混合器中混合。基质也可以在混合器本身中熔化。色素或乳化剂也可以在此时加入。例如甘油的软化剂也可以在此时与糖浆和一部分增量剂/甜味剂一同加入。
增量剂/甜味剂的其他部分然后可以随后添加到混合器中。调味剂通常与最后部分的增量剂/甜味剂一起加入。高强度的甜味剂优选在最后部分的增量剂/甜味剂和调味剂被添加之后加入。
整个混合程序通常进行五至十五分钟,但有时可需要更长的混合时间。本领域技术人员将意识到可以使用上述程序的许多变型。
在本发明的口香糖组合物的制造中,特别地,MM-氧化酶与胶质基质、甜味剂或甜味剂混合物以及调味剂混合。优选地,尽可能迟地将所述MM-氧化酶加入混合物。使用MM-氧化酶的量越小,越有必要预混合该特定成分以使得在这批胶中均匀分布。
无论是否使用预混合,MM-氧化酶优选尽可能迟地加入混合(来最小化热暴露)。因为本发明的口香糖组合物含有不溶于水的基质,其增强药物从组合物向口腔的逐步释放或控制释放。因此,当本发明的口香糖组合物被咀嚼时,MM-氧化酶成分连同任何甜味剂和调味剂会在咀嚼过程中逐步消散。
再次,这样的逐步释放增强了对于口腔的可获得性(availability)。
水活度是物质中水的相对可获得性。它在本领域中被定义为水的蒸气压除以纯水在相同温度的蒸汽压。因此,纯蒸馏水具有恰好为1的水活度。水活度不同于食物产品中的水分含量(%水)。水分含量是总的水分,也就是说,样品中结合的水加游离的水的量,而水活度仅测量游离的水分并且常常表示为aw或平衡相对湿度百分比(%ERH)。食物产品的水活度是当所述食物产品和周围空气之间建立平衡时食物产品直接邻接区域的空气的恒定相对湿度。该恒定相对湿度如果用百分数(0至100%)表示,则被称为“%ERH”,或者如果用0和1.0之间的值表示则称为“水活度”。用于测定水分活度的方法在AOAC International(1995),Method 978.18的官方分析方法中有详细描述。本发明的成品应具有低于约0.80,优选低于约0.70,更优选低于约0.60的水活度,并应以隔绝水分的方式被包装。
与胶质基质混合之前,本发明的MM-氧化酶组分可以先研磨成细颗粒来形成粉末。MM-氧化酶组分的粒径优选为约0.1微米至约200微米的直径,更优选为约1微米至约50微米的直径。
此外,在MM-氧化酶粉末与胶质基质混合之前,细粉末可以被悬浮在液体或液体混合物中,其优选为不溶于水的。这样做是为了使药物容易掺入胶质基质,并增强其在整个口香糖组合物中的均匀分布。适合用于本发明的液体或液体混合物的实例包括但不限于醇、食用油、甘油、乙二醇、丙二醇、三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯、椰子油的乙酰化单甘油酯及它们的组合,和其他类似的材料。
MM-氧化酶粉末可以与熔融的或软化的胶质基质直接混合,或者可以与胶质基质成分例如聚乙酸乙烯酯、松香酯、聚萜烯、蜡、脂肪等预混合
通过提供可以掺入MM-氧化酶的逐步释放的剂型,本发明的口香糖组合物具有优势,因为更大量的酶可用来在延长的时间产生有益效果。
为了保持成品的生产和随后的存储过程中的酶活性,应防止高温和长时间暴露于高水活度。因此,活性酶不应该加入到用来制备咀嚼型组合物的成分混合中,直到该组合物冷却下来并达到进一步处理(例如将物质切成合适的食用大小(serving sizes))所需要的最低可能温度。如果活性酶不是应用在可咀嚼的物质中而是之后应用的包衣中,应遵循类似的方法。另外,在后者的情况下加热应保持在最低程度。通常地,在水性环境中加热不应超过约30分钟的时间,优选不超过约20分钟,更优选不超过约10分钟,甚至更优选不超过约5分钟,并且温度通常可保持在低于约60℃,优选低于约50℃,例如低于约40℃,甚至更优选低于约30℃。
本发明中使用的MM的氧化酶由于缺乏稳定性,尤其缺乏用于高温处理(例如,挤出胶工艺)的热稳定性,其在口部组合物中可能不是最佳地有效。
因此,含有包衣或包封的MM-氧化酶的口部组合物在控制呼气臭味方面可以是有效的,并且可以在低温、水分含量低的组合物例如压缩薄荷和胶制剂以及其他类型的固体口部制剂中使用。
包衣或包封的MM-氧化酶相比未包衣或非包封的蛋白酶控制呼气臭味可更有效,同时也表现出改进的稳定性和相容性。更特别地,在通常用于制备MM-氧化酶为其中一部分的粒状和/或水分含量低的口部组合物的条件下,包衣或包封的MM-氧化酶可以表现出改进的稳定性以及改进的与所述条件相容性。
因此,包衣的或包封的MM-氧化酶可以掺入到相对温和条件下制备的口部组合物中,所述温和条件限制或防止酶的变性。特别地,包封的MM-氧化酶可以掺入到口部组合物中,所述口部组合物的制备方式使得所述口部组合物的一种或更多种成分的混合物的温度在引入包封的酶之前和/或之后足够低,使得如果没有防止的情况下的酶的变性基本上被限制。
此外,包封的MM-氧化酶的制备方式可以使得其中的水分含量足够低来用于所期望的口部组合物。通常地,包封的酶的水分含量小于约6重量%、小于约4重量%、小于约2重量%或甚至小于约1重量%。例如,在包封的酶是通过喷雾干燥制备的某些实施方案中,包封的酶的水分含量可为约1.5重量%。
在这方面,要注意的是:用于给定的口部组合物和包封的酶的工艺条件(如温度、pH值、水分等)将至少部分地是将被使用的酶和酶将被掺入的口部组合物的所期望的水分含量的函数。因此,可以使用本领域中已知的手段来确定包封的酶和口部组合物(例如口部组合物组分,工艺条件等)的可接受的组合。
根据本发明,MM-氧化酶可以使用本领域公知的一种或更多种包衣方法或包封方法在单步法或者多步法中被包衣(即被包封)。
特别地,为了获得具有改进的处理能力、释放特性、感官特性和/或稳定性的包衣的酶,MM-氧化酶可以使用本领域公知并且如本文进一步详细描述的方法和包衣来包衣。适合用于本发明并且可以单独使用或组合使用的本领域已知的包衣或包封方法包括例如喷雾干燥、喷雾冷却、喷雾激冷、冷冻干燥(即冻干)、挤出工艺、凝聚法、分子包合、流化床包衣、成粒、聚结、轧辊压制以及将酶吸附到支持物。包衣或包封酶的方法是本领域公知的,并且被描述在WO2007/140286中。
应该理解,在本文中所称的包封的或包衣的蛋白酶一般是指酶至少部分被包衣组合物(例如包封剂)所包衣或包封。在一个特别的实施方案中,基本上所有的酶表面被包封剂所包衣。就此而言,应该进一步指出,在酶没有被包衣组合物或包封剂完全包衣或包封的那些实施方案中,酶的一部分未包衣的表面可以与口部组合物的其它成分或组分直接接触,包括例如口香糖组合物的胶基质。在这样的情况下,应该理解,根据本发明,酶的未包衣表面与口部组合物的其它成分或组分之间的这种相互作用或接触不代表“包封”。
还应该指出,除了活性之外,还可以控制包衣或包封方法和/或其中使用的步骤或条件以优化所获得的包封的或包衣的酶的大小和/或控制其释放。因此,包衣的或包封的酶的粒径可以例如被优化以用于口香糖组合物。
然而,通常包衣或包封的MM-氧化酶的粒径可以为至少约10微米、至少约20微米或至少约30微米。在多种实施方案中,包括例如其中包封的酶是通过喷雾干燥制备的那些实施方案,所述包封的酶的大部分(例如至少约90重量%,或从95重量%至100重量%)显示了小于约250微米、小于约200微米、小于约150微米或小于约100微米的粒径。通常,包封的蛋白酶显示出小于约60微米、小于约50微米或小于约40微米的粒径,尺寸例如落在约10微米至60微米、约20微米至约50微米,或约30微米至约40微米的范围。但应再次进一步注意,粒径可以不是本文提到的那些而并不背离本发明的范围。
一般地,不论制备包封的酶用了何种方法,所述包封的酶可以通常具有至少约5重量%、至少约10重量%、至少约15重量%、至少约20重量%、至少约30重量%、至少约40重量%、至少约50重量%、至少约75重量%、至少约85重量%、至少约95%重量或更多(的包封的MM-氧化酶)的酶浓度或载量,载量例如为约5重量%至约95重量%、约10重量%至约85重量%、约10重量%至约50重量%、约15重量%至约50重量%、约25重量%至约40重量%或约20重量%至约40重量%(的包封的MM-氧化酶)。
在活性方面,本发明的口部组合物中存在的MM-氧化酶的量是这样的量,使用0-5的尺度(施用到对象),所述量使得所述口部组合物能够降低感官评分至约1或以下。或者,本发明的口部组合物中存在的MM-氧化酶的量是可以减少VSC例如MM的水平至每十亿约110份或以下(用便携式硫化物监测器()测定)的量-同样也是施用到对象。感官评分和便携式硫化物监测器的使用描述于Tangerman和Winkel(J Clin.Perodontol.34,748-755,2007)。
或者,在活性方面,本发明的口部组合物中存在的MM-氧化酶的量是在本发明的口部组合物被施用到对象之后能够减少VSC例如MM的水平至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少90%、至少约95%或至少约99%的量。
可以在口部组合物被施用到对象例如口部腔室约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时或更长的时间之后测定感官评分、VSC减少的VSC量。
根据前述权利要求中任意一项的口部组合物不包含抗菌组分。也就是说,本发明的口部组合物通常可以不包含具有抗菌活性的组分。
本发明还涉及用于控制呼气臭味的方法。控制呼气臭味表示呼气臭味例如口呼气臭味将得到改进。通常这将是一种或更多种VSC特别是甲基硫醇减少的结果。所述减少可以在感官上或化学上是明显的。
通过这样的方法,在本发明的口部组合物被施用到口腔之后,呼气例如口呼气中的一种或更多种VSCs例如甲基硫醇的量可以被减少至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少90%、至少约95%或至少约99%。可以在所述口部组合物被施用到口腔例如约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时或更长时间之后测定MM的这样的减少。在施用后更短的时间在VSC减小方面具有更大效果的口部组合物是优选的。
通常,使用0-5的数值范围感官评分被减少至约1或以下,和/或用便携式硫化物监测器()测定的VSC例如MM的水平被减少至每十亿约110份或以下。
这样的方法包括:
提供如本文所述的口部组合物;以及
将所述组合物施用到口腔中。
因此,本发明提供了施用于对象例如施用于人体或动物体,特别是施用于对象例如人类或非人类动物的口腔的口部组合物。本发明还提供了控制对象的口气的方法,所述方法包括向对象施用有效量的本发明口部组合物,通常施用到口腔的步骤。对有需要的对象可以给予有效量的本发明的组合物。
其中所述组合物是口香糖,所述方法可以包括咀嚼口香糖来使甲基硫醇氧化酶从口香糖释放到口腔中。
因此,本发明提供了如本文所述的用于控制呼气臭味的口部组合物。
本发明还提供了本文所述的口部组合物用于制备用于控制呼气臭味的药物的用途。
造成口臭的最主要原因的VSCs也可潜在地损害口组织,并且可以导致牙周炎(牙龈和支撑牙齿的韧带的炎症)。因此,本发明提供了包含治疗牙周炎或牙龈炎的甲基硫醇氧化酶的口部组合物。因此,本发明提供了施用于对象例如施用于人体或动物体,特别是施用于对象例如人类或非人类动物的口腔的口部组合物。本发明还提供了治疗对象的牙周炎或牙龈炎的方法,所述方法包括向对象施用有效量的本发明的口部组合物,通常施用到口腔的步骤。对有需要的对象可以给予有效量的本发明的组合物。
术语“序列同一性”或“序列同源性”在本文可互换使用。就本发明的目的而言,在本文中定义,为了测定两条氨基酸序列或两条核酸序列的序列同源性或序列同一性的百分比,所述序列就最佳比较的目的被比对。为了优化两条序列之间的比对,可以向被比较的两条序列中的任意条中引入缺口。此类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者,比对可以在更短长度上,例如在约20、约50、约100或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。序列同一性是在报告的被比对区域上两条序列之间相同匹配的百分比。
对两条序列之间序列的比较和序列同一性百分比的测定可以使用数学算法完成。技术人员应当明白下述事实:可获得若干种不同的计算机程序以比对两条序列并测定两条序列之间的同一性(Kruskal,J.B.(1983)Anoverview of sequence comparison In D.Sankoffand J.B.Kruskal,(ed.),Timewarps,string edits and macromolecules:the theoryand practice of sequencecomparison,pp.1-44Addison Wesley)。可以使用用于比对两条序列的Needleman和Wunsch算法来测定两条氨基酸序列或两条核苷酸序列之间的序列同一性百分比(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。算法可以比对氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已经被整合进计算机程序NEEDLE中。就本发明的目的而言,使用来自EMBOSS包(2.8.0或更高版本,EMBOSS:The EuropeanMolecularBiology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,1.andBleasby,A.Trends inGeneticsl6,(6)pp276-277,http://emboss,bioinformatics,nl/)的NEEDLE程序。对蛋白质序列而言,对取代矩阵使用EBLOSUM62。对核苷酸序列而言,使用EDNAFULL。使用的任选参数是10的缺口开放罚分和0.5的缺口延伸罚分。技术人员应当明白,所有这些不同的参数会产生轻微不同的结果,但是使用不同算法时两条序列的总体同一性百分比不会显著改变。
通过上述程序NEEDLE比对后,如下计算查询序列和本发明序列之间的序列同一性百分比:用两条序列中展示相同氨基酸或相同核苷酸的比对中相应位置的数量除以比对总长度,所述比对总长度减去了比对中的缺口总数。本文定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得,并且在程序输出中被标记为“最长同一性”。
本发明的核酸和蛋白质序列还可以被用作“查询序列”以针对公开数据库进行搜索,以例如鉴定其它家族成员或相关序列。这类搜索可以使用Altschul等人(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。可以使用NBLAST程序(计分=100,字长=20)进行BLAST核苷酸搜索,以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(计分=50,字长=3)进行BLAST蛋白质搜索,以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得加缺口的比对用于比较的目的,可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述使用加缺口BLAST。使用BLAST和加缺口BLAST程序时,可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见国立生物信息中心(Nataional Center for Biotechniology Information)的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
本文中提及的作为现有技术给出的专利文献或其他材料不应被理解为承认该文件或材料是已知的或承认其含有的信息是任何权利要求的优先权日之前的公知常识。
本文所列的每个参考文献的公开内容在此以引入的方式将其全部内容并入。
本发明通过下面的实施例进一步说明。
实施例
分子生物学技术
本领域技术人员已知的分子生物学技术如Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,CSHL Press,Cold SpringHarbor,NY,2001所示来进行。
菌株
Hyphomicrobium EG:该菌株以保藏号NCCB 84101保藏于CBS研究所。
Thiobacillus thioparus TK-m:该菌株以保藏号DSM 5368保藏在DSMZ。
Rhodococcus rhodochrous IGTS8:该菌株以保藏号ATCC 53968保藏于ATCC。
Escherichia coli菌株RV308以保藏号ATCC31608保藏于ATCC。
B.subtilis菌株BS154:该菌株以保藏号CBS 363.94保藏于CBS研究所。
LC-MS/MS(液相色谱-质谱)分析
含有~0.2mg/ml蛋白质的蛋白质样品在有TCA沉淀和没有TCA沉淀的条件下被预处理。对于TCA沉淀,样品与20%的TCA 1∶1混合,将其保存在4℃下1小时,接着在20000rcf和4℃离心30分钟。离心后,除去上清液,将沉淀用丙酮洗涤一次(零下20℃)并在20000rcf和4℃离心10分钟。干燥10分钟后除去上清液,将沉淀溶解于50mM NaOH,然后加入100mM NH4HCO3(pH8)。对于未经TCA处理的样品,样品与200mMNH4HCO3(pH8)以5∶1混合。
用胰蛋白酶消化之前(在37℃下过夜),样品用DTT和IAA还原烷基化。用甲酸酸化后,对样品进行分析。
水解产物在联用LTQ-Velos质谱仪(Thermo Electron,Bremen,德国)的Accela UHPLC(Thermo Electron,Breda,荷兰)上进行分析。色谱分离用2.1×100mm 1.8微米粒径,孔径,C-18Eclipse XDB Zorbax柱(Agilent Santa Clara,CA,美国),用(A)含有0.1%甲酸的LC-MS级水和B)含有0.1%甲酸溶液的LC-MS级乙腈(Biosolve BV,荷兰)作为流动相的梯度洗脱来进行。100分钟梯度从5%B线性开始增加至90分钟的30%B,在另外20分钟增加至40%B,用80%B洗涤5分钟并且用5%B再平衡12分钟。流速保持在0.4ml/min,用25μl的注射体积并且柱温度设定至50℃。
质谱数据采集使用“色谱法”和“动态排斥”选项用前10位(Top 10)的数据依赖采集(data dependent acquisition)来完成并且仅包括电荷状态2和3,扫描m/z范围400-2000。MS/MS试验用设定为3.0的隔离宽度进行,并且归一化的碰撞能量被设置为35。
用Sorcerer 2(SorcererTM-)搜索引擎和跨蛋白质组学管道(TPP)进行数据库检索,用胰蛋白酶作为优选的酶。仅置信水平识别为>90%的蛋白质被考虑。
针对Hypomicrobium公共数据库和DSM专有数据库(后者描述于实施例5)检索LC-MS/MS数据。有TCA沉淀和没有TCA沉淀的样品结果之间没有观察到差别。
顶空分析
使用具有质量检测(类型QP2010)和自动进样器(类型AOC5000plus,全部来自Shimadzu Europe GmbH,‘s Hertogenbosch,荷兰)的气相色谱进行顶空分析。使用的GC柱(30m×0.25mm,df=1.00微米)是货号12653(Restek via Interscience B.V.,Breda,荷兰)。进样器和检测器的温度分别设定为250℃和325℃。通过该柱的载气(氦)流速为2.0ml/min。柱温保持在35℃恒温3分钟然后以40℃/min升高至200℃,并保持0.4分钟。注射0.5ml顶空之前,顶空小瓶在37℃加热0.5-10-20-30以及120分钟。
实施例1:来自Hyphomicrobium EG,Thiobacillus thioparus和Rhodocccus
thodochrous的甲基硫醇氧化酶的识别
如Suylen等人,J.General Microbiology(1987),133,2989-2997,Gould和Kanagawa,J.General Microbiology(1992),138,217-221以及Kim等人.Biotechnol.Bioprocess Eng.(2000),5,465-468所示在诱导产生甲基硫醇氧化酶(MM-氧化酶)的条件下分别培养Hyphomicrobium EG,Thiobacillusthioparus TK-M和Rhodocccus rhodochrous的细胞。
MM-氧化酶然后由Suylen等人,Gould和Kanagawa以及Kim等人所示的三个菌株纯化。
然后用N-末端氨基酸分析来测定纯化的MM-氧化酶的N末端的约5至20个氨基酸。
该信息可以与Hyphomicrobium SP MC1(France Genoscope-CentreNational de2 rue Gaston Crémieux CP5706 91057 Evry cedexhttp://www.genoscope.cns.fr/spip/,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ 338736863;提交日(2011年6月24日)国家生物技术信息中心,NIH,Bethesda,MD 20894,美国)以及Rhodococcus(生产胆固醇氧化酶的放线菌Rhodococcus rhodochrous菌种BKS6-46的基因组草图:未发表-Kumar,S.,Bala,M.,Kaur,I.,Mayilraj,S.,Raghava,G.P.S.提交日(2011年11月14日)生物信息中心(BIC),微生物典型培养物保藏中心与基因库(MTCC),微生物技术研究所(IMTECH),Sector 39-A,Chandigarh,Chandigarh 160036,印度-Kumar,S.,Bala,M.,Kaur,I.,Mayilraj,S.,Raghava,G.P.S.http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Traces/wgs/?val=AGVW01)的全基因组序列数据组合。
Hyphomicrobium和Rhodococcus MM-氧化酶的确切的氨基酸和核酸序列可以通过由纯化的MM-氧化酶获得的部分氨基酸数据与全基因组数据的组合来确定。
实施例2:MM-氧化酶在Bacillus subtilis中的表达
E.coli B.subtilis穿梭载体pBHA12描述于(WO2008/000632)并用于Hyphomicrobium、Rhodococcus rhodochrous或Thiobacillus thioparus菌株的基因组存在的MM-氧化酶的表达。MM-氧化酶基因被合成并在编码序列被修饰来匹配B.subtilis表达宿主的编码使用。MM-氧化酶基因片段被克隆到产生MM-氧化酶表达载体pBHA12-MM-H,pBHA12-MM-RR和pBHA12-MM-TT的pBHA12中。
如Quax和Broekhuizen 1994Appl Microbiol Biotechnol.41:425-431所描述,这些载体被转化到B.subtilis菌株BS154(CBS363.94)(ΔaprE,ΔnprE,amyE-,spo-)中。含有MM-氧化酶表达载体的B.subtilis菌株BS 154被命名为BSU154MMO-H、BSU154MMO-RR和BSU154MMO-TT。
实施例3:摇瓶中B.subtilis的MM-氧化酶的表达
B.subtilis菌株BSU154MMO-H、BSU154MMO-RR和BSU154MMO-TT在摇瓶中生长。这些摇瓶中含有20ml的由1.6%(w/v)的细菌用胰蛋白胨、1%(w/v)的酵母提取物和0.5%(w/v)的NaCl构成的2xTY培养基。将培养物在37℃和250rpm下剧烈振荡16小时并且0.2ml培养基被用来接种20ml SMM培养基。SMM预培养基含有1.25%(w/w)的酵母提取物、0.05%(w/w)的CaCl2、0.075%(w/w)的MgCl2·6H2O、15μg/L的MnSO4·4H2O、10μg/L的CoCl2·6H2O、0.05%(w/w)的柠檬酸、0.025%(w/w)的消泡剂86/013(Basildon Chemicals,Abingdon,英国)。为了完成SMM培养基,将单独制备与灭菌的20ml 5%(w/v)的麦芽糖和20ml 200mM的磷酸钠缓冲贮备液(pH6.8)加入到60ml SMM预培养基。这些培养物在37℃和250rpm下孵育48小时。细胞通过在13000rpm下离心5分钟收获。细胞沉淀重新悬浮于含有10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM EDTA、20%蔗糖、50mM NaCl、1mg/ml溶菌酶和蛋白酶抑制剂(完全无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物,Roche)的缓冲液。重悬浮的沉淀物在37℃下孵育30分钟,将得到的原生质体通过超声处理破坏。超声处理后,细胞碎片通过在13000rpm下离心10分钟悬降,在澄清的裂解物中测定MM-氧化酶。
实施例4:来自B.subtilis的MMO的纯化
实施例3中获得的来自培养物裂解物的MM-氧化酶的纯化使用Suylen等人,Gould和Kanagawa以及Kim等人描述的方案进行。
纯化的酶的蛋白质浓度可以通过BCATM蛋白测定试剂盒(Pierce)根据制造商的指示使用以下条件来测定:样品对WR试剂的比为1∶12,并且在540nm的波长下测定混合物的吸光度。
MM-氧化酶的活性以五个不同的方式来测定,即利用(i)MM或(ii)O2,或者(iii)H2O2、(iv)甲醛或(v)硫化物的的形成。这些物质的利用和形成如Suylen等人,J.General Microbiology(1987),133,2989-2997所示进行监测。
实施例5:测定Hyphomicrobium EG的基因组序列
Hyphomicrobium EG由CBS(Centraalbureau Schimmelcultures,Baarn,荷兰;菌种标号NCCB84101)获得并且其DNA被分离用于测定基因组DNA序列。
掺有Na2HPO4·7H2O 7.9g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、(NH4)2SO40.8g/L、DMSO 0.78g/L以及孢子成分溶液(spore elementssolution)的5mL pH 6.0培养基用单菌落分离物接种并且在30℃下有氧培养4天。经过4天的生长,将细胞沉淀并重悬浮于50ml新鲜的DMSO培养基中,并在30℃下再次培养4天。将所得的培养物使用来自Qiagen(Venlo,荷兰)的Puregene酵母/B Act kitB根据制造商用于革兰氏阴性菌的方案用于进行基因组DNA纯化。将纯化的DNA稀释至100ng/微升的最终浓度,并送至BaseClear(Leiden,荷兰)进行序列分析。
将DNA片段化(剪切)并且将DNA适配体连接到DNA片段的两端。取得两组lllumina GAIIx序列读出。第一组由末端配对读出(paired-endreads)组成,跨越275(+-125)左右个核苷酸的距离。第二组由配偶配对读出(mate pair reads)组成,跨越约4500(+-2100)左右个核苷酸的距离。在所有lllumina GAIIx序列读出上施用基于PHRED质量分数的质量过滤。此外,低质量的和含义不明确的核苷酸从剩下的读出中修剪掉。读出在CLCGenomics Workbench(CLC Genomics Workbench版本5.5.1,Aarhus,丹麦)中被用于重新组装。以这种方式,获得一组预先组装的重叠群(连续序列)。所述重叠群利用SSPACE Premium scaffolder 2.3版本如Boetzer等人(Bioinformatics 27:578-579,2011)所描述被进一步配制(支架)。支架内的空隙区域使用GapFiller 1.10版本(Boetzer和Pirovano(Genome Biology13:R56,2012)以自动方式被部分封闭。用Progenus GAPS pipeline进行注释。
实施例6:编码甲基硫醇氧化酶的基因的识别
制备酶提取物的Hyphomicrobium EG的生长如Suylen等人,J.GeneralMicrobiology(1987),133,2989-2997的描述进行。将湿的细胞沉淀物破碎后,离心粗细胞提取物,将上清液进行DEAE层析,随后通过羟基磷灰石色谱法得到2个蛋白峰。在两个峰中,收集不同的色谱级分进行SDS-PAGE(见图1)。用Simply Blue Safe Stain(Collodial Coomassie G250)进行染色。使用偶联甲醛脱氢酶测试测定MM-氧化酶的活性,所述测试也被描述在Suylen等人的文献(同上)中。在泳道5、6和7中所描绘的峰级分具有类似于泳道8、9和10所描绘的峰级分的蛋白质含量(Bradford),但是它们的MM-氧化酶的活性是2倍。
从羟基磷灰石柱中洗脱的蛋白峰级分进行合并并通过使用新获得的DNA序列通过LC-MS/MS进行分析。LC-MS/MS步骤的细节描述于材料与方法部分。针对两个数据库检索获得LC-MS/MS数据:
·‘MS01215_Hypomicrobium_sp_MC1_trypsin.fasta’含有公知的Hipomicrobium的~4900蛋白质序列(来源:uniprot)
·‘MS01215_lup1_BSA.fasta’含有Hyphomicrobium EG菌株的~3600蛋白质序列,DSM生成的专有数据库-见实施例5。
用Sorcerer 2(SorcererTM-)搜索引擎和跨蛋白质组学管道(TPP)进行数据库检索。仅置信水平识别为>90%的蛋白质被考虑。在有TCA沉淀和没有TCA沉淀的样品结果之间没有观察到区别。
在提供的两个羟基磷灰石峰级分样品中识别了来自Hyphomicrobium的大约90个不同的蛋白质。使用公共数据库MS01215_Hypomicrobium_sp_MC1_trypsin.fasta.[Hyphomicrobium denitrificans ATCC 51888]’,蛋白质HDEA00762即硒结合蛋白1-A被识别为两个级分中最丰富的蛋白质,基于测得的LC-MS/MS信号,该蛋白质具有>50%的丰度。该蛋白质的理论分子量是45KDa。这对应于凝胶中观察到的蛋白质条带(~48kDa)。
使用我们的新获得的专有的Hyphomicrobium EG数据库(见实施例5)MS01215_lup1_BSA.fasta,推定的HDEA00789′硒结合蛋白被识别为在两个样品中最丰富的蛋白质。该蛋白质与蛋白质HDEA00762具有91%的同源性。
序列覆盖得到另一突出的酶,但仅在来自Hyphomicrobium EG的新获得的专有数据库中。后一种突出的酶称为HDEA00816,也具有约45kDa的估计的分子量并且被称为“假设的新蛋白”。
实施例7:多种Hyphomicrobium EG基因在E.coli的克隆和过表达
在实施例6描述的三个最突出的酶中,两个新识别的“硒结合”蛋白质HDEA00762(称为MMO1)和HDEA00789(称为MMO3)和新识别的“假设蛋白”HDEA00816(称为MMO2)基因用优化用于E.coli的密码子使用设计并通过DNA2.0(Menlo Park CA,美国)合成。基因MMO2被合成为不具有推定的信号肽MAFSLGVTPSSA。基因MMO1也被合成为没有信号序列并且被称为MMO4。
为了克隆目的,在5′-端引入含有NdeI位点CGAGCAT的DNA序列并且在3′-端引入含有终止密码子、Ascl和HindIII位点TAAAGGCGCGCCCGGGAAGCTTCTCG的DNA序列。四个得到的合成构建体被命名为MMO1E、MMO2E、MMO3E和MMO4E。
合成的DNA构建体MMO1E、MMO2E、MMO3E和MMO4E在阿拉伯糖诱导的E.coli表达载体中克隆,所述载体含有阿拉伯糖诱导的启动子PBAD和调节子araC(Guzman J.Bac.177:4121-4130,1995)、卡那霉素抗性基因Km(R)和来自pBR322的复制原点ori327(Watson,Gene.70:399-403,1988)。这些载体被命名为pBAD-MMO1E、pBAD-MMO2E、pBAD-MMO3E以及pBAD-MMO4E并转化到Escherichia coli菌株RV311中。菌株RV311通过从E.coli菌株RV308缺失ampC和araB基因构建。这产生RV311(su-,ΔlacX74,gal IS II::OP308,lacIq-,ΔampC和ΔaraB)。含有pBAD-MMO1E、pBAD-MMO2E、pBAD-MMO3E和pBAD-MMO4E的RV311菌株分别被命名为MMO101、MMO102、MMO103和MMO104。
实施例8:来自MMO101、MMO102、MMO103和MMO104的酶样品
的制备
菌株MMO101、MMO102、MMO103和MMO104在含有2ml 2xPY培养基的24孔预灭菌深孔板(Axygen,CA,美国)预培养,所述2xPY培养基含有1.6%(w/w)胰蛋白胨蛋白胨、1%(w/w)的酵母提取物、0.5%(w/w)的NaCl和100μg/ml的新霉素。板覆盖有Breathseal(Greiner bio-one,Frickenhausen,Germany)并且在30℃,550rpm和80%湿度下在Microton摇床培养箱(Infors AG,Bottmingen,瑞士)孵育过夜。形成这些预培养物20μl被用于接种第二个24孔预灭菌深孔板(Axygen,CA,美国),所述第二个24孔预灭菌深孔板含有1.34ml魔术(Magic)培养基(Invitogen,CA,美国)和0.66ml 2%酵母提取物。
在30℃、550rpm和80%的湿度下孵育培养物4小时后,将培养物用75μl 0.62%L-阿拉伯糖诱导。在20℃、550rpm和80%的湿度下孵育24小时后,在2750rpm下离心10分钟收获培养物。细胞沉淀在-20℃下贮存过夜。来自2ml培养物的细胞沉淀悬浮在1ml裂解缓冲液中并在37℃下孵育1小时。裂解缓冲液(100ml)含有(5ml 1M Tris HCL、1ml DNA酶I(100mg/10mL)、0.2013g溶菌酶、0.5ml 5mM MgSO4。将裂解物在2750rpm下离心10分钟,除去上清液并储存。然后基本如Suylen等人所描述但加入过氧化氢酶(1.5BU/ml,DSM Food Specialities,Delft,荷兰)来防止H2O2积聚,来自得到的上清液的具有同等蛋白质含量的上清液样品在偶联甲醛脱氢酶测试中测定MM-氧化酶的活性。
根据获得的结果,仅来自过表达基因HDEA00816(MMO2)的E.coli培养物的上清液显示了显著的MM-氧化酶活性(见图2)。因此,基因HDEA00816(MMO2)编码所期望的MM-氧化酶。
名为MMO2的开放阅读框的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1并编码HDEA00816蛋白质,没有推定的信号肽MAFSLGVTPSSA,其在SEQ IDNO:2中示出。SEQ ID NO:3示出5′端引入NdeI位点和3′末端引入终止密码子、AscI和HindIII位点的E.coli优化的MMO2基因(命名MMO2E)的核苷酸序列。
实施例9:MM-氧化酶在口香糖中的用途
根据本发明制备的典型的口香糖组合物示于表1。制备口香糖并且MM-氧化酶例如实施例6至8所描述的MMO2如本文详述被包封。合适的调味剂和冷却剂是本领域一般已知的。值是口香糖组合物或包封的酶的重量%。
表1
实施例10:含有MM-氧化酶的口香糖控制呼气臭味的功效的测定
为了测定含有MM-氧化酶的口香糖控制呼气臭味的功效,在咀嚼根据实施例9制备的口香糖之前以及咀嚼30分钟之后对口呼气进行感官评分并测定MM含量。如Tangerman和Winkel(J Clin.Perodontol.34,748-755,2007)所示进行感官测量和VSC测量。
实施例11:牙膏中的MM-氧化酶活性
为了测试Hyphomicrobium MMO2与牙膏的相容性,进行下列顶空测量实验。
从羟基磷灰石柱洗脱的两个蛋白峰的部分(见实施例6)被冷冻干燥并且两个峰级分的同等的蛋白量与5克“Zendium Classic”牙膏(Unilever,英国)混合。称量各混合物0.25ml与1ml水置于20ml的顶空瓶并将小瓶用隔膜和瓶盖牢牢封闭。混合之后,用注射器穿过隔膜向每个小瓶加入0.5g校准标准。校准标准通过将甲基硫醇(Sigma Aldrich公司)鼓泡通过准确称重量的水15分钟制备。鼓泡后,甲基硫醇的浓度通过重量的增加来测定。得到的储备溶液用不同量的水稀释来构成不同的校准标准。其中一个校准标准被用来添加到Zendium-酶混合物来量化甲基硫醇随时间的降解。在37℃下加热5分钟之后,对校准标准进行顶空分析。
表2列出了由Hyphomicrobium EG获得的多种色谱样品获得的结果。图3中,结果以图形方式描述。能看出:
-Hyphomicrobium EG中存在的MM-氧化酶在与牙膏混合时仍然有活性;
-MM-氧化酶活性在第一羟基磷灰石蛋白质级分(掺入蛋白质HDEA00816:MMO2的主要部分)浓缩;并且
-MM-氧化酶的活性与Zendium提供的牙膏制剂相容。
表2:MM-氧化酶与Zendium classic牙膏的相容性。
Claims (29)
1.一种口部组合物,其包含挥发性硫化合物呼气臭味控制量的甲基硫醇氧化酶。
2.根据权利要求1的口部组合物,其中所述挥发性硫化合物是甲基硫醇或硫化氢。
3.根据权利要求1或2的口部组合物,其包含锌盐,例如有机锌盐。
4.根据前述权利要求中任一项的口部组合物,其是液体或固体组合物。
5.根据前述权利要求中任一项的口部组合物,其是口香糖、咀嚼糖、宠物咀嚼物或饼干、洁齿剂、薄荷糖、慢煮糖、硬糖、锭剂、糖浆、压制薄荷糖、润喉糖或巧克力。
6.根据权利要求5的口部组合物,其中所述洁齿剂是牙膏或牙粉。
7.根据权利要求4或5的口部组合物,其包含:
不溶于水的基质;
水溶性部分;
挥发性硫化合物呼气臭味控制量的甲基硫醇氧化酶;以及任选地
甜味剂和/或调味剂。
8.根据权利要求3至7中任一项的口部组合物,其中所述甲基硫醇氧化酶是被包封的。
9.根据权利要求3至8中任一项的口部组合物,其包含多至约5%(w/w)的甲基硫醇氧化酶。
10.根据前述权利要求中任一项的口部组合物,其中所述甲基硫醇氧化酶是:
(a)包含SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列的多肽;
(b)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少50%的序列同一性的氨基酸序列的多肽;
(c)由包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3示出的多核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽;或
(d)(a)、(b)或(c)定义的多肽的片段。
11.根据前述权利要求中任一项的口部组合物,其中所述甲基硫醇氧化酶是下述多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO 2有至少60%序列同一性、优选至少约70%、更优选至少约80%、甚至更优选至少约90%、甚至更优选至少约93%、甚至更优选至少约95%、甚至更优选至少约96%、优选至少约97%、甚至更优选至少约98%和甚至最优选至少约99%序列同一性的氨基酸序列。
12.根据前述权利要求中任一项的口部组合物,其中所述甲基硫醇氧化酶源自Hyphomicrobium的物种,Thiobacillus的物种或Rhodococcus的物种。
13.根据权利要求12的口部组合物,其中所述Hyphomicrobium的物种是Hyphomicrobium EG,所述Thiobacillu的物种是Thiobacillus thioparus或者所述Rhodococcus的物种是Rhodococcus rhodochrous。
14.根据前述权利要求中任一项的口部组合物,其不包含抗菌组分。
15.一种用于控制对象的呼气臭味的方法,所述方法包括:
提供根据前述权利要求中任一项的组合物;
以及
将所述组合物施用到所述对象的口腔。
16.根据权利要求15的方法,其中所述组合物是口香糖,并且所述方法包括咀嚼所述口香糖来使甲基硫醇氧化酶从口香糖释放到口腔。
17.根据权利要求1至14中任一项的口部组合物,其用于控制呼气臭味。
18.根据权利要求1至14中任一项的口部组合物用于制备用于控制呼气臭味的药物的用途。
19.一种具有甲基硫醇氧化酶活性的多肽,其中所述多肽是:
(a)包含SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列的多肽;
(b)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少50%的序列同一性的氨基酸序列的多肽;
(c)由包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3示出的多核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽;或
(d)(a)、(b)或(c)定义的多肽的片段。
20.根据权利要求19的多肽,其包含下述多肽,所述多肽具有与SEQID NO 2有至少60%序列同一性、优选地至少约70%、更优选至少约80%、甚至更优选至少约90%、甚至更优选至少约93%、甚至更优选至少约95%、甚至更优选至少约96%、优选至少约97%、甚至更优选至少约98%并且甚至最优选至少约99%序列同一性的氨基酸序列。
21.编码根据权利要求19或20的多肽的多核苷酸序列。
22.根据权利要求21的多核苷酸,其中所述多核苷酸是:
(a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3示出的序列或者包含与SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的多核苷酸序列有至少50%的序列同一性的序列的多核苷酸;
(b)作为由于遗产密码的简并性产生的(a)中定义的多核苷酸序列的简并体的多核苷酸;或
(c)作为(a)或(b)中定义的核苷酸序列的反向互补体的多核苷酸。
23.根据权利要求22的多核苷酸序列,其与SEQ ID NO:1或3有至少60%、优选至少70%、更优选至少80%、最优选至少90%、最优选至少93%、最优选至少约95%、最优选至少约96%、最优选至少约97%、甚至最优选至少约98%、甚至更优选至少99%的序列同一性。
24.包含权利要求21至23中任一项的多核苷酸序列的核酸构建体。
25.根据权利要求24的核酸构建体,其是表达载体,其中根据权利要求21至23中任一项的多核苷酸序列被可操作地连接到用于在宿主细胞中表达所述多核苷酸序列的至少一个控制序列。
26.包含根据权利要求21至23中任一项的多核苷酸或者根据权利要求24或25的核酸构建体的宿主细胞。
27.根据权利要求26的宿主细胞,其为原核宿主细胞,优选地原核细胞是细菌细胞,或真核宿主细胞,优选地真核宿主细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或藻类细胞。
28.生产权利要求19或20的多肽的方法,其包括:
(a)在有益于由宿主细胞生产所述多肽的条件下培养根据权利要求26或27中任一项的宿主细胞;以及,任选地
(b)回收所述多肽。
29.一种组合物,例如口部组合物,其包含根据权利要求19或20中任一项的多肽和至少一种另外的成分。
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