CN104662035A - 白蛋白结合多肽 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及具有对白蛋白的结合亲和力的一类工程化的多肽。特别地，本发明涉及对酶促裂解具有高度耐受性的白蛋白结合多肽。本公开内容提供了包含白蛋白结合基序的白蛋白结合多肽，该基序由氨基酸序列GVSDFYKKLI XaKAKTVEGVE ALKXbXcI组成。

Description

白蛋白结合多肽
技术领域
本发明涉及具有对白蛋白的结合亲和力的一类工程化的多肽。特别地，本发明涉及对酶促裂解具有高度耐受性的白蛋白结合多肽(albuminbinding polypeptide)。
背景
血清白蛋白
血清白蛋白是哺乳动物血清中最丰富的蛋白质(40g/l；在人类中约0.7mM)，并且其功能之一是结合例如脂类和胆红素的分子(Peters T,Advances in Protein Chemistry 37:161,1985)。血清白蛋白的半衰期与动物的大小直接地成比例，其中例如人血清白蛋白(HSA)具有19天的半衰期且兔血清白蛋白具有约5天的半衰期(McCurdy TR等人,J Lab Clin Med143:115,2004)。人血清白蛋白广泛地分布在体内，特别是在肠和血液区室中，其中其主要参与维持渗透性。在结构上，白蛋白是包括三个同源结构域以及总计584或585个氨基酸的单链蛋白质(Dugaiczyk L等人,Proc NatlAcad Sci USA 79:71,1982)。白蛋白包含17个二硫键和单一反应性C34巯基，但是缺少N-连接的和O-连接的碳水化合物部分(Peters,1985,同上；Nicholson JP等人,Br J Anaesth 85:599,2000)。糖基化的缺少简化了白蛋白的重组表达。白蛋白的该特性与其三维结构是已知的(He XM和Carter DC,Nature 358:2091992)事实一起使得它成为在重组融合蛋白中使用的有吸引力的候选物。这样的融合蛋白通常将治疗蛋白(其在蛋白本身的施用之后从身体快速地清除)和血浆蛋白(其表现出天然的缓慢清除)组合在单个多肽链中(Sheffield WP,Curr Drug Targets Cardiovacs Haematol Disord 1:1,2001)。这样的融合蛋白可提供需要较不频繁的注射和在体内更高水平的治疗蛋白方面的临床益处。
与HSA融合或缔合导致延长蛋白的体内半衰期
血清白蛋白缺乏任何酶促或免疫学功能并因此，与生物活性的多肽偶联时不应展示出非期望的副作用。此外HSA是参与许多天然的以及治疗的分子的内源运输和递送的天然载体(Sellers EM和Koch-Weser MD,“Albumin Structure,Function and Uses”,eds Rosenoer VM等人,Pergamon,Oxford,第159页,1977)。已经报道了一些策略以将蛋白直接共价偶联至血清白蛋白或共价偶联至允许在体内与血清白蛋白缔合的蛋白。后一种方法的实例已被描述在例如WO91/01743中。该文件尤其描述了源自链球菌(streptococcal)蛋白G的白蛋白结合肽或蛋白用于延长其他蛋白半衰期的用途。该构想是使细菌衍生的白蛋白结合肽/蛋白与在血液中已经显示了具有快速清除的治疗上感兴趣的肽/蛋白融合。因此产生的融合蛋白在体内与血清白蛋白结合，以及受益于它的更长的半衰期，这延长了融合的治疗上感兴趣的肽/蛋白的净半衰期。
与HSA缔合导致降低的免疫原性
除了对生物活性蛋白的体内半衰期的影响，有人提出生物活性蛋白与白蛋白结合蛋白之间的融合体(fusion)与白蛋白的非共价缔合起到降低生物活性蛋白的免疫反应的作用。因此，WO2005/097202中，描述了使用这一原理以降低或消除对生物活性蛋白的免疫反应。
细菌受体蛋白的白蛋白结合结构域
链球菌蛋白G是一种存在于某些链球菌(streptococci)菌株表面的双功能受体并且能够与IgG和血清白蛋白二者结合(等人,MolImmunol 24:1113,1987)。这种结构是一些结构上和功能上不同的结构域(Guss等人,EMBO J 5:1567,1986)，更确切地说三种Ig-结合基序和三种血清白蛋白结合结构域(Olsson等人,Eur J Biochem 168:319,1987)的高度重复。三种血清白蛋白结合结构域之一的结构已经确定，显示了三螺旋束结构域(three-helix bundle domain)(Kraulis等人,FEBS Lett 378:190,1996)。这一基序命名为ABD(albumin binding domain，白蛋白结合结构域)并且在大小上是46个氨基酸残基。在文献中，该基序随后也被称为G148-GA3。
除了来自链球菌的蛋白G以外的其他细菌白蛋白结合蛋白也被鉴定，其包含与蛋白G的白蛋白结合三螺旋结构域相似的结构域。这样的蛋白的实例是PAB、PPL、MAG和ZAG蛋白。Johansson和他的同事们实施和报道了这样的白蛋白结合蛋白的结构和功能的研究(Johansson等人,J MolBiol 266:859-865,1997；Johansson等人,J Biol Chem 277:8114-8120,2002)，他们引入了名称“GA模块(GA module)(蛋白G相关的白蛋白结合模块)”用于负责白蛋白结合的三螺旋蛋白结构域。此外，Rozak等人已经报道了GA模块的人工变体的创建，该人工变体被选择和研究了不同物种特异性和稳定性(Rozak等人,Biochemistry 45:3263-3271,2006；He等人,ProteinScience 16:1490-1494,2007)。在本公开内容中，将遵循在Johansson等人和Rozak等人文章中建立的关于来自不同细菌物种的GA模块的术语。
最近，开发了具有各种优化特征的G148-GA3结构域的变体。这样的变体例如公开在PCT公布WO2009/016043和WO2012/004384中。
梭菌蛋白酶
梭菌蛋白酶，也称为胞内蛋白酶Arg-C，是可以从溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)分离的双链蛋白酶。梭菌蛋白酶显示了具有蛋白水解和酰胺酶/酯酶活性(Mitchell,等人(1968),J Biol Chem243:4683-4692)。梭菌蛋白酶活性据报道在pH范围7.6-7.9内是最佳的。
梭菌蛋白酶优先地在精氨酸残基的羧基基团裂解(Labrou等人(2004),Eur J Biochem 271(5):983-92；Keil(1992),“Specificity of proteolysis”,Springer-Verlag,第335页)，但是也已经报道了赖氨酰基键的裂解。梭菌蛋白酶已经显示出接受包含Lys而不是Arg的底物，但是相比于与含有Arg的底物的反应，反应速率低。例如，已经报道了梭菌蛋白酶在Arg-Arg、Arg-Ala和Lys-Tyr位点裂解胰高血糖素。这三种键的水解作用的相对初始速率是1、1/7和1/300(Labouesses(1960),Bull Soc Chim Biol 42:1293-304)。
梭菌蛋白酶裂解经常在生物化学和生物技术应用中使用。梭菌蛋白酶裂解的应用包括肽图谱、序列分析、细胞分离、酰胺键的水解/缩合，以及肽合成。
梭菌蛋白酶例如可被使用以裂解用于蛋白纯化和/或检测的标签(例如His6、c-Myc、Flag和GST标签)。此外，梭菌蛋白酶裂解可在从前体多肽制备酰胺化治疗多肽的过程中使用，藉以提高治疗多肽在向动物或人类受试对象施用后对内源蛋白酶的蛋白水解降解作用的耐受性。
如从本背景描述的不同节明显的是，对白蛋白具有高度亲和力以及展示对尤其是梭菌蛋白酶的酶促裂解的高度耐受性的多肽分子的提供在各种生物医学的、生物技术的和其他应用的开发中是关键因素，并且因此本领域中存在对这样的多肽分子的需求。
发明的公开内容
本发明的第一方面，通过提供包括白蛋白结合基序(BM)的白蛋白多肽，满足对具有相对高的白蛋白亲和力和对梭菌蛋白酶裂解的高耐受性的新的多肽的需求，所述基序由以下氨基酸序列组成：
GVSDFYKKLI XaKAKTVEGVE ALKXbXcI
其中，彼此独立地，
Xa选自D和E；
Xb选自D和E；以及
Xc选自A和E。
在根据本发明这方面的多肽的一个实施方案中，Xa是D。
在根据本发明这方面的多肽的一个实施方案中，Xb是D。
在根据本发明这方面的多肽的一个实施方案中，Xc是A。
考虑到所有以上组合，清楚的是白蛋白结合基序BM的序列选自由SEQ ID NO:1-8组成的组。在根据本发明这方面的多肽的一个实施方案中，BM的序列是SEQ ID NO:1。
为了提供包括白蛋白结合结构域(ABD)或其变体的白蛋白结合多肽，该肽对梭菌蛋白酶裂解是高度耐受性的，发明人研究了PEP07843(SEQ IDNO:27)的各种变体。发明人显示了，相比于其他变体，PEP07843对应于如本文定义的BM中位置8的位置处的精氨酸残基(R)被赖氨酸残基(K)取代，出乎意料地展示了关于蛋白酶稳定性的优越性，在所述其他变体中这个位置的精氨酸残基已经被与赖氨酸不同的氨基酸取代，所述氨基酸之前没有被描述为梭菌蛋白酶裂解位点(见实施例3和图3)。
因此，鉴于之前的研究显示梭菌蛋白酶在Lys残基的羧基基团处裂解肽，以上讨论的Arg-至-Lys的取代突变稳定和改善了白蛋白结合多肽对梭菌蛋白酶裂解的耐受性的发现是令人意外的和预料不到的。
在根据本发明这方面的一个实施方案中，提供了白蛋白结合多肽，其中白蛋白结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的部分。例如，BM可基本上构成或形成所述三螺旋束蛋白结构域中与具有互相连接的环的两个α螺旋的部分。
在本发明的特定实施方案中，这样的三螺旋束蛋白结构域选自由细菌受体蛋白的三螺旋结构域组成的组。这样的细菌受体蛋白的非限制性实例可以选自由来自链球菌(Streptococcus)、消化链球菌(Peptostreptococcus)和Finegoldia物种的白蛋白结合受体蛋白组成的组，诸如例如选自由蛋白G、MAG、ZAG、PPL和PAB组成的组。
在本发明的特定实施方案中，BM形成蛋白G的结构域，诸如例如来自链球菌菌株G148的蛋白G的结构域的部分。在本实施方案的不同变化形式中，BM形成其部分的三螺旋束蛋白结构域选自由来自链球菌菌株G148的蛋白G的结构域GA1、结构域GA2和结构域GA3组成的组，特别是结构域GA3。
在可选的实施方案中，BM形成来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的细菌受体蛋白蛋白A的5个三螺旋结构域的一个或更多个的部分；即，三螺旋束蛋白结构域选自由蛋白A结构域A、B、C、D和E组成的组。在其他类似的实施方案中，BM形成源自来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域B的蛋白Z的部分。
在本发明的实施方案中，其中BM“形成”三螺旋束蛋白结构域的“部分”，这被理解为表示BM的序列被“插入”或“嫁接”到原始三螺旋束结构域的序列，使得BM替代了原始结构域中相似的结构基序。例如，不希望被理论束缚，BM被认为构成三螺旋束的三个螺旋的两个，并且因此可以代替任何三螺旋束中这样的二螺旋基序。如同本领域技术人员将会意识到的，三螺旋束结构域的二个螺旋被二个BM螺旋替代必须被执行以便不影响多肽的基本结构。就是说，根据本发明的这一实施方案，多肽的Cα骨架的总体折叠将与它形成其部分的三螺旋束蛋白结构域实质上相同，例如具有同样顺序的二级结构的同样组件等。因此，根据本发明BM“形成”三螺旋束结构域的“部分”，如果根据本发明这一实施方案的多肽具有与原始结构域同样的折叠，意味着基本结构性质是共有的，这些性质例如导致同样的CD光谱。本领域技术人员知道其他相关的参数。
在本发明这方面的一个实施方案中，白蛋白结合多肽是三螺旋束蛋白结构域，其包括以上定义的白蛋白结合基序和构成三螺旋构型的其余部分的另外的序列。因此，在一个实施方案中提供了包括以下氨基酸序列的白蛋白结合多肽：
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
其中
[BM]是如以上定义的白蛋白结合基序，
且，彼此独立地，
X3选自C、E、Q和S；
X6选自C、E和S；
X7选自A和S；
X10选自A、R和S；
X14选自A、C、K和S；
X43选自A和K；以及
X44选自A、E和S。
在这一白蛋白结合多肽的一个特定实施方案中，X3是E。
在这一白蛋白结合多肽的一个特定实施方案中，X6是E。
在这一白蛋白结合多肽的一个特定实施方案中，X7是A。
在这一白蛋白结合多肽的一个特定实施方案中，X10是A。
在这一白蛋白结合多肽的一个特定实施方案中，X14是S。
在这一白蛋白结合多肽的一个特定实施方案中，X43是A。
在这一白蛋白结合多肽的一个特定实施方案中，X44是A。
如本领域技术人员会认识到的，任何多肽的功能，诸如根据本发明的多肽的白蛋白结合能力，取决于多肽的三级结构。因此对多肽中氨基酸序列做出微小的改变而不影响其功能是可能的。因此，本发明包含BM的修改的变体，该变体使得保留白蛋白结合特征和对梭菌蛋白酶裂解的高度耐受性。例如，属于氨基酸残基的某一功能分组(例如疏水的、亲水的、极性的等)的氨基酸残基能够被来自同一功能组的另一氨基酸残基交换可以是可能的。
如在以下实验部分详细描述的，发明人已经鉴定了单独的白蛋白结合多肽序列。这些序列构成根据本发明的第一方面的白蛋白结合多肽的单独实施方案。这些单独白蛋白结合多肽的序列展示在图1中并且展示为SEQID NO:9-16。
因此，在本发明的根据该第一方面的一个实施方案中，提供了包括选自SEQ ID NO:9-16的氨基酸序列的白蛋白结合多肽。本发明还包含包括与选自SEQ ID NO:9-16的序列具有93％或更大同一性的氨基酸序列的白蛋白结合多肽，条件是在对应SEQ ID NO:9-16中位置23的位置处的氨基酸是K。在一些实施方案中，发明的多肽可以包括与选自SEQ ID NO:9-16的序列至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，条件是在对应SEQ ID NO:9-16中位置23的位置处的氨基酸是K。
在一个特定的实施方案中。白蛋白结合多肽包括选自SEQ ID NO:9的序列和与其具有93％或更大同一性的序列，条件是在对应SEQ ID NO:9中位置23的位置处的氨基酸是K。在一些实施方案中，发明的多肽可以包括与SEQ ID NO:9至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列，条件是在对应SEQ ID NO:9中位置23的位置处的氨基酸是K。
遍及说明书使用的术语“％同一性”，可以按如下计算。通过使用CLUSTAL W算法(Thompson等人,Nucleic Acids Research,22:4673-4680(1994))将查询序列(query sequence)与靶序列比对。经对应最短比对序列的窗口进行比较。最短比对序列在某些情况下可以是靶序列。在其他情况下，查询序列可以构成最短比对序列。比较每一位置的氨基酸序列，并且查询序列中具有靶序列中相同对应性的位置的百分比被报告为％同一性。
本说明书中使用的术语“白蛋白结合”和“对白蛋白的结合亲和力”指可被检测的多肽的性质，例如通过使用表面等离子共振技术(surface plasmonresonance technology)诸如在Biocore仪器中。例如下面实施例中描述的，白蛋白结合亲和力可以在实验中检测，在该实验中白蛋白或其片段固定在设备的传感芯片(sensor chip)上，并且将包含要被检测的多肽样品的经过该芯片。可选地，要被检测的多肽固定在设备的传感芯片上，并且将包含白蛋白或其片段的样品经过该芯片。在这一方面，白蛋白可以是来自哺乳动物的血清白蛋白，例如人血清白蛋白。本领域技术人员然后可以解释通过这样的实验获得的结果以建立多肽对白蛋白的结合亲和力的至少定性的量度。如果期望定量的量度，例如确定相互作用的KD值，表面等离子共振方法也可以被使用。结合值可以是例如Biacore 2000仪器(BiacoreAB)中定义的。白蛋白适于固定在设备的传感芯片上，并且亲和力要被确定的多肽的样品通过连续稀释制备并且以随机顺序注射。KD值然后可以从通过使用例如BIAevaluation 4.1软件、或由设备生产商(Biacore AB)提供的其他合适的软件的1:1Langmuir结合模型的结果计算出。
根据本发明的该第一方面的白蛋白结合多肽与白蛋白结合，使得相互作用的相对KD值是至多1x 10-9M即1nM。在一些实施方案中，相互作用的KD值是至多1x 10-10M、例如至多1x 10-11M、例如至多1x 10-12M、例如至多1x 10-13M、例如至多1x 10-14M。
在本发明的一个实施方案中，白蛋白结合多肽与其结合的白蛋白选自人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、猕猴血清白蛋白和小鼠血清白蛋白。
在一个特定的实施方案中，白蛋白结合多肽与其结合的白蛋白是人血清白蛋白。
本发明还包括以上描述的白蛋白结合多肽，其进一步还包括位于白蛋白结合基序一侧或两侧的一个或更多个氨基酸。这些氨基酸残基可以在增强白蛋白被多肽的结合中发挥作用，但是可同样良好地用于其他目的，例如涉及多肽的制备、纯化、体内或体外稳定、偶联或检测的一种或更多种、以及其任何组合。
因此在一个实施方案中，直接在如本文定义的氨基酸序列的N或C末端的α螺旋之前或之后的氨基酸可影响构象的稳定性。可有助于改善构象稳定性的氨基酸残基的一个实例是位于所述氨基酸序列N末端的丝氨酸残基。N末端丝氨酸残基在一些情况下可通过涉及丝氨酸侧链的γ氧和谷氨酸残基的多肽骨架NH之间的氢键键合，形成标准的S-X-X-E加帽盒(capping box)。该N末端加帽可以有助于三螺旋结构域的第一α螺旋的稳定，所述三螺旋结构域在一些实施方案中包括白蛋白结合基序。
因此，在本发明这一方面的一个实施方案中，提供了白蛋白结合多肽，其还包括在如本文定义的多肽序列的N末端侧的至少一个丝氨酸残基。换句话说，一个或更多个丝氨酸残基在该氨基酸序列之前。此外，白蛋白结合多肽还可包括在所述多肽的N末端或C末端侧的任一端或两端的一个、两个或三个或更多个丝氨酸残基。
在本发明这方面的一个实施方案中，提供了白蛋白结合多肽，其还包括在如本文定义的多肽序列的N末端侧的谷氨酸残基。
需要理解的是一个、两个、三个、四个或任意合适数目的氨基酸残基可以在如本文定义的氨基酸序列之前。因此，单个丝氨酸残基、单个谷氨酸残基或两者的组合例如谷氨酸-丝氨酸(GS)组合或谷氨酸-丝氨酸-丝氨酸(GSS)组合可以在该氨基酸序列之前。
因此，在一个实施方案中，提供了白蛋白结合多肽，其还包括在如本文定义的多肽序列的N末端侧的氨基酸GS。
在一个特定的实施方案中，提供了白蛋白结合多肽，其还包括在如本文定义的多肽序列的N末端侧的氨基酸GSS。
特别的，本发明包含在图1中展示为SEQ ID NO:17-24的单独白蛋白结合多肽的序列，例如SEQ ID No:17。这些序列构成根据本发明第一方面的以上实施方案的白蛋白结合多肽的单独实施方案。
在又另一实施方案中，添加的氨基酸残基包括在如本文定义的多肽序列的N末端侧的谷氨酸。
类似地，当这样的三螺旋结构域存在时，C末端加帽可被利用以改善包括白蛋白结合基序的三螺旋结构域中的第三α螺旋的稳定性。
当脯氨酸残基存在于如本文定义的氨基酸序列的C末端侧时可以至少部分地起到加帽残基的作用。在这种情况下，在C末端侧脯氨酸残基之后的赖氨酸残基，可通过赖氨酸残基的ε氨基和位于多肽骨架中赖氨酸之前的两个或三个残基的氨基酸的羰基之间的氢键键合，有助于进一步稳定白蛋白结合多肽的第三螺旋。
因此，在一个实施方案中，提供了白蛋白结合多肽，根据以上定义的任一项或更多项，该白蛋白结合多肽还包括在多肽序列的C末端侧的赖氨酸残基。
如以上讨论的，添加的氨基酸可涉及白蛋白结合多肽的制备。特别地，当根据其中在C末端存在脯氨酸的实施方案的白蛋白结合多肽通过化学肽合成制备时，在C末端脯氨酸之后的一个或更多个任选的氨基酸残基可提供优势。这样的添加的氨基酸残基例如，可以阻止不期望的物质，例如合成二肽阶段的二酮哌嗪的形成。这样氨基酸残基的一个实例是甘氨酸。
因此，在另一实施方案中，提供了白蛋白结合多肽，根据以上定义的任一项或更多项，该白蛋白结合多肽还包括在多肽序列的C末端侧的甘氨酸残基。
在一个实施方案中，添加的氨基酸包括在多肽C末端侧的甘氨酸残基，所述甘氨酸残基直接在脯氨酸残基之后或在如上说明的添加的赖氨酸和/或甘氨酸残基之后。
可选地，当C末端脯氨酸残基存在时，多肽制备可以从如本文定义的氨基酸序列的C末端脯氨酸残基的酰胺化受益。在这种情况下，C末端脯氨酸包括在羧基碳的添加的胺基。在本文描述的多肽的一个实施方案中，特别是其C末端以脯氨酸或已知在肽合成期间外消旋的其他氨基酸终止的那些多肽，上述甘氨酸向C末端的添加或脯氨酸的酰胺化，当存在时，也可以反击C末端氨基酸残基的外消旋化的潜在问题。如果按照这种方式酰胺化的多肽预期通过重组方式而不是通过化学合成制备，那么C末端氨基酸的酰胺化可以通过本领域中已知的一些方法执行，例如通过使用酰胺化的PAM酶。
本领域技术人员知道用于完成C末端修饰的方法，例如通过用于肽合成的不同类型的预制基质(pre-made matrices)。
因此，添加的氨基酸残基可以包括为了化学偶联目的添加的一个或更多个氨基酸残基，所述化学偶联例如与层析树脂偶联以获得亲和基质或与螯合部分偶联用于与金属放射性核素络合。这样的实例是在多肽链的正好第一或正好最后位置即N或C末端添加半胱氨酸残基。这样添加的氨基酸残基也可以包括用于多肽纯化或检测的“标签”，例如用于与对标签特异性的抗体相互作用的六组胺酰(His6)标签、或谷胱甘肽S-转移酶标签(GST-标签)、或“myc”(“c-Myc”)标签或“FLAG”标签。本领域技术人员知道其他可选物。
以上讨论的“添加的氨基酸残基”也可以组成具有任何期望功能的一个或更多个多肽结构域，例如与第一白蛋白结合结构域同样的结合功能、或另外的结合功能、或治疗功能、或细胞毒性功能、或酶促功能、或荧光功能、或其混合。根据本发明，在这样的多肽中连接的多肽“单元”可以通过使用已知的有机化学方法共价偶联连接、或在用于多肽的重组表达的系统中表达为一种或更多种融合多肽、或以其他任何方式直接连接或通过包括许多氨基酸的接头介导。
在另一实施方案中，添加的氨基酸残基包括在多肽的N和/或C末端的半胱氨酸残基。这样的半胱氨酸残基可以直接在如本文定义的氨基酸序列之前和/或之后，或可以在如以上描述的任何其他添加的氨基酸残基之前和/或之后。通过向多肽链添加半胱氨酸残基可以获得用于白蛋白结合多肽的位点定向的缀合的巯基。可选地，硒代半胱氨酸残基可以被引入在多肽链的C末端以促进位点特异性缀合(Cheng等人,Nat Prot 1:2,2006)。
因此，在本发明这一方面的另一实施方案中，提供了白蛋白结合多肽，根据以上定义的任一项或更多项，该白蛋白结合多肽还包括在多肽序列的N末端侧的半胱氨酸残基。
在另一实施方案中，提供了白蛋白结合多肽，根据以上定义的任一项或更多项，该白蛋白结合多肽还包括在多肽序列的C末端侧的半胱氨酸残基。
在本发明这一方面的一个实施方案中，提供了包括不多于两个半胱氨酸残基，例如不多于一个半胱氨酸残基的白蛋白结合多肽。
此外，本发明还包括具有对白蛋白的亲和力的多肽的多聚体，即包括至少两个白蛋白结合多肽或其片段作为单体单元的多肽链。例如在白蛋白纯化方法中或利用白蛋白结合功能的治疗方法中，获得白蛋白的比根据本发明的一种多肽可能的甚至更强的结合可以是感兴趣。在这种情况下，提供多肽的多聚体，例如二聚体、三聚体或四聚体可以提供必需的亲和力作用。根据本发明，多聚体可以由合适的数目的多肽组成。根据本发明，在这样的多聚体中形成单体的这些多肽结构域可以都具有同样的氨基酸序列，但是它们具有不同氨基酸序列也是同样可能的。如以上描述，根据本发明多聚体中连接的多肽“单元”可以通过使用已知的有机化学方法共价偶联连接，或在用于多肽的重组表达的系统中表达为一种或更多种融合多肽、或以其他任何方式直接连接或由包括许多氨基酸的接头介导。
此外，“异种的”融合多肽或蛋白、或缀合物，或其多聚体，其中根据本发明的白蛋白结合多肽构成第一结构域、或第一部分，且第二和另外的部分具有结合白蛋白以外的功能，也被涵盖并落入本发明的范围中。这样的蛋白中的融合多肽或缀合物的第二和另外的一个或更多个部分适当地具有期望的生物活性。
因此，本发明的第二方面，提供了包括由根据第一方面的白蛋白结合多肽组成的第一部分、以及由具有期望生物活性的多肽组成的第二部分的融合蛋白或缀合物。
这样的期望生物活性的非限制性实例包括治疗活性、结合活性以及酶促活性。在一个实施方案中，具有期望生物活性的第二部分是治疗活性多肽。
治疗活性多肽的非限制性实例是生物分子，例如选自由人内源酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子组成的组的分子。可以证明在与白蛋白结合多肽的融合物或缀合物中有用的治疗活性生物分子的非限制性实例选自由IL-2、GLP-1、BNP(Alb-beta-利尿钠肽)、IL-1-RA(白细胞介素-1受体拮抗剂)、KGF(角质化细胞生长因子)、生长激素(GH)、G-CSF、CTLA-4、肌肉生长抑制素(myostatin)、因子VII、因子VIII、因子IX和因子X、以及其任何组合或亚群。
合适的生物分子的另外的非限制性实例是非人生物活性蛋白，例如选自由细菌毒素(例如假单胞菌外毒素和葡萄球菌和链球菌的超抗原)、酶(例如核糖核酸酶和β-内酰胺酶)以及活化蛋白(例如链激酶)组成的组的蛋白。
在另一实施方案中，本发明提供了融合蛋白或缀合物，其中具有期望生物活性的第二部分是能够与靶分子选择性相互作用的结合多肽。第二和任何另外的部分选自能够与靶分子选择性相互作用(结合)的结合部分，典型地白蛋白以外的靶分子，尽管不排除白蛋白。
这样的结合多肽例如可以选自由以下组成的组：抗体和大体上保留抗体结合活性的其片段和结构域；微体、maxybodies、高亲和性多聚体以及其他小的二硫化物键合的蛋白；源自选自由以下组成的组的支架的结合蛋白：葡萄球菌蛋白A和其结构域、其他三螺旋结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合结构域、γ晶体、绿色荧光蛋白、人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂例如Kunitz结构域、PDZ结构域、SH3结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、III型纤连蛋白结构域、转铁蛋白、锌指结构和芋螺毒素。
在一些实施方案中，用于结合所述靶结合多肽的靶分子可以选自由以下组成的组：阿尔兹海默氏病的淀粉状蛋白β(Aβ)肽；其他疾病相关的淀粉状蛋白肽；毒素，例如细菌毒素和蛇毒；凝血因子，例如血管假性血友病因子；白细胞介素，例如IL-13；肌肉生长抑制素；促炎症因子，例如TNF-α、TNF-α受体、IL-1、IL-8和IL-23；补体因子，例如C3和C5；超敏反应介质，例如组胺和IgE；肿瘤相关抗原，例如CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD52、CD70、cMet、HER1、HER2、HER3、HER4、CAIX(碳酸酐酶IX)、CEA、IL-2受体、MUC1、PSMA、TAG-72、和其他生物分子例如G-CSF、GM-CSF、生长因子(GH)、胰岛素和生长激素抑制素。
如本领域技术人员理解的，根据第一方面的白蛋白结合多肽在融合蛋白中或作为任何其他部分的缀合物伴侣可以是有用的。因此，治疗活性多肽、结合多肽和靶分子的以上列表不应该以任何方式解释为限制性的。
用于产生融合多肽或缀合物的其他可能性也是预期的。因此，根据本发明第一方面的白蛋白结合多肽可以与第二或另外的一个或更多个部分共价偶联，所述第二或另外的一个或更多个部分除了靶结合以外展示其他功能或展示其他功能而不是靶结合。一个实例是一种或更多种白蛋白结合多肽与作为报告物或效应部分的酶促活性多肽之间的融合。可以与白蛋白结合多肽偶联以形成融合蛋白的报告酶的实例，是本领域技术人员已知的并且包括例如β半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和羧肽酶。用于根据本发明的融合蛋白或缀合物的第二和另外的一个或更多个部分的其他选择包括也不限于，荧光多肽，例如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、萤光素酶和其变体。
在本发明这一方面的一个实施方案中，提供了融合蛋白或缀合物，其中另外的部分由具有其他期望生物活性的多肽组成，这种期望的生物活性可以和第二部分的相同或不同。在一个特别的实施方案中，第二部分可以选自治疗活性多肽、人内源酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、IL-2、GLP-1、BNP、IL-1受体拮抗剂、KGF、GH、G-CSF、CTLA-4、肌肉生长抑制素、因子VII、因子VIII、因子IX和因子X以及非人生物活性蛋白，选自由细菌毒素、酶和活化蛋白组成的组，并且另外的部分可以包括能够和如上定义的靶分子选择性相互作用的结合多肽。在另一特定的实施方案中，第二和另外的部分各自包括能够和如上定义的靶分子选择性相互作用的结合多肽。
关于本文对并入根据本发明的白蛋白结合多肽的融合蛋白或缀合物的描述，应该注意的对第一、第二和另外的部分的命名是为了清楚的原因，以区分一方面根据本发明的一种或更多种白蛋白结合多肽和另一方面展示其他功能的部分。这些名称不意图指融合蛋白或缀合物的多肽链中不同结构域的实际顺序。因此，例如，所述第一部分可以没有限制的出现在融合蛋白或缀合物的N末端，在中间或在C末端。
在根据本公开内容的缀合物的一个实施方案中，第二部分经由向白蛋白结合多肽的N或C末端添加的赖氨酸或半胱氨酸残基或经由在白蛋白结合多肽中赖氨酸或丝氨酸残基出现的位置的赖氨酸或丝氨酸残基与白蛋白结合多肽缀合。例如如果白蛋白结合多肽包括以上公开的46个氨基酸的序列，缀合可以在选自X3、X6和X14的位置进行。如果缀合位点是白蛋白结合多肽的氨基酸序列中的一个，例如46-mer的位置X14中的半胱氨酸，不需要添加另外的氨基酸到白蛋白结合多肽用于使得能够缀合第二部分的目的。因此，在这方面的一个实施方案中，提供了缀合物，其中第二部分经由存在于对应公开的46-mer的X14位置的所述第一部分的位置的任何半胱氨酸残基的巯基缀合到第一部分。
在相关的方面，提供了如本公开内容定义的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，还包括有机分子，例如细胞毒性剂。可以与根据第一方面的白蛋白结合多肽融合或缀合，或与根据第二方面的融合蛋白或缀合物组合的细胞毒性剂的非限制性实例选自刺孢毒素、auristatin、阿霉素、美登素(maytansinoid)、紫杉醇、海鞘素(ecteinascidin)、格尔德霉素、甲氨蝶呤和它们的衍生物以及其组合。以前已经尝试了使用直接白蛋白缀合物治疗各种紊乱。这样的直接白蛋白缀合物在例如癌症中与阿霉素一起利用(Kratz等人,J Med Chem 45:5523-33,2002)和在风湿性关节炎中与甲氨蝶呤一起利用(Wunder等人,J Immunol 170:4793–4801,2003)。应该被理解的是，白蛋白结合多肽自身或作为融合蛋白或缀合物中的部分，通过它的高白蛋白结合能力提供了构建白蛋白复合物的间接手段，并且因此相比于以上提到的尝试可以提供可选的治疗选择。
以上方面还包含多肽，其中根据第一方面的白蛋白结合多肽，或根据第二方面作为包括在融合蛋白或缀合物中的白蛋白结合多肽，例如为了多肽检测目的被设有标记基团，例如，选自由荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白质、酶、放射性核素和颗粒组成的组的标记物。特别地，本公开内容包含由如本文描述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物的放射性螯合物和放射性核素，例如放射活性金属组成的放射性标记的多肽。
在其中标记的白蛋白结合多肽包括根据本公开内容的第一方面的白蛋白结合多肽和标记物的实施方案中，标记的多肽例如可以被用于间接标记血清白蛋白。由于标记的多肽和血清白蛋白之间的强的缔合，标记的多肽可被用于例如研究血管渗透性和血池。
在其他实施方案中，标记的白蛋白结合多肽作为还包括具有期望生物活性的第二部分的融合蛋白或缀合物中的部分出现。标记物在一些情况下可以仅仅与白蛋白结合多肽偶联，以及在一些情况下与白蛋白结合多肽和缀合物或融合蛋白的第二部分二者偶联。此外，标记物可以仅仅与第二部分而不是白蛋白结合部分偶联也是可能的。因此，在又另一实施方案中，提供了包括第二部分的白蛋白结合多肽，其中所述标记物仅仅与第二部分偶联。当提及标记的多肽时，应该理解为提及如本文描述的多肽的所有方面，包括包含白蛋白结合多肽和第二部分以及任选地另外的部分的融合蛋白和缀合物。因此，标记的多肽可以仅仅包含白蛋白结合多肽和例如治疗放射性核素，所述治疗放射性核素可以与白蛋白结合多肽螯合或共价偶联，或包含白蛋白结合多肽、治疗放射性核素和第二部分诸如具有例如治疗效应的期望的生物活性的小分子。
在白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物被放射性标记的实施方案中，这样的放射性标记的多肽可包括放射性核素。大多数放射性核素具有金属性质并且金属典型地与蛋白和肽中存在的元素不能够形成稳定的共价键。由于这个原因，用放射性金属标记蛋白和肽使用螯合剂即多齿配体来执行，所述多齿配体与金属离子形成称为螯合物的非共价化合物。在白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物的实施方案中，放射性核素的掺入通过提供螯合环境实现，放射性核素通过所述螯合环境可与多肽配位、螯合或络合。
螯合剂的一个实例是多胺多羧酸类型的螯合剂。两类这样的多胺多羧酸螯合剂可以分为：大环的和无环的螯合剂。
在一个实施方案中，白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物包括由多胺多羧酸螯合剂提供的经由半胱氨酸残基的巯基或赖氨酸残基的ε胺基与白蛋白结合多肽缀合的螯合环境。
用于铟、镓、钇、铋、放射性锕和放射性镧的放射性同位素的最常用的大环螯合剂是DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)的不同的衍生物。在一个实施方案中，白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物的螯合环境由DOTA或相应衍生物提供。更具体地，在一个实施方案中，本公开内容包含的螯合多肽通过DOTA衍生物1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-马来酰亚胺乙基乙酰胺(马来酰亚胺单酰胺-DOTA)与所述多肽发生反应获得。
此外，1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)和其衍生物可以被用作螯合剂。因此，在一个实施方案中。提供了白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中多胺多羧酸螯合剂是1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸或其衍生物。
最常用的无环多胺多羧酸螯合剂是DTPA(二乙烯三胺五乙酸)的不同衍生物。因此，具有二乙烯三胺五乙酸或相应衍生物提供的螯合环境的多肽也被包含在本公开内容中。
在本发明的第三方面中，提供了编码如本文描述的白蛋白结合多肽或融合蛋白的多核苷酸。
还涵盖制备如以上描述的白蛋白结合多肽或融合蛋白的方法，该方法包括表达多核苷酸；包括该多核苷酸的表达载体和包括该表达载体的宿主细胞。
还涵盖制备多肽的方法，该方法包括在允许从所述表达载体表达所述多肽的条件下培养所述宿主细胞，以及分离多肽。
本公开内容的白蛋白结合多肽可以可选地使用具有受保护的反应侧链的氨基酸和/或氨基酸衍生物通过非生物肽合成制备，该非生物肽合成包括：
逐步偶联氨基酸和/或氨基酸衍生物以形成根据第一方面的具有受保护的反应侧链的多肽，
从多肽的反应侧链除去保护基团，以及
多肽在水溶液中的折叠。
尽管本发明已经参考各种示例性实施方案描述，本领域技术人员应该理解的是可以做出各种变化和等同物可以替代其元素的而不背离本发明的范围。此外，可做出许多修改以按照本发明的教导适应特定的情形或分子而不背离其基本范围。因此，意图是本发明不受限于预计用于实施本发明的任何特别的实施方案，而是本发明将包括落入附加权利要求书的范围的所有实施方案。
附图简述
图1是包含在本发明的白蛋白结合多肽中的白蛋白结合基序的实例(SEQ ID NO:1-8)、根据本发明的白蛋白结合多肽的实例(SEQ ID NO:9-24)和对照多肽(SEQ ID NO:25(PEP12381)、26(PEP12379)、27(PEP07843)和28(PEP06923))的氨基酸序列的列表。
图2显示了所示白蛋白结合多肽PEP12379(SEQ ID NO:26)、PEP12380(SEQ ID NO:17)、PEP12381(SEQ ID NO:25)和PEP07843(SEQ IDNO:27)在热处理之前和之后的四种CD光谱的叠加。
图3显示了所示白蛋白结合多肽与梭菌蛋白酶一起孵育多达22小时的样品的SDS-PAGE分析结果。
图4显示了所示白蛋白结合多肽与每毫克多肽0.2U梭菌蛋白酶一起孵育多达22小时的样品的LC/MS分析结果。
图5显示了所示白蛋白结合多肽与每毫克多肽5U梭菌蛋白酶一起孵育多达22小时的样品的LC/MS分析结果。
图6显示了与每毫克多肽5U梭菌蛋白酶一起孵育多达22小时的PEP12380(SEQ ID NO:17)的样品的代表性LC/MS色谱图。
图7显示了在设备中执行的用于调查所示白蛋白结合多肽PEP12379(SEQ ID NO:26)与人血清白蛋白结合的结合分析结果。
图8显示了在设备中执行的用于调查所示白蛋白结合多肽PEP12380(SEQ ID NO:17)与人血清白蛋白结合的结合分析结果。
图9显示了在设备中执行的用于调查所示白蛋白结合多肽PEP12381(SEQ ID NO:25)与人血清白蛋白结合的结合分析结果。
图10显示了在设备中执行的用于调查所示白蛋白结合多肽PEP07843(SEQ ID NO:27)与人血清白蛋白结合的结合分析结果。
图11显示了在设备中执行的用于调查所示白蛋白结合多肽PEP06923(SEQ ID NO:28)与人血清白蛋白结合的结合分析结果。
本发明现在通过随后依照实行的实验的非限制性描述被进一步阐明。除非另外指明，否则自始至终使用传统的化学和分子生物方法。
实施例
下面描述的研究的目的是能够使包含白蛋白结合结构域与酶梭菌蛋白酶(ArgC)的融合蛋白裂解，而不在白蛋白结合结构域序列内裂解蛋白。在本文，发明人设计了白蛋白结合多肽PEP07843(SEQ ID NO:27)的三种变体并且显示了，以Arg-至-Lys取代为特征的发明的变体PEP12380(SEQ ID NO:17)展示了相比于其他检测的变体关于蛋白酶稳定性和白蛋白结合活性的预料不到的优越性。
如本文使用的，术语PEPXXXX指具有46个氨基酸残基，如与本发明第一方面相关定义的，以及在N末端侧还具有GSS延伸的白蛋白结合多肽。因此除非另外指明，氨基酸位置的编号指在上述的46个氨基酸多肽中氨基酸残基的位置。
实施例1
白蛋白结合多肽变体的克隆、表达和纯化
概述
在本实施例中，来源于来自链球菌菌株G148蛋白G的GA3结构域的白蛋白结合多肽PEP07843(SEQ ID NO:27)的三种变体，通过位置23的单个Arg被另一氨基酸残基取代被创建。
三种变体如下：具有R23N取代的PEP12379(SEQ ID NO:26)、具有R23K取代的PEP12380(SEQ ID NO:17)和具有R23S取代的PEP12381(SEQ ID NO:25)。
多肽的氨基酸序列列在图1中。
ABD变体的克隆和表达
ABD变体使用基本上如WO 2012/004384中实施例1描述的标准方法在大肠杆菌中克隆和表达。
ABD变体分析
获得的ABD变体通过SDS-PAGE分析。对于SDS-PAGE分析，将来自培养物的样品和来自最后纯化的白蛋白结合多肽变体的样品与NuPAGELDS样品缓冲液(Invitrogen)混合，在70℃孵育15min并且上样到NuPAGE4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上。凝胶在使用Sharp Prestained Standard(Invitrogen)作为分子量标记物在XCell II SureLock Electrophoresis Cell(Novex)中与NuPAGE MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen)一起运行，并使用PhastGel BlueR(GE Healthcare)用于染色。
所有的ABD变体通过使用标准色谱法进行纯化，该标准色谱法通过使用基本上如WO 2012/004384中实施例1描述的亲和色谱法、反相色谱法和尺寸排阻色谱法用于缓冲液交换。
结果
通过SDS-PAGE的表达分析显示了所有ABD变体溶解，在不溶级分中没有任何量。将纯化的蛋白在溶液中于-80℃保存。冻融分析显示了所有ABD变体的良好溶解性，没有目视检测的沉淀。
实施例2
圆二色性分析
概述
在本实施例中，分析了实施例1中获得的ABD变体的二级结构，并且确定了它们的解链温度(Tm)。
ABD变体的二级结构在可变温度测量(见下面)之前和之后使用从195-250nm的扫描，通过圆二色性(CD)光谱分析。纯化的白蛋白结合多肽变体用1xPBS稀释以达到0.5mg/ml的浓度。圆二色性(CD)分析在具有1mm的最佳路径长度的小室中在Jasco J-810分光偏振计上执行。α螺旋蛋白在208和222nm显示了典型的最小值。
可变温度测量用于确定解链温度(Tm)。在这些测量中，在221nm测量从20℃至90℃下的吸光度，温度斜率为5℃/min。
结果
ABD变体的解链温度通过确定CD对温度图中的过渡中点计算。结果总结在表2中。
所有三种ABD变体显示了相比于PEP07843略低2-6℃的Tm。PEP12380显示了三种变体中最高的热稳定性(表2)。
比较热处理之前和之后的CD光谱以检测蛋白的潜在热变性。所有ABD变体在208和222nm显示了最小值，这对于α螺旋蛋白是典型的。它们还展示了热处理之前和之后相同的光谱，这表明新的ABD变体不是不可逆地变性。图2显示了新的ABD变体和PEP07843(SEQ ID NO:27)的CD光谱用于比较。
表2：ABD变体的CD分析
蛋白 Tm＊ CD光谱叠加
PEP12379 56℃ 完全可逆的
PEP12380 60℃ 完全可逆的
PEP12381 56℃ 完全可逆的
PEP07843 62℃ 完全可逆的
实施例3
梭菌蛋白酶裂解
概述
为了评价实施例1中获得的ABD变体的梭菌蛋白酶裂解，将三种新的ABD变体和对照PEP07843与梭菌蛋白酶一起孵育，并且反应在固定时间点停止。仍未裂解的ABD变体的百分比通过SDS-PAGE和LC/MS分析进行分析(实施例4)。
梭菌蛋白酶裂解
PEP07843和三种新的变体的酶消化通过使用来自Worthington(No.LS001641)的梭菌蛋白酶在25mM NaPi缓冲液pH 7.6、150mM NaCl、1mM CaAc、2.5mM DTT中执行。梭菌蛋白酶在实验开始前新溶解。
在第一实验中，0.2U梭菌蛋白酶/mg ABD变体在25℃孵育多达20小时，但是通过SDS-PAGE和LC/MS分析仅仅检测到低水平的裂解。
在接下来的实验中，梭菌蛋白酶的量增加到5U/mg ABD变体，并且样品在温控混匀器(thermomixer)中使用中度摇动600rpm在25℃下孵育0、1、2、4、6、8和22小时。
反应通过加入4x SDS样品缓冲液停止，随后在70℃孵育15min(用于SDS PAGE分析)或加入降低pH到约2的终浓度为0.3％的三氟乙酸(TFA)，并且在-80℃冷冻(用于LC/MS分析)。
对照是在没有梭菌蛋白酶下并且省略阻止梭菌蛋白酶活性的DTT的反应。
使用梭菌蛋白酶孵育多达22小时的样品的分析使用来自Invitrogen的NuPAGE 4-12％凝胶通过SDS-PAGE执行(见图3)。在图3中，泳道S表示sharp分子量标记物标准品(分子量3.5、10、15、20、30、40、50、60、80、110和160kDa)，泳道B表示使用梭菌蛋白酶但无ABD变体的空白样品，以及泳道0-22表示在以小时计的所示孵育时间获取的ABD变体样品。
结果
结果总结在表3中。
表3：SDS-PAGE分析结果
蛋白 结果
PEP12379 在4-8小时有一些裂解且22小时后大约90％裂解
PEP12380 在6-8小时有一些裂解且22小时后大约50％裂解
PEP12381 在4-8小时有一些裂解且22小时后大约100％裂解
PEP07843 2小时后大约75％裂解且在4-22小时后100％裂解
因此，梭菌蛋白酶孵育2h后，大约75％的PEP07843多肽裂解，并且孵育4-22h后，100％裂解。变体PEP12379(SEQ ID NO:26)和PEP12381(SEQ ID NO:25)二者相比于PEP07843对梭菌蛋白酶裂解更具有耐受性，但是孵育22h后，这些变体的分别大约90％和100％被消化。如通过在梭菌蛋白酶孵育22h后仅大约50％裂解的事实判断的，PEP12380(SEQ IDNO:17)显示了对裂解最高水平的耐受性。
实施例4
LC/MS分析
概述
实施例1中获得的ABD变体的梭菌蛋白酶裂解的LC/MS分析在高和低酶浓度下执行并且显示了全长肽随着时间推移的逐渐降低和降解产物随着时间推移的升高。降解产物通过质谱鉴定。
LC/MS分析通过配有API-ESI和单一四重质谱分析仪的Agilent 1100LC/MSD系统执行。10μl每一裂解混合物以0.5ml/min的流速注射到Zorbax 300SB-C8Narrow-Bore柱上(2.1x 150mm、3.5μm、AgilentTechnologies)。洗脱使用10-70％的溶液B的线性梯度以0.5ml/min进行15min。分离在30℃下执行。离子信号和吸光度在280nm和220nm下监测。
结果
图4和5显示了分别与0.2U梭菌蛋白酶/mg ABD变体一起孵育多达20h和与5U梭菌蛋白酶/mg ABD变体一起孵育多达22h的ABD变体样品的LC/MS分析。对主峰积分，并且将面积转化成在t＝0时剩余的完整ABD变体的％。
获得的结果列在表4和5中并且显示了不同梭菌蛋白酶处理时间后剩余ABD变体的％。相比于其他检测的多肽，PEP12380在低和高梭菌蛋白酶浓度下均显示了降解产物随时间推移最低的增加。
表4：LC/MS分析(0.2U梭菌蛋白酶/mg ABD变体)
时间(min) PEP07843 PEP12379 PEP12380 PEP12381
0 100 100 100 100
2 100 100 100 101
5 101 101 101 100
15 100 101 101 100
30 100 99 101 100
120 94 99 100 99
1200 54 96 100 97
表5：LC/MS分析(5U梭菌蛋白酶/mg ABD变体)
时间(h) PEP07843 PEP12379 PEP12380 PEP12381
0 100 100 100 100
1 46 92 96 91
2 15 85 93 79
4 0 71 84 60
6 0 58 77 44
8 0 47 69 31
22 0 4 30 0
图6显示了使用5U梭菌蛋白酶/mg多肽孵育至22h的PEP12380样品的典型的LC/MS色谱图。对其他ABD变体获得类似的结果。色谱图显示了全长肽随着时间推移的逐渐降低和降解产物随着时间推移的增加。
对主峰积分并且将面积转化为在t＝0时剩余的完整ABD的％。以上描述的LC/MS分析用于分析。
实施例5
Biacore分析
概述
实施例1获得的ABD变体与人血清白蛋白(HSA)、大鼠血清白蛋白(RSA)、猕猴血清白蛋白(CSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)的结合使用Biacore 2000设备通过表面离子共振分析。
材料和方法
Biacore2000仪器(GE Healthcare)上的生物传感器分析根据生产商的建议使用通过胺偶联固定到CM-5芯片表面的羧化葡聚糖层(研究级别，GE Healthcare)的HSA(Novozymes)、CSA(从猕猴血清内部纯化的)、RSA(Sigma-Aldrich，目录号A6272)和MSA(Sigma-Aldrich，目录号A3559)执行。
ABD变体用作分析物并且以三个分析物浓度(2.5、10和40nM)一式两份注射到芯片上。缔合阶段是5min，随后是至少部分地造成ABD变体的慢解离速率的长的解离阶段(60min)。但是，由于ABD变体的解离速率极其慢，使用Biacore2000用于确定包括KD值的精确动力学参数是不可能的。因此，计算的KD值可以仅仅用于在这系列实验中比较，并且不反映用于结合血清白蛋白的真实KD。因此，所有KD仅仅作为相对KD值给出。
结果使用BiaEvaluation软件(GE Healthcare)分析。将空白表面和缓冲液注射的曲线从配体表面的曲线中减去。
结果
Biacore 2000仪器具有阻碍非常高亲和力的测量的技术限制。因此，Biacore研究的目的不是确定白蛋白多肽变体对白蛋白的亲和力的精确动力学参数。但是，结果提供了这些白蛋白变体对白蛋白的相对亲和力的定量评价。减去参考平面和缓冲液注射后，曲线通过使用具有热量传递校正和具有RUmax设定为局部参数的BIAevaluation软件拟合到1:1(Langmuir)结合模型。ABD变体与HSA结合的传感图显示在图7-11中。对RSA、CSA和MSA获得类似的结果。
用于ABD变体与HSA结合的表观动力学参数(KD、ka(kon)和kd(koff))的概要信息在表6中给出。对RSA、CSA和MSA获得类似的结果。表7显示了PEP12380和PEP07843与来自不同物种的血清白蛋白的结合。对其他ABD变体获得类似的趋势。
表6：用于ABD变体与HSA结合的相对动力学参数
分析物 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
PEP12379 1.70x 106 2.36x 10-5 1.4x 10-11
PEP12380 3.48x 106 2.62x 10-5 7.5x 10-12
PEP12381 1.83x 106 3.08x 10-5 1.7x 10-11
PEP07843 4.49x 106 2.99x 10-5 6.7x 10-12
PEP06923 2.81x 107 2.99x 10-5 1.1x 10-12
表7：PEP12380和PEP07843与来自不同物种的血清白蛋白的结合(相对KD值)
白蛋白种类 PEP12380 PEP07843
KD(M) KD(M)
HSA 7.5x 10-12 6.7x 10-12
RSA 9.3x 10-12 8.2x 10-12
CSA 1.1x 10-11 9.8x 10-12
MSA 1.17x 10-10 8.7x 10-11
总之，通过以上动力学参数判断，PEP12380变体展示了与PEP07843变体相似的白蛋白结合特征，而变体PEP12379和PEP12381展示了较低的与白蛋白结合亲和力。重要地，相比于所有PEP12379、PEP12381和PEP07843，PEP12380展示了关于蛋白酶稳定性的优越性。
实施方案的逐条列表
1.白蛋白结合多肽，所述白蛋白结合多肽包括白蛋白结合基序[BM]，所述基序由以下氨基酸序列组成：
GVSDFYKKLI XaKAKTVEGVE ALKXbXcI
其中，彼此独立地，
Xa选自D和E；
Xb选自D和E；以及
Xc选自A和E。
2.根据项目1所述的白蛋白结合多肽，其中Xa是D。
3.根据任一前述项目所述的白蛋白结合多肽，其中Xb是D。
4.根据任一前述项目所述的白蛋白结合多肽，其中Xc是A。
5.根据项目1所述的白蛋白结合多肽，其中所述序列是SEQ ID NO:1。
6.根据任一前述项目所述的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的部分。
7.根据项目6所述的白蛋白结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自由细菌受体蛋白的三螺旋结构域组成的组。
8.根据项目7所述的白蛋白结合多肽，其中所述细菌受体蛋白选自由来自链球菌、消化链球菌和Finegoldia物种的白蛋白结合受体蛋白组成的组。
9.根据项目8所述的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合受体蛋白选自由蛋白G、MAG、ZAG、PPL和PAB组成的组。
10.根据项目9所述的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合受体蛋白是蛋白G。
11.根据项目10所述的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合受体蛋白是来自链球菌菌株G148的蛋白G。
12.根据项目11所述的白蛋白结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自由来自链球菌菌株G148的蛋白G的结构域GA1、结构域GA2和结构域GA3组成的组。
13.根据项目12所述的白蛋白结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域是来自链球菌菌株G148的蛋白G的结构域GA3。
14.根据项目6所述的白蛋白结合多肽，所述白蛋白结合多肽包括以下氨基酸序列：
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
其中
[BM]是项目1-5任一项中定义的白蛋白结合基序，
且，彼此独立地，
X3选自C、E、Q和S；
X6选自C、E和S；
X7选自A和S；
X10选自A、R和S；
X14选自A、C、K和S；
X43选自A和K；以及
X44选自A、E和S。
15.根据项目14所述的白蛋白结合多肽，其中X3是E。
16.根据项目14-15中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X6是E。
17.根据项目14-16中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X7是A。
18.根据项目14-17中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X10是A。
19.根据项目14-18中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X14是S。
20.根据项目14-19中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X43是A。
21.根据项目14-20中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X44是A。
22.白蛋白结合多肽，所述白蛋白结合多肽的氨基酸序列包括满足选自以下的一个定义的序列：
i)所述序列选自SEQ ID NO:9-16；
ii)所述序列是与选自SEQ ID NO:9-16的序列具有93％或更大的同一性的氨基酸序列，条件是在对应SEQ ID NO:9-16中位置23的位置处的氨基酸是K。
23.根据项目22所述的白蛋白结合多肽，所述白蛋白结合多肽的氨基酸序列包括满足选自以下的一个定义的序列：
i)所述序列是SEQ ID NO:9；
ii)所述序列是与SEQ ID NO:9具有93％或更大的同一性的氨基酸序列，条件是在对应SEQ ID NO:9中位置23的位置处的氨基酸是K。
24.根据项目14-23中任一项所述的白蛋白结合多肽，其在如项目14-23任一项中定义的多肽序列的N末端侧还包括至少一个丝氨酸残基。
25.根据项目14-24中任一项所述的白蛋白结合多肽，其在如项目14-24任一项中定义的多肽序列的N末端侧还包括甘氨酸残基。
26.根据项目24和25中任一项所述的白蛋白结合多肽，其在如项目14-25任一项中定义的多肽序列的N末端侧还包括氨基酸GSS。
27.根据项目26所述的白蛋白结合多肽，所述白蛋白结合多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:17-24。
28.根据项目27所述的白蛋白结合多肽，所述白蛋白结合多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:17。
29.根据项目14-28中任一项所述的白蛋白结合多肽，其在如项目14-28任一项中定义的多肽序列的N末端侧还包括半胱氨酸残基。
30.根据项目14-29中任一项所述的白蛋白结合多肽，其在如项目14-29任一项中定义的多肽序列的C末端侧还包括赖氨酸残基。
31.根据项目14-30中任一项所述的白蛋白结合多肽，其在如项目14-30任一项中定义的多肽序列的C末端侧还包括甘氨酸残基。
32.根据项目14-31中任一项所述的白蛋白结合多肽，其在如项目14-31任一项中定义的多肽序列的C末端侧还包括半胱氨酸残基。
33.根据任一前述项目所述的白蛋白结合多肽，所述白蛋白结合多肽包括不多于两个半胱氨酸残基。
34.根据项目33所述的白蛋白结合多肽，所述白蛋白结合多肽包括不多于一个半胱氨酸残基。
35.根据任一前述项目所述的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合多肽与白蛋白结合，使得相互作用的KD值为至多1x10-9M、例如至多1x10-10M、例如至多1x10-11M、例如至多1x10-12M、例如至多1x10-13M、例如至多1x10-14M。
36.融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物包括：
i)第一部分，所述第一部分由根据任一前述项目所述的白蛋白结合多肽组成；以及
ii)第二部分，所述第二部分由具有期望的生物活性的多肽组成。
37.根据项目36所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物活性是治疗活性。
38.根据项目36所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物活性是结合活性。
39.根据项目36所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物活性是酶活性。
40.根据项目37所述的融合蛋白或缀合物，其中具有期望的生物活性的所述第二部分是治疗活性多肽。
41.根据项目36所述的融合蛋白或缀合物，其中具有期望的生物活性的所述第二部分选自由人内源酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子组成的组。
42.根据项目41所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分选自由IL-2、GLP-1、BNP、IL-1受体拮抗剂、KGF、GH、G-CSF、CTLA-4、肌肉生长抑制素、因子VII、因子VIII、因子IX和因子X组成的组。
43.根据项目36所述的融合蛋白或缀合物，其中具有期望的生物活性的所述第二部分是非人生物活性蛋白，选自由细菌毒素、酶和活化蛋白组成的组。
44.根据项目36所述的融合蛋白或缀合物，其中具有期望的生物活性的所述第二部分是能够和靶分子选择性相互作用的结合多肽。
45.根据项目44所述的融合蛋白或缀合物，其中所述结合多肽选自由以下组成的组：抗体和大体上保留抗体结合活性的其片段和结构域；微体、maxybodies、高亲和性多聚体以及其他小的二硫化物键合的蛋白；以及源自选自由以下组成的组的支架的结合蛋白：葡萄球菌蛋白A和其结构域、其他三螺旋结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合结构域、γ晶体、绿色荧光蛋白、人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂例如Kunitz结构域、PDZ结构域、SH3结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、III型纤连蛋白结构域、转铁蛋白、锌指结构和芋螺毒素。
46.根据项目44和45中任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中所述靶分子可以选自由以下组成的组：阿尔兹海默氏病的Aβ肽；其他疾病相关的淀粉状蛋白肽；毒素，例如细菌毒素和蛇毒；凝血因子，例如血管假性血友病因子；白细胞介素，例如IL-13；肌肉生长抑制素；促炎症因子，例如TNF-α、TNF-α受体、IL-1、IL-8和IL-23；补体因子，例如C3和C5；超敏反应介质，例如组胺和IgE；肿瘤相关抗原，例如CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD52、CD70、cMet、HER1、HER2、HER3、HER4、CAIX、CEA、IL-2受体、MUC1、PSMA、TAG-72、和其他生物分子例如G-CSF、GM-CSF、GH、胰岛素和生长激素抑制素。
47.根据项目36-46中任一项所述的融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物还包括由具有另外的、期望生物活性的多肽组成的部分，所述部分可以是与第二部分相同或不同的。
48.根据项目47所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分是如项目40-43任一项中定义的，并且另外的部分是如项目44-46任一项中定义的。
50.根据项目36-49中任一项所述的缀合物，其中所述第二部分与根据项目1-35任一项中的第一部分经由例如在如项目14-35任一项中定义的第一部分的X14位置存在的任何半胱氨酸的巯基缀合。
51.根据任一前述项目所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，所述白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物还包括细胞毒性剂。
52.根据项目51所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中细胞毒性剂选自刺孢毒素、auristatin、阿霉素、美登素、紫杉醇、海鞘素、格尔德霉素、甲氨蝶呤和它们的衍生物，以及其组合。
53.根据任一前述项目所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，还包括标记物。
54.根据项目53所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述标记物选自由荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白质、酶、放射性核素和颗粒组成的组。
55.根据项目54所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，所述白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物包括由多胺多羧酸螯合剂提供的经由半胱氨酸残基的巯基或赖氨酸残基的胺基与白蛋白结合多肽缀合的螯合环境。
56.根据项目55所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中多胺多羧酸螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸或其衍生物。
57.根据项目56所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸衍生物是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-马来酰亚胺乙基乙酰胺。
58.根据项目55所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中多胺多羧酸螯合剂是1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸或其衍生物。
59.根据项目55所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中多胺多羧酸螯合剂是二乙烯三胺五乙酸或其衍生物。
60.编码根据项目1-49中任一项所述的白蛋白结合多肽或融合蛋白的多核苷酸。
61.制备根据项目1-49中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括表达根据项目60所述的多核苷酸。
62.包括根据项目60所述的多核苷酸的表达载体。
63.包括根据项目62所述的表达载体的宿主细胞。
64.制备根据项目1-49中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括
i)在允许所述多肽从所述表达载体表达的条件下培养根据项目63所述的宿主细胞；以及
ii)分离多肽。

Claims (14)

1.白蛋白结合多肽，所述白蛋白结合多肽包括白蛋白结合基序[BM]，所述基序由以下氨基酸序列组成：
GVSDFYKKLI XaKAKTVEGVE ALKXbXcI
其中，彼此独立地，
Xa选自D和E；
Xb选自D和E；以及
Xc选自A和E。
2.根据权利要求1所述的白蛋白结合多肽，其中所述序列是SEQ IDNO:1。
3.根据任一前述权利要求所述的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合基序形成三螺旋束蛋白质结构域的部分。
4.根据权利要求3所述的白蛋白结合多肽，所述白蛋白结合多肽包括以下氨基酸序列：
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
其中
[BM]是如权利要求1-2任一项中定义的白蛋白结合基序，
且，彼此独立地，
X3选自C、E、Q和S；
X6选自C、E和S；
X7选自A和S；
X10选自A、R和S；
X14选自A、C、K和S；
X43选自A和K；以及
X44选自A、E和S。
5.根据权利要求4所述的白蛋白结合多肽，所述白蛋白结合多肽的氨基酸序列包括满足选自以下的一个定义的序列：
i)所述序列选自SEQ ID NO:9-16；
ii)所述序列是与选自SEQ ID NO:9-16的序列具有93％或更大的同一性的氨基酸序列，条件是在对应SEQ ID NO:9-16中位置23的位置处的氨基酸是K。
6.根据权利要求5所述的白蛋白结合多肽，所述白蛋白结合多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:17-24，例如SEQ ID NO:17。
7.根据任一前述权利要求所述的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合多肽与白蛋白结合，使得相互作用的KD值为至多1x10-9M，例如至多1x10-10M、例如至多1x10-11M、例如至多1x10-12M、例如至多1x10-13M、例如至多1x10-14M。
8.融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物包括：
i)第一部分，所述第一部分由根据任一前述权利要求所述的白蛋白结合多肽组成；以及
ii)第二部分，所述第二部分由具有期望的生物活性的多肽组成。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白或缀合物，其中具有期望的生物活性的所述第二部分是治疗活性多肽。
10.根据权利要求8-9中任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中具有期望的生物活性的所述第二部分是能够与靶分子选择性相互作用的结合多肽。
11.根据任一前述权利要求所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，还包括标记物。
12.根据权利要求11所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述标记物选自由荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白质、酶、放射性核素和颗粒组成的组。
13.编码根据权利要求1-10中任一项所述的白蛋白结合多肽或融合蛋白的多核苷酸。
14.制备根据权利要求1-10中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括表达根据权利要求13所述的多核苷酸。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109776653A (zh) * 2018-11-26 2019-05-21 上海华新生物高技术有限公司 一种新型人血清白蛋白黏附肽及其应用
CN112789290A (zh) * 2018-08-08 2021-05-11 株式会社大熊制药 使用梭菌蛋白酶制备长效胰岛素类似物缀合物的活性形式的方法
TWI747022B (zh) * 2018-08-08 2021-11-21 南韓商大熊製藥股份有限公司 長效型胰島素類似物及其衍生物

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110437320B (zh) 2010-07-09 2023-10-20 阿菲博迪公司 多肽
US10167322B2 (en) 2013-12-20 2019-01-01 Affibody Ab Engineered albumin binding polypeptide
NZ732978A (en) 2015-01-12 2022-01-28 Affibody Ab Il-17a-binding polypeptides
KR102303744B1 (ko) * 2017-11-28 2021-09-16 주식회사 엘지화학 성장 호르몬을 포함하는 융합 단백질
US11661586B2 (en) 2017-12-04 2023-05-30 The General Hospital Corporation Extracellular redox enzyme system to alleviate disease
JP2022546525A (ja) 2019-09-02 2022-11-04 ビオテスト・アクチエンゲゼルシャフト 延長された半減期を有する第ｖｉｉｉ因子タンパク質
EP3785726A1 (en) 2019-09-02 2021-03-03 Biotest AG Factor viii protein with increased half-life
WO2021089695A1 (en) 2019-11-05 2021-05-14 Affibody Ab Polypeptides
US20230190881A1 (en) 2020-02-17 2023-06-22 Biotest Ag Subcutaneous administration of factor viii
EP4263589A1 (en) 2020-12-21 2023-10-25 Affibody AB New polypeptide
EP4291251A1 (en) 2021-02-15 2023-12-20 Affibody AB New her2-binding polypeptide
WO2023049747A1 (en) * 2021-09-22 2023-03-30 Elanco Us Inc. Streptococcus suis lytic enzyme compositions and methods of use thereof
AR128475A1 (es) 2022-02-08 2024-05-15 Affibody Ab Polipéptidos y proteínas de fusión con afinidad de unión por tslp

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101765608A (zh) * 2007-07-31 2010-06-30 阿菲博迪公司 新组合物、方法及应用
WO2012004384A2 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Affibody Ab Polypeptides
WO2012050930A2 (en) * 2010-09-28 2012-04-19 Amylin Pharmaceuticals, Inc Engineered polypeptides having enhanced duration of action

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US6362225B1 (en) 1999-01-21 2002-03-26 George Andreakos Target therapies for treating common viral infections
US20040001827A1 (en) 2002-06-28 2004-01-01 Dennis Mark S. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
ATE422369T1 (de) 1999-12-24 2009-02-15 Genentech Inc Verfahren und zusammensetzungen zur verlängerung der entsorgungshalbwertszeit von biowirksamen verbindungen
US7288265B1 (en) 2000-10-16 2007-10-30 Lectec Corporation Treating viral infection at smallpox vaccination site
US7316819B2 (en) 2001-03-08 2008-01-08 Unigene Laboratories, Inc. Oral peptide pharmaceutical dosage form and method of production
US7772188B2 (en) 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
US8008255B2 (en) 2003-05-30 2011-08-30 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for enhanced transmucosal delivery of peptides and proteins
US20050282756A1 (en) 2004-06-18 2005-12-22 Mehta Nozer M Oral delivery of peptide pharmaceutical compositions
US8093207B2 (en) 2005-12-09 2012-01-10 Unigene Laboratories, Inc. Fast-acting oral peptide pharmaceutical products
AU2007284801A1 (en) 2006-08-08 2008-02-21 The Regents Of The University Of Californina Salicylanilides enhance oral delivery of therapeutic peptides
EP2086998B1 (en) 2006-10-11 2011-12-07 Ablynx N.V. Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the ph, compounds comprising the same, and use thereof
GB0724331D0 (en) * 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
EP2077272A1 (en) 2007-12-21 2009-07-08 Affibody AB Polypeptide libraries with a predetermined scaffold
CA3083698A1 (en) 2008-03-26 2009-10-01 Oramed Ltd. Methods and compositions comprising serpin(s) for oral administration of protein
CN101294187B (zh) 2008-06-06 2013-07-31 暨南大学 一种缓释生物活性多肽的方法与应用
CN102123697B (zh) 2008-08-18 2015-06-10 安特拉贝欧有限公司 用于口服给予蛋白质的方法和组合物
WO2010054699A1 (en) 2008-11-17 2010-05-20 Affibody Ab Conjugates of albumin binding domain
ES2548030T3 (es) 2009-06-01 2015-10-13 Medimmune, Llc Moléculas con semividas prolongadas y usos de las mismas
US20120027058A1 (en) 2010-07-29 2012-02-02 The Regents Of The University Of Michigan Portable, wireless multi-channel impedance analyzer
EP2670418A4 (en) 2011-02-04 2015-06-17 Aegis Therapeutics Llc ORAL BIO-AVAILABLE PEPTIDARY MATERIAL COMPOSITIONS AND METHOD THEREFOR
US20140256621A1 (en) * 2011-07-08 2014-09-11 Astrazeneca Pharmaceuticals Lp Engineered poypeptides having enhanced duration of action and reduced immunogenicity
KR20210075191A (ko) 2012-03-28 2021-06-22 애피바디 에이비 경구투여
US10167322B2 (en) 2013-12-20 2019-01-01 Affibody Ab Engineered albumin binding polypeptide

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101765608A (zh) * 2007-07-31 2010-06-30 阿菲博迪公司 新组合物、方法及应用
WO2012004384A2 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Affibody Ab Polypeptides
WO2012050930A2 (en) * 2010-09-28 2012-04-19 Amylin Pharmaceuticals, Inc Engineered polypeptides having enhanced duration of action

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112789290A (zh) * 2018-08-08 2021-05-11 株式会社大熊制药 使用梭菌蛋白酶制备长效胰岛素类似物缀合物的活性形式的方法
TWI747022B (zh) * 2018-08-08 2021-11-21 南韓商大熊製藥股份有限公司 長效型胰島素類似物及其衍生物
CN112789290B (zh) * 2018-08-08 2024-05-17 株式会社大熊制药 使用梭菌蛋白酶制备长效胰岛素类似物缀合物的活性形式的方法
CN109776653A (zh) * 2018-11-26 2019-05-21 上海华新生物高技术有限公司 一种新型人血清白蛋白黏附肽及其应用
CN109776653B (zh) * 2018-11-26 2022-05-17 上海华新生物高技术有限公司 一种人血清白蛋白黏附肽及其应用

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