CN104655471A - 使用释放醛类的含氮化合物固定组织样本 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用释放醛类的含氮化合物固定组织样本。提出用于固定至少一种组织样本的方法，该方法使用组织处理机进行且其中将至少一种组织样本在第一温度水平和第一压力水平下引入包含能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的固定试剂，至少一种组织样本在固定试剂中停留至少固定时间段。将引入至少一种组织样本的固定试剂在固定时间段内带至高于第一温度水平的第二温度水平和/或高于第一压力水平的第二压力水平。使用组织处理机的至少一个浓度测量装置确定固定试剂中能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的浓度，基于至少一个浓度测量装置的测量值输出信号。本发明还涉及对应的组织处理机。

Description

使用释放醛类的含氮化合物固定组织样本

技术领域

本发明涉及一种用于固定组织样本的方法和组织处理机。

背景技术

使用甲醛水溶液固定组织样本的方法已经已知了一段时间。

具有37重量％的甲醛或40体积％的甲醛的饱和甲醛水溶液也称为“福尔马林”。用于固定组织样本的、关于甲醛溶液的浓度的指示典型地参考这个。例如，“10％福尔马林”溶液包含4体积％的甲醛。

在水溶液中，甲醛快速水合为甲二醇，而甲二醇与被固定的组织中的大分子(诸如蛋白质类和糖蛋白类)反应。首先发生的是在适当胺基团、酰胺基团和反应醇基团等上形成羟甲基基团。唯有使用更长固定时间，这些羟甲基基团才交联到合适程度。

甲醛还与细胞核中的蛋白质类反应，由此稳定核酸类的蛋白鞘。核酸类自身的游离氨基基团还可与甲醛反应，如不饱和脂肪酸类中的双键和硫醇基团。另一方面，纯碳水化合物通常不与甲醛反应。

肽类和蛋白质类的与甲二醇最强烈反应且因此对甲醛固定的响应最好的反应基团为赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸和酪氨酸的胺基团以及丝氨酸和苏氨酸的羟基基团。所谓的“过度固定”(硬化(tanning))的结果是赖氨酸的交联和蛋白质的骨架的酰胺类的交联。由于现在典型使用更短的固定时间，这样的反应很少发生。

甲醛具有良好的固定特征，但是对健康有很高的危险，且当暴露时，可导致皮肤、呼吸道和眼睛的过敏和刺激。另外，甲醛被认为是致癌物质。因此人们努力将甲醛用危害更小的用于固定组织样本的化合物代替。对其他固定试剂(诸如戊二醛和四氧化锇)也是如此。

在这点上，可能的是使用释放适当醛类、特别是甲醛的化合物。其一个例子是乌洛托品。这样的化合物的使用是已知的，例如，来自EP 1 895 287 B1(DE 10 2006 040 315 B4,US7,915,007 B2)。其还被称为各种醛类的“释放体”或“给体”。

醛释放化合物的使用的缺点在于：在平衡反应中，其通常仅释放组织样本反应消耗的量的甲醛。与常规福尔马林溶液(其中甲醛或其水合产物甲二醇过量)相比，固定速度因此相对慢。使用对应给体的固定方法因此存在缺点，虽然使用更简单且减少了健康危害。

因此需要改进，特别是用于使用释放醛类的化合物固定组织样本的加速性能。

发明内容

根据以上观点，本发明提出了一种用于固定组织样本的方法和组织处理机。

本发明提供了一种用于固定至少一种组织样本的方法，所述方法使用组织处理机进行且所述方法中将所述至少一种组织样本在第一温度水平和第一压力水平下引入包含能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的固定试剂，所述至少一种组织样本在所述固定试剂中停留至少固定时间段，其中将其中引入了所述至少一种组织样本的所述固定试剂在所述固定时间段内带至高于所述第一温度水平的第二温度水平和/或高于所述第一压力水平的第二压力水平；和使用所述组织处理机的至少一个浓度测量装置来确定所述固定试剂中能够依赖压力和/或温度释放所述至少一种醛的所述至少一种含氮化合物的浓度，且基于所述至少一个浓度测量装置的测量值输出信号。

本发明还提供了一种组织处理机，所述组织处理机具有至少一个处理室，所述处理室构造为容纳具有引入至固定试剂中的至少一种组织样本的样本容器，所述固定试剂包含能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物，其特征为构造为进行根据本发明实施例的用于固定至少一种组织样本的方法的工具，所述工具包括至少一个浓度测量装置，所述至少一个浓度测量装置构造为确定所述固定试剂中能够依赖压力和/或温度释放所述至少一种醛的所述至少一种含氮化合物的浓度和基于所述至少一个浓度测量装置的测量值输出信号。

在本发明的特征和优点的说明之前，将说明其原则和术语。

为了表征压力和温度，本发明使用术语“压力水平”和“温度水平”，其用于表达的事实是，在本发明的情况下，对应的压力和温度不需要以准确压力值和温度值的形式来分别使用以实现本发明的构思。这样的压力和温度反而在特定范围内波动，该特定范围，例如，大于或低于平均值的1％、5％、10％、20％或50％。特别地，例如，压力水平包括不可避免的或期望的压力损失，例如由于冷却作用。温度水平也是如此。本发明以kPa表示的压力为高于大气压的压力。

“能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的化合物”在本申请中理解为在适当溶剂且与所述溶剂相互作用(特别是平衡反应)中形成至少一种醛作为产物的化合物。能够依赖温度和/或压力释放至少一种醛的化合物代表对应平衡反应的离析物。在本发明的情况下，特别地使用对应平衡反应位于离析物侧的这些化合物，即本身能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的化合物。这样的化合物在溶剂中总是形成量为其从反应体系中被取走的量的至少一种醛。如前面提到的，对应的反应原则上已知为用于固定组织样本。

当前面提到的平衡的中心点和/或反应速率可通过压力和/或温度的改变被影响为朝向产物或离析物时，释放是依赖压力和/或温度的。本发明的情况下，相关的化合物特别为至少一种醛的形成可通过温度和/或压力的提高而被加速或增加的化合物。

如以下还进一步说明地，对应的含氮化合物特别是通过形成氨和对应的至少一种醛的络合物而形成。这些含氮化合物因此不是对应醛类的纯缩合产物和/或水合产物。特别地，由此不包含诸如甲二醇的水合反应形成的化合物或诸如多聚甲醛的聚合产物。

发明的优点

本发明涉及用于固定至少一种组织样本的方法，该方法使用组织处理机进行，在该方法中在第一温度水平和第一压力水平下将至少一种组织样本引入固定试剂。固定试剂包含能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物，如上所述。如在常规固定方法的情况下的，本发明中将至少一种组织样本在固定试剂中也停留至少固定时间段。

根据本发明提供的是，将其中引入了至少一种组织样本的固定试剂在固定时间段内带至高于第一温度水平的第二温度水平和/或高于第一压力水平的第二压力水平。本发明另外提供的是，固定试剂中能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的浓度使用组织处理机的至少一个浓度测量装置来确定，且基于该至少一个浓度测量装置的测量值输出信号。

因此，本发明的本质为通过压力和/或温度的应用以受控的方式从对应给体中释放至少一种醛的方法。与现有技术相比本发明的重要优点是，受控条件(例如组织处理机的封闭反应室内部)下对应醛的可控的释放。压力和/或温度的对应应用下，对应化合物以放大的方式释放至少一种醛。化合物通过，例如通过一种或多种中间体，分解为至少一种醛和氨。

在没有压力和/或温度的对应应用的情况下，该至少一种醛不会定量释放且能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的含氮化合物的分子结构非常稳定。对应化合物最好的分解程度是该至少一种醛被至少一种组织样本消耗掉。

在没有压力和/或温度的对应应用的情况下，与前面说明的常规福尔马林溶液相比固定速度因此相对低。与常规福尔马林固定对应的反应速度或固定速度仅因为由于压力和/或温度的应用的释放而获得。这另外消除了使用能够释放醛类的含氮化合物的已知现有技术的重要缺点。在该常规方法中，如果固定太慢，存在所谓的“欠固定”的风险，这可导致自溶。

与用于福尔马林固定的常规方法相比，根据本发明提供的方法此外还适用于当使用醛固定时明显降低以上提到的健康风险。当根据本发明在固定试剂中使用能够释放甲醛的含氮化合物时，常规福尔马林固定方法的大部分可通过提出的方法再现。根据本发明进行的至少一种醛的受控释放还优选是可逆的，即在低于第二温度水平和/或第二压力水平的更低压力和更低温度下，能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的含氮化合物可再次形成。游离醛的浓度由于平衡反应的移动而降低。这使将对应固定试剂存储在组织处理机和/或存储容器中而不危害操作者的健康和固定之后经济地再生固定试剂是可能的。

如提到的，甲二醇为释放甲醛的水合产物。在对应形成甲二醇的常规福尔马林固定中，甲醛作为气体被直接引入水中。然而，在本发明的情况下使用的能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的含氮化合物作为类似盐的物质引入水中，但是开始时具有非常小的醛释放作用，或没有这样的作用。其(特别是低pH时)仅与消费者协同时才释放醛且在水中形成例如甲二醇。对应水合产物因此以二级方式制备。其结果是，本发明的情况下至少两种平衡反应(不包括中间体的反应)有利地组合，仅后一个平衡反应确保以常规福尔马林的方式固定。

能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的含氮化合物因此仅因为压力和温度被分为中间体和最终产物。此外，温度和压力的增加可有利地促进或影响实际的福尔马林固定。在约20℃之下，甲二醇在没有部分进料的情况下存在。以这种形式，其可比进给形式更容易地渗入组织。20℃之上，进给形式更普遍。仅在后一种形式下，与蛋白质类的反应发生至合适的程度。

至少一种组织样本的均匀固定通过固定试剂完全渗入至少一种组织样本来达到。该渗入可在第二压力水平和/或第二温度水平的必要压力和/或必要温度的应用之前或应用过程中达到。本发明中有利的是使用最长时间，例如一小时，因为否则可发生自溶。

根据本发明的方法有利地能够实现三步固定。首先将至少一种组织样本的组织全部或部分渗透。然后至少一种醛通过应用压力和/或温度而释放，且固定发生。固定之后，将固定试剂除去，例如抽回存储容器，在存储容器中固定试剂例如被冷却和/或减压且因此再次变为无害的。

至少一种醛的消耗导致固定试剂随着时间变为废弃的，使得其固定作用消失。在常规福尔马林溶液中，甲醛的出气被另外观察和/或甲醛通过大气中的氧气氧化为甲酸。甲醛的出气此外导致对使用者的潜在危害。根据本发明的释放醛类的含氮化合物也是如此，但是仅仅无疑更小的程度。甲醛浓度因此连续降低，甚至在没有固定反应的情况下。

因为在本发明的情况下固定试剂中包含的、能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的仅特定部分在固定时以受控的方式释放，固定试剂可特别有利地重复使用。特别有利的是确定根据本发明提供的该化合物的浓度，因为这允许可靠地确定该化合物是否仍以对另外固定操作而言足够的浓度存在。不正确的固定，即以上说明的过度固定或欠固定，由此可以可靠地避免。

浓度可在固定之前、过程中或之后确定。为了提供包含能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的固定试剂或其组分，可能的是，例如使用包括明确标识特征的、特别适用于组织处理机的储存容器(药盒或曲颈甑)。将其中对应标识特征还可以防止误操作的方式(例如通过使用RFID或NFD芯片或条形码中的加密码)实施的该储存容器引入组织处理机。在组织处理机中，可能的是，基于标识特征确定在储存容器中对应浓度是否已经被确定过一次。如果是，组织处理机“知道”固定试剂是否仍适于另外固定。当对应容器第一次使用时，将该容器明确分配给特定组织处理机也可实现，使得不再可能在另一个组织处理机中使用该容器。由此可避免有意或无意的误处理或不正确操作，且保证可靠的固定。

对应容器还可包括，例如(例如可写存储芯片形式的)存储工具，其允许组织处理机确定的能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种化合物的浓度被存储。组织处理机可例如在固定操作结束时确定该浓度且将其存储在容器的存储工具中。对应容器因此还可用在能够读出存储工具的另一个组织处理机中。

确定能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的浓度也是特别有利的，因为根据确定的浓度，例如根据本发明的固定操作使用的固定时间和/或压力和/或根据本发明的固定操作使用的温度可调节。例如，固定试剂的重复使用之后，对应化合物的浓度可降低，使得需要更长固定时间和/或改变对应压力值和/或温度值。如果浓度在固定操作之前被确定或如说明地是已知的(例如来自前面的固定操作，例如与储存容器相关联或存储在对应储存容器的存储工具中)，对应的调节可特别简单地进行。

固定过程中，确定能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的浓度是特别有利的，因为通过每种情况下消耗的化合物推出固定操作本身的成功是可能的。例如，固定可进行，直到观察到浓度降低了预定值。这允许的推断是，特定量的该至少一种醛已经被释放且因此至少部分进入待固定的样本中。

在本发明的情况下，对应的组织处理机可使用防止误处理方式中永久限定的阈值或可限定的阈值操作。例如，可提供的是，当能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的浓度低于该阈值时，组织处理机不再进行固定且由此鼓励使用者更换固定试剂或对应组分。

组织处理机还可构造为基于根据本发明输出的信号(例如诸如监控器的输出单元上输出的信号)通知使用者，使得使用者例如总是知道存在的浓度和/或时间和/或固定试剂仍然足够的固定操作的数量。

在本发明的情况下提出的是使用室温(即，例如在20℃至25℃范围内的温度)和/或冷存储温度(即，例如在0℃至10℃范围内或在-25℃至-15℃范围内)作为第一温度水平，且使用高于对应温度的温度(特别是高于室温的温度，例如在20℃至80℃范围内的温度)作为第二温度水平。由于使用与能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的含氮化合物分别适应的对应温度水平，或反之亦然，对应固定试剂可被安全地处理。

根据本发明有利地使用的压力水平也是如此，例如，第一压力水平特别是大气压或甚至更低，后者例如用于组织样本的真空渗入；且第二压力水平与高于大气压的压力水平对应。例如，5kPa至1000kPa范围内的表压、例如5kPa至20kPa范围内的表压、20kPa至50kPa范围内的表压、50kPa至100kPa范围内的表压、100kPa至500kPa范围内的表压或500kPa至1000kPa范围内的表压可用作高于大气压的压力水平。在提高的温度和压力下，本发明的情况下使用的、能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的含氮化合物的化学平衡位于醛侧。

氨与至少一种醛的反应产物在本发明的情况下特别用作能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的含氮化合物。该至少一种醛为甲醛和/或戊二醛或其他醛类。诸如乌洛托品、三嗪类、二羟甲基二羟基乙烯脲、单羟甲基三聚氰胺、二羟甲基三聚氰胺、三羟甲基三聚氰胺、四羟甲基三聚氰胺、五羟甲基三聚氰胺、六羟甲基三聚氰胺、四羟甲基乙炔二脲、二羟甲基丙烯脲、乙酰胍胺和/或5,5-二甲基乙内酰脲特别适于本发明提出的方法。这些为所谓的甲醛释放体。

以下将使用乌洛托品(六亚甲基四胺)的例子说明甲醛的释放，但是其可对应适用于另外化合物。在更高温度下，以下表示的等式中的化学平衡在甲醛+氨侧(反应箭头的左侧)。这的结果是乌洛托品(反应箭头的右侧)分解，形成中间体，且被消耗。

甲醛释放在pH为约3的弱酸性水溶液中被促进。各种羧酸(例如柠檬酸、乙酸和草酸)，还有无机酸(诸如硼酸和磷酸)促进了甲醛的释放。

相对低的酸强度(即pKs值低于6.4)对保存固定中的组织样本的组织是重要的。这类酸另外加速了固定。适当的pH可在2至4范围内。

为了辅助对应组织样本的渗入，有利的是使用包含5％至50％范围内的至少一种醇(例如乙醇)的固定试剂。醇的使用降低了固定试剂的表面张力和其粘度。

本发明的情况下，特别有利的是，如果以上说明的方法使用组织处理机进行，将具有其中引入了至少一种组织样本的固定试剂在固定时间段内至少间歇地引入组织处理机的处理室，且在处理室中将固定试剂带至第二温度水平和/或第二压力水平。如说明的，组织处理机的使用允许在封闭空间中固定且因此避免对人员的危害。

以上说明对改进本发明提出的组织处理机以相同的方式适用，该组织处理机包含至少一个处理室，处理室构造为容纳具有引入固定试剂中的至少一个组织样本的样本容器，该固定试剂包含重复说明的能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物。根据本发明，这类组织处理机装备有使其能够进行前面说明的方法的工具。组织处理机包含至少一个浓度测量装置，至少一个浓度测量装置构造为确定固定试剂中能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的浓度和基于此输出对应信号。

附图说明

本发明以下基于示例性实施例在附图中示意性地示出且将参考附图详细地描述。

图1以简化示意性流程图的方式说明了根据本发明的实施例的方法。

图2以简化示意性图示的方式说明了根据本发明的实施例的组织处理机。

具体实施方式

在图1中，以示意性流程图的方式示出了根据本发明的实施例的方法，且其整体标记为100。如前面说明的，该方法以三步固定操作的方式进行且包含步骤110、步骤120和步骤130。

在步骤110中，将至少一种组织样本引入固定试剂，如前面重复说明的。在步骤110中，有利地进行将至少一种组织样本用固定试剂渗入，例如通过真空渗入。已经在步骤110中的，可将适当容器中的固定试剂中的组织样本引入组织处理机。在步骤110中，该至少一种组织样本在固定试剂中在第一温度水平和第一压力水平下。

在接着步骤110的步骤120中，将该至少一种组织样本放在固定试剂中至少一个固定时间段。在步骤120中，其中引入了至少一种组织样本的固定试剂特别地在前述固定试剂段内(例如在组织处理机的固定室中)带至高于第一温度水平的第二温度水平和/或高于第一压力水平的第二压力水平。基于前面说明的反应原则的组织样本的实际固定因此在步骤120中发生。

在接着步骤120的步骤130中，固定终止。前面建立的第二温度水平和/或前面建立的第二压力水平降低，例如，至步骤110中存在的第一温度水平和/或第一压力水平。至少一种醛从固定试剂和其中包含的能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的含氮化合物中的释放因此终止。在步骤130中，可能存在的任何气态醛可从方法100中使用的组织处理机的固定室中提取。固定试剂(其中至少一种醛的不另外释放现在发生至合适程度)现在可抽离且例如转移至储存罐。

前述步骤之前、过程中和/或之后，固定试剂中能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的浓度可使用使用的组织处理机的至少一个浓度测量装置来确定，且可基于至少一个浓度测量装置的测量值输出信号。

在图2中，根据本发明的组织处理机被示意性地示出且标记为10。在示出的示例中，组织处理机10包含样本容器11，其中，如图2所示出的，四个组织样本1(仅部分标记)被引入固定试剂2中。提供具有泵(分别未被标记)的适当流体管线11a和具有泵(分别未被标记)的适当流体管线11b用于将固定试剂引入样本容器11和将固定试剂从样本容器11中移除。管线11a和管线11b与储存容器13连接。

与储存容器13相关联的是浓度测量装置14，浓度测量装置14构造为例如使用分光光度法确定固定试剂2中能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的浓度。通过浓度测量装置14可输出信号，例如，至构造为操作组织处理机10的用户接口20。

组织处理机10包括处理室12，样本容器11可被引入处理室12。处理室12可有利地关闭，使得至少一种醛可能被释放的重复提到的固定时间段内不伤害用户是可能的。处理室12还可连接至吸气装置(未示出)。

组织处理机10另外包含工具15和工具16，工具15和工具16构造为将压力和/或温度应用至处理室12，例如压力泵15和加热线圈16。

Claims (11)

1.一种用于固定至少一种组织样本(1)的方法(100)，所述方法使用组织处理机(10)进行且所述方法中将所述至少一种组织样本(1)在第一温度水平和第一压力水平下引入包含能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物的固定试剂(2)，所述至少一种组织样本(1)在所述固定试剂(2)中停留至少固定时间段，

其中将其中引入了所述至少一种组织样本(1)的所述固定试剂(2)在所述固定时间段内带至高于所述第一温度水平的第二温度水平和/或高于所述第一压力水平的第二压力水平；和使用所述组织处理机(10)的至少一个浓度测量装置(14)来确定所述固定试剂(2)中能够依赖压力和/或温度释放所述至少一种醛的所述至少一种含氮化合物的浓度，且基于所述至少一个浓度测量装置(14)的测量值输出信号。

2.根据权利要求1所述的方法(100)，其中所述第一温度与室温和/或冷存储温度对应，且所述第二温度在20℃至80℃范围内。

3.根据权利要求1或2所述的方法(100)，其中所述第一压力水平最大与大气压对应且所述第二压力水平与高于大气压的压力水平对应。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法(100)，其中能够依赖压力和/或温度释放所述至少一种醛的所述至少一种含氮化合物包含氨与至少一种醛的至少一种反应产物。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法(100)，其中所述至少一种醛包含甲醛和/或戊二醛。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法(100)，其中能够依赖压力和/或温度释放所述至少一种醛的所述至少一种含氮化合物包含乌洛托品、至少一种三嗪、二羟甲基二羟基乙烯脲、单羟甲基三聚氰胺、二羟甲基三聚氰胺、三羟甲基三聚氰胺、四羟甲基三聚氰胺、五羟甲基三聚氰胺、六羟甲基三聚氰胺、四羟甲基乙炔二脲、二羟甲基丙烯脲、乙酰胍胺和/或5,5-二甲基乙内酰脲。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法(100)，其中所述固定试剂包含pKs值小于6.4和/或pH在2至4范围内的至少一种酸。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法(100)，其中所述固定试剂包含5％至50％范围内的至少一种醇。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法(100)，其中将引入了所述至少一种组织样本(1)的所述固定试剂(2)在所述固定时间段内至少间歇引入所述组织处理机(10)的处理室(12)且在所述处理室(12)内将所述固定试剂(2)带至所述第二温度水平和/或所述第二压力水平。

10.一种组织处理机(10)，所述组织处理机(10)具有至少一个处理室(12)，所述处理室(12)构造为容纳具有引入至固定试剂(2)中的至少一种组织样本(1)的样本容器(11)，所述固定试剂(2)包含能够依赖压力和/或温度释放至少一种醛的至少一种含氮化合物，其特征为构造为进行根据权利要求1至9中任一项所述的方法的工具(13至16)，所述工具(13至16)包括至少一个浓度测量装置(14)，所述至少一个浓度测量装置(14)构造为确定所述固定试剂(2)中能够依赖压力和/或温度释放所述至少一种醛的所述至少一种含氮化合物的浓度和基于所述至少一个浓度测量装置(14)的测量值输出信号。

11.根据权利要求10所述的组织处理机(10)，所述组织处理机(10)包括构造为将压力和/或温度应用至所述至少一个处理室(12)的工具(15、16)。