CN114942295B - 一种化妆品中总亚硝胺的提取方法及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种化妆品中总亚硝胺的提取方法及检测方法；提取方法步骤包括：精密称取所述化妆品0.5g～1.0g，加入0.05g/mL～0.15g/mL的氨基磺酸水溶液50μL～150μL以及四氢呋喃1mL～3mL后，涡旋振荡1min～3min；加入水‑甲醇‑乙腈‑四氢呋喃混合液至总体积为9mL，涡旋振荡1min～3min后，于30℃～50℃超声处理20min～40min，冷却至室温；加水‑甲醇‑乙腈‑四氢呋喃混合液至总体积为10mL，涡旋振荡1min～3min后，于5000r/min～14000r/min离心处理5min～10min，取上清液即得；本发明的方法提取总亚硝胺的速度快，提取率高，操作简便，覆盖的亚硝胺种类广，可以满足《化妆品安全技术规范》中亚硝胺总量的检测需求，具有广阔的应用前景和市场潜力。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品检测分析领域，尤其涉及一种化妆品中总亚硝胺的提取方法及检测方法。
背景技术
亚硝胺是一类具有强致癌性的化合物，我国、欧盟等国家和地区均明确将亚硝胺列为化妆品禁用原料。化妆品原料复杂，一些胺类原料易被亚硝化，因此需要严格控制化妆品原料及其产品中的亚硝胺含量。目前我国《化妆品安全技术规范》规定含有烷胺、烷醇胺等胺类物质的原料应避免形成亚硝胺，且产品中亚硝胺总量不得超过50μg/kg。据文献报道，一些防晒霜、护肤产品检出了亚硝胺类物质，因此，有必要对化妆品中的亚硝胺含量进行控制，且应针对总量进行检测。
膏霜乳液类化妆品是化妆品的一大类别，目前已检出亚硝胺，且膏霜乳液类化妆品基质成分复杂，含有油脂类、蜡类、乳化剂、保湿剂、流变调节剂、功效物质、防腐剂和抗氧化剂等成分，这些成分的理化性质差异较大，有的含量较高，有的工艺复杂，可能阻碍亚硝胺的提取。故提取总亚硝胺时需要对化妆品的基质进行有效地溶解或溶散，使基质中的亚硝胺可以充分地与提取溶剂接触，继而溶解，随后采用仪器进行测定。因此，有必要针对膏霜乳液类化妆品中总亚硝胺的提取方法进行研究。
化妆品中的亚硝胺一方面来自原料，另一方面是在化妆品生产和放置过程中由原料经亚硝化反应生成。亚硝胺一般在酸性条件下形成，但研究表明，化妆品中的亚硝胺能在中性或碱性条件下，在甲醛催化下由亚硝化剂与胺类物质反应生成；化妆品中的一些防腐剂，例如双羟基咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、DMDM己内酰脲等都能释放出甲醛。目前我国已使用化妆品原料众多，其中很多原料中含有可被亚硝化的胺类物质，同时化妆品中也存在大量潜在的亚硝化试剂，其主要来源于经亚硝酸盐防锈处理的储料桶、原料中的杂质以及原料本身。氮的氧化也是另一个潜在的亚硝化试剂来源。因此，可能形成的亚硝胺种类繁多，理化性质各异，在共同提取时存在一定的难度。例如在防晒霜中检出防晒剂二甲基PABA乙基己酯的亚硝化产物——4-(N-甲基-N-亚硝胺)苯甲酸2-乙基己基酯，该亚硝化物极性较弱。有的化妆品检出N-亚硝基二乙醇胺，极性较强。不同极性的亚硝胺在同时提取时可能存在提取溶液分层、提取不完全等问题。
近几年国内外关于化妆品中亚硝胺的检测方法主要有气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等；这些方法仅针对化妆品中的十多种已知亚硝胺进行检测，不能用来提取并检测其余潜在的亚硝胺；目前尚未见到国内关于化妆品中总亚硝胺的提取方法及检测报道。
因此，亟需一种化妆品中总亚硝胺的提取方法及检测方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种化妆品中总亚硝胺的提取方法及检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一方面是提供一种化妆品中总亚硝胺的提取方法，步骤包括：
精密称取所述化妆品0.5g～1.0g，加入0.05g/mL～0.15g/mL的氨基磺酸水溶液50μL～150μL以及四氢呋喃1mL～3mL后，涡旋振荡1min～3min；
加入体积比为1:1:1:1的水-甲醇-乙腈-四氢呋喃混合液至总体积为9mL，涡旋振荡1min～3min后，于30℃～50℃超声处理20min～40min，冷却至室温；
加入体积比为1:1:1:1的水-甲醇-乙腈-四氢呋喃混合液至总体积为10mL，涡旋振荡1min～3min后，于5000r/min～14000r/min离心处理5min～10min，取上清液即得。
优选地，所述化妆品为膏霜乳液类化妆品。
优选地，所述超声处理的工作频率为20KHz～43KHz，200W。
本发明的第二方面是提供一种基于上述提取方法的化妆品中总亚硝胺检测方法，步骤包括：
通过如上述任一项所述提取方法，提取所述化妆品中的总亚硝胺，并制得供试品溶液；
制备梯度浓度的标准品溶液；
分别对所述梯度浓度的标准品溶液进行化学反应-热能分析，并绘制标准曲线；对所述供试品溶液进行化学反应-热能分析，并根据所述标准曲线计算所述供试品溶液中总亚硝胺的浓度，即可计算获得所述化妆品中总亚硝胺的浓度；
所述化学反应-热能分析中，反应液为乙酸乙酯与氢溴酸水溶液的混合液；氮气压力为1psi～10psi；加热温度为80℃～90℃；系统真空度为1torr～2torr；冷却液为乙二醇水溶液；所述冷却液的温度为-20℃～-10℃；进样体积为50μL～100μL。
优选地，所述梯度浓度的标准品溶液制备步骤包括：
精密称取N-亚硝基二正丙胺标准品10.17mg，溶于四氢呋喃中，并稀释至10mL，制得N-亚硝基二正丙胺浓度为1.017mg/mL的标准储备溶液；
准确吸取所述标准储备溶液30μL，加入四氢呋喃，并稀释至10mL，制得N-亚硝基二正丙胺浓度为3.051μg/mL的标准工作溶液，所述标准工作溶液的浓度以N-NO计为1.0μg/mL；
准确吸取所述标准工作溶液20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1000μL以及2000μL，分别加入0.1g/mL氨基磺酸水溶液100μL后，加入四氢呋喃稀释至10mL，即制得梯度浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的标准品溶液。
优选地，所述反应液中乙酸乙酯与氢溴酸水溶液的体积比为(20～30):(0.1～0.5)。
更优选地，所述氢溴酸水溶液中氢溴酸的体积分数为30％-50％。
优选地，所述乙二醇水溶液中乙二醇的体积分数为40％～60％。
化妆品中总亚硝胺的检测原理如下：
氢溴酸与亚硝胺(R2NNO，R为H或烃基)中的N-NO基团发生反应，使N-NO脱去NO，NO与臭氧发生反应，生成激发态的*NO2，*NO2衰变发射出特征辐射，发射强度与亚硝胺的浓度成正比，反应方程式如下：
NO+O3→*NO2+O2
*NO2→NO2+hv；
亚硝酸酯和无机亚硝酸盐可与氢溴酸反应，产生NO，从而干扰亚硝胺的测定，但亚硝酸酯和无机亚硝酸盐(RONO)可与氨基磺酸(分子式：H2NSO3H)迅速反应，反应产物不干扰亚硝胺的测定，反应方程式如下：
RONO+H2NSO3H→N2+ROH+H2SO4。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明中的四氢呋喃用于膏霜乳液类中油脂类、蜡类及极性较弱成分的溶解或溶散，有着低毒、低沸点、流动性好的特点，水、甲醇和乙腈均能有效弥补四氢呋喃的不足，增加极性成分的溶解性，另外，水、甲醇、乙腈以及四氢呋喃四种溶剂之间可互溶，不会导致提取液分层，利于后续仪器分析；本发明的方法提取总亚硝胺的速度快，提取率高，操作简便，覆盖的亚硝胺种类广，可以满足《化妆品安全技术规范》中亚硝胺总量的检测需求，具有广阔的应用前景和市场潜力。
附图说明
图1为本发明中化学反应-热能分析所采用的装置示意图；
图2为浓度为20ng/mL的N-NO标准溶液图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1
本实施例提供了一种膏霜乳液类化妆品中总亚硝胺的提取及检测方法；
自制一种水包油型润肤霜化妆品，使其含有不同理化性质的亚硝胺，分别为含有N-亚硝基二乙醇胺、N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二正丁胺、N-亚硝基二苯胺各200μg/kg(均以N-NO计)；取该自制阳性样品，对其中的总亚硝胺进行提取和检测；
提取步骤包括：
精密称取所述化妆品1.0g，加入0.1g/mL的氨基磺酸水溶液100μL以及四氢呋喃2mL后，涡旋振荡3min；加入体积比为1:1:1:1的水-甲醇-乙腈-四氢呋喃混合液至总体积为9mL，涡旋振荡3min后，于40℃超声处理30min(工作频率为35KHz，200W)，冷却至室温；加体积比为1:1:1:1的水-甲醇-乙腈-四氢呋喃混合液至总体积为10mL，涡旋振荡3min后，于10000r/min离心处理10min，取上清液即得。
检测步骤包括：
通过上述提取方法，提取所述化妆品中的总亚硝胺，并制得供试品溶液；制备梯度浓度的标准品溶液：精密称取N-亚硝基二正丙胺标准品10.17mg，溶于四氢呋喃中，并稀释至10mL，制得N-亚硝基二正丙胺浓度为1.017mg/mL的标准储备溶液；准确吸取所述标准储备溶液30μL，加入四氢呋喃，并稀释至10mL，制得N-亚硝基二正丙胺浓度为3.051μg/mL的标准工作溶液，所述标准工作溶液的浓度以N-NO计为1.0μg/mL；准确吸取所述标准工作溶液20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1000μL以及2000μL，分别加入0.1g/mL氨基磺酸水溶液100μL后，加入四氢呋喃稀释至10mL，即制得梯度浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的标准品溶液；分别对所述梯度浓度的标准品溶液进行化学反应-热能分析，并绘制标准曲线；对所述供试品溶液进行化学反应-热能分析，并根据所述标准曲线计算所述供试品溶液中总亚硝胺的浓度，即可计算获得所述化妆品中总亚硝胺的浓度；
所述化学反应-热能分析中，反应液为乙酸乙酯与氢溴酸水溶液(体积分数为40％)的混合液(乙酸乙酯与氢溴酸水溶液的体积比为25mL：0.3mL)；氮气压力为5psi；加热温度为85℃；系统真空度为1.7torr；冷却液为乙二醇水溶液(体积分数为50％)；所述冷却液的温度为-15℃；进样体积为50μL；
所述化学反应-热能分析的具体步骤包括：分别将浓度为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL以及200ng/mL的N-NO标准溶液注入反应瓶中，进样体积为50μL；记录图谱(20ng/mL的N-NO标准溶液图谱见图2)，以N-NO的浓度(X，ng/mL)为横坐标，以测得的峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，结果在2ng/mL-200ng/mL(折算到样品中，N-NO的浓度为20μg/kg-2000μg/kg)范围内线性关系良好，线性方程为Y＝19.45X+7.143，相关系数r＝0.9999；将待测样品注入反应瓶中，进样体积为50μL，记录图谱，根据标准曲线得到供试品溶液中N-NO的浓度；再根据提取方法计算试样中N-NO的含量，结果为788μg/kg，是理论含量(800μg/kg)的98.5％。
实施例2
本实施例提供了另一种膏霜乳液类化妆品中总亚硝胺的提取及检测方法；
自制一种水包油型润肤霜化妆品，使其含有不同理化性质的亚硝胺，分别为含有N-亚硝基二乙醇胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二正丙胺、N-亚硝基二环己胺各200μg/kg(均以N-NO计)；取该自制阳性样品，对其中的总亚硝胺进行提取和检测；
提取步骤包括：
精密称取所述化妆品1.0g，加入0.1g/mL的氨基磺酸水溶液100μL以及四氢呋喃2mL后，涡旋振荡3min；加入体积比为1:1:1:1的水-甲醇-乙腈-四氢呋喃混合液至总体积为9mL，涡旋振荡3min后，于40℃超声处理30min(工作频率为35KHz，200W)，冷却至室温；加体积比为1:1:1:1的水-甲醇-乙腈-四氢呋喃混合液至总体积为10mL，涡旋振荡3min后，于10000r/min离心处理10min，取上清液即得。
检测步骤包括：
通过上述提取方法，提取所述化妆品中的总亚硝胺，并制得供试品溶液；制备梯度浓度的标准品溶液：精密称取N-亚硝基二正丙胺标准品10.17mg，溶于四氢呋喃中，并稀释至10mL，制得N-亚硝基二正丙胺浓度为1.017mg/mL的标准储备溶液；准确吸取所述标准储备溶液30μL，加入四氢呋喃，并稀释至10mL，制得N-亚硝基二正丙胺浓度为3.051μg/mL的标准工作溶液，所述标准工作溶液的浓度以N-NO计为1.0μg/mL；准确吸取所述标准工作溶液20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1000μL以及2000μL，分别加入0.1g/mL氨基磺酸水溶液100μL后，加入四氢呋喃稀释至10mL，即制得梯度浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的标准品溶液；分别对所述梯度浓度的标准品溶液进行化学反应-热能分析，并绘制标准曲线；对所述供试品溶液进行化学反应-热能分析，并根据所述标准曲线计算所述供试品溶液中总亚硝胺的浓度，即可计算获得所述化妆品中总亚硝胺的浓度；
所述化学反应-热能分析中，反应液为乙酸乙酯与氢溴酸水溶液(体积分数为40％)的混合液(乙酸乙酯与氢溴酸水溶液的体积比为25mL：0.3mL)；氮气压力为5psi；加热温度为85℃；系统真空度为1.7torr；冷却液为乙二醇水溶液(体积分数为50％)；所述冷却液的温度为-15℃；进样体积为50μL；
所述化学反应-热能分析的具体步骤包括：分别将浓度为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL以及200ng/mL的N-NO标准溶液注入反应瓶中，进样体积为50μL；记录图谱，以N-NO的浓度(X，ng/mL)为横坐标，以测得的峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，结果在2ng/mL-200ng/mL(折算到样品中，N-NO的浓度为20μg/kg-2000μg/kg)范围内线性关系良好，线性方程为Y＝19.44X+7.145，相关系数r＝0.9998；将待测样品注入反应瓶中，进样体积为50μL，记录图谱，根据标准曲线得到供试品溶液中N-NO的浓度；再根据提取方法计算试样中N-NO的含量，结果为779μg/kg，是理论含量(800μg/kg)的97.4％。
对比例
自制一种油包水型防晒霜化妆品，使其含有不同理化性质的亚硝胺，分别为含有N-亚硝基二乙醇胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二正丙胺、N-亚硝基二环己胺各200μg/kg(均以N-NO计)；
取该自制阳性样品，按“GB/T 29669-2013化妆品中N-亚硝基二甲胺等10种挥发性亚硝胺的测定”检测N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二正丙胺、N-亚硝基二环己胺，按“GB/T35956-2018化妆品中N-亚硝基二乙醇胺(NDELA)的测定”检测N-亚硝基二乙醇胺；
结果因GB/T 29669-2013中N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二正丙胺、N-亚硝基二环己胺的检出限(分别为1.25mg/kg、1.25mg/kg、5mg/kg)较高，故自制阳性样品均未检出N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二正丙胺、N-亚硝基二环己胺；自制阳性样品检出N-亚硝基二乙醇胺的含量为190μg/kg；故自制阳性样品分别按“GB/T 29669-2013化妆品中N-亚硝基二甲胺等10种挥发性亚硝胺的测定”检测N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二正丙胺、N-亚硝基二环己胺，按“GB/T35956-2018化妆品中N-亚硝基二乙醇胺(NDELA)的测定”检测N-亚硝基二乙醇胺，结果测得亚硝胺总量为190μg/kg，为理论值(800μg/kg)的23.8％。
综上所述，本发明中的四氢呋喃用于膏霜乳液类中油脂类、蜡类及极性较弱成分的溶解或溶散，有着低毒、低沸点、流动性好的特点，水、甲醇和乙腈均能有效弥补四氢呋喃的不足，增加极性成分的溶解性，另外，水、甲醇、乙腈以及四氢呋喃四种溶剂之间可互溶，不会导致提取液分层，利于后续仪器分析；本发明的方法提取总亚硝胺的速度快，提取率高，操作简便，覆盖的亚硝胺种类广，可以满足《化妆品安全技术规范》中亚硝胺总量的检测需求，具有广阔的应用前景和市场潜力。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种化妆品中总亚硝胺的提取方法，其特征在于，所述化妆品为膏霜乳液类化妆品，所述化妆品中总所述亚硝胺包括：N-亚硝基二乙醇胺、N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二正丁胺、N-亚硝基二正丙胺、N-亚硝基二苯胺、N-亚硝基二环己胺，且所述化妆品中各所述亚硝胺的含量以N-NO计不低于200µg/kg；
所述提取方法的步骤包括：
精密称取所述化妆品0.5g~1.0g，加入0.05g/mL~0.15g/mL的氨基磺酸水溶液50µL~150µL以及四氢呋喃1mL~3mL后，涡旋振荡1min~3min；
加入体积比为1:1:1:1的水-甲醇-乙腈-四氢呋喃混合液至总体积为9mL，涡旋振荡1min~3min后，于30℃~50℃超声处理20min~40min，所述超声处理的工作频率为20KHz~43KHz，200W，冷却至室温；
加入体积比为1:1:1:1的水-甲醇-乙腈-四氢呋喃混合液至总体积为10mL，涡旋振荡1min~3min后，于5000r/min~14000r/min离心处理5min~10min，取上清液即得。
2.一种基于如权利要求1所述提取方法的化妆品中总亚硝胺检测方法，其特征在于，步骤包括：
通过如权利要求1所述提取方法，提取所述化妆品中的总亚硝胺，并制得供试品溶液；
制备梯度浓度的标准品溶液；
分别对所述梯度浓度的标准品溶液进行化学反应-热能分析，并绘制标准曲线；对所述供试品溶液进行化学反应-热能分析，并根据所述标准曲线计算所述供试品溶液中总亚硝胺的浓度，即可计算获得所述化妆品中总亚硝胺的浓度；
所述化学反应-热能分析中，反应液为乙酸乙酯与氢溴酸水溶液的混合液；氮气压力为1psi~10psi；加热温度为80℃~90℃；系统真空度为1torr~2torr；冷却液为乙二醇水溶液；所述冷却液的温度为-20℃~-10℃；进样体积为50μL~100μL。
3.根据权利要求2所述的化妆品中总亚硝胺检测方法，其特征在于，所述梯度浓度的标准品溶液制备步骤包括：
精密称取N-亚硝基二正丙胺标准品10.17mg，溶于四氢呋喃中，并稀释至10mL，制得N-亚硝基二正丙胺浓度为1.017mg/mL的标准储备溶液；
准确吸取所述标准储备溶液30µL，加入四氢呋喃，并稀释至10mL，制得N-亚硝基二正丙胺浓度为3.051µg/mL的标准工作溶液，所述标准工作溶液的浓度以N-NO计为1.0µg/mL；
准确吸取所述标准工作溶液20µL、50µL、100µL、200µL、500µL、1000µL以及2000µL，分别加入0.1g/mL氨基磺酸水溶液100µL后，加入四氢呋喃稀释至10mL，即制得梯度浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的标准品溶液。
4.根据权利要求2所述的化妆品中总亚硝胺检测方法，其特征在于，所述反应液中乙酸乙酯与氢溴酸水溶液的体积比为(20~30):(0.1~0.5)。
5.根据权利要求4所述的化妆品中总亚硝胺检测方法，其特征在于，所述氢溴酸水溶液中氢溴酸的体积分数为30%~50%。
6.根据权利要求2所述的化妆品中总亚硝胺检测方法，其特征在于，所述乙二醇水溶液中乙二醇的体积分数为40%~60%。
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