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Stand der Technik
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Im Bereich der Tumordiagnostik wird von einem Chirurgen entnommenes Gewebe eines Karzinoms für eine spätere Analyse üblicherweise zunächst mit Formalin behandelt, um zelleigene Enzyme zu inaktivieren und die DNA zu fixieren. Für eine Konservierung wird das Gewebe anschließend in Paraffin eingebettet.
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Um mittels molekulardiagnostischer Verfahren, beispielsweise einer Polymerase-Kettenreaktion, den genetischen Zustand eines Karzinoms zu erfassen, müssen sowohl das Formalin als auch das Paraffin vor der Analyse wieder entfernt werden. Dies geschieht in der Regel durch eine Lösung des Paraffins in Xylol, gefolgt von einer Entfernung des Xylols mit Ethanol sowie eine Erhitzung der Gewebeprobe zur Inaktivierung der Formalinfixierung. Ein solches Verfahren ist beispielsweise aus
WO 2011/150316 A1 bekannt.
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Offenbarung der Erfindung
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Vorteile der Erfindung
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Probenaufbereitung von Paraffin-eingebettetem Gewebe mit einer mikrofluidischen Vorrichtung. Das Verfahren umfasst in einem ersten Schritt ein Einbringen einer Paraffin-eingebetteten Gewebeprobe in eine erste Kammer der mikrofluidischen Vorrichtung. In einem zweiten Schritt wird Öl in die erste Kammer eingeleitet, insbesondere durch ein Pumpen des Öls aus einem ersten Reservoir der mikrofluidischen Vorrichtung in die erste Kammer. Das Verfahren umfasst ferner einen Schritt einer Extrahierung von Paraffin aus der Paraffin-eingebetteten Gewebeprobe durch Kontaktierung der Gewebeprobe mit dem Öl, wobei das Öl durch eine Heizeinrichtung der mikrofluidischen Vorrichtung auf eine erste Temperatur gebracht und vorzugsweise auf der ersten Temperatur gehalten wird. Dabei kann das Öl entweder vor dem Einleiten in die erste Kammer oder erst nach dem Einleiten in die erste Kammer auf die erste Temperatur gebracht werden.
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Unter einer Paraffin-eingebetteten Gewebeprobe kann insbesondere ein Teil eines menschlichen oder tierischen Gewebes verstanden werden, welches in Paraffin eingebettet wurde. Zusätzlich kann das Gewebe vor einer Einbettung in Paraffin mit Formalin behandelt worden sein, wobei ein derart präpariertes Gewebe auch als Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettetes Gewebe, kurz FFPE-Gewebe, bezeichnet wird. Unter einer mikrofluidischen Vorrichtung kann insbesondere eine Vorrichtung, in welcher mikrofluidische Prozesse zumindest teilweise automatisiert ablaufen können, verstanden werden, beispielsweise eine Lab-on-a-chip-Vorrichtung. Unter einer Extrahierung von Paraffin aus der Paraffin-eingebetteten Gewebeprobe kann insbesondere eine Trennung zumindest eines Teils des Paraffins, in welchem die Gewebeprobe eingebettet ist, von der Gewebeprobe verstanden werden.
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Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass eine Extrahierung von Paraffin aus einer Paraffin-eingebetteten Gewebeprobe unter Verwendung von Öl in einer mikrofluidischen Vorrichtung besonders vorteilhaft ist. Öl, wie beispielsweise ein Mineralöl, hat den Vorteil, dass es in mikrofluidischen Vorrichtungen, welche üblicherweise zumindest einen teilweisen Aufbau aus Polymeren umfassen, langzeitstabil gelagert werden kann. Durch die Verwendung von Öl kann insbesondere auf die sonst übliche Verwendung von Xylol zur Extrahierung des Paraffins aus der Paraffin-eingebetteten Gewebeprobe verzichtet werden. Im Gegensatz zu Öl kann Xylol nicht ohne weiteres in mikrofluidischen Vorrichtungen auf Kunststoffbasis vorgelagert werden. Ferner kann durch die Verwendung von Öl auf eine sonst übliche Spülung der Probe zur Entfernung von Xylol-Rückständen verzichtet werden. Da somit auf das Einbringen oder Vorlagern einer Spülflüssigkeit verzichtet werden kann, kann die mikrofluidische Vorrichtung kompakter aufgebaut sein, was ferner den Materialaufwand bei der Herstellung reduziert Außerdem kann die mikrofluidische Vorrichtung auf einfache Art und Weise nach einer Verwendung entsorgt werden, während bei einer Verwendung von Xylol eine gesonderte Entsorgung erfolgen muss.
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In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird das die erste Temperatur aufweisende Öl über einen schleifenförmigen Kanal der mikrofluidischen Vorrichtung mehrfach für die Extraktion des Paraffins durch die erste Kammer befördert. Dadurch kann die Gewebeprobe besonders wirkungsvoll mit dem Öl vermischt werden.
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Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird nach der Extraktion des Paraffins ein Lysepuffer für eine Lyse von Zellen der Gewebeprobe zugegeben. Damit kann auf einfache Art und Weise DNA aus Zellen der Gewebeprobe extrahiert werden. Bei dem Lysepuffer kann es sich insbesondere um einen für eine chemische, thermische oder Ultraschall-Lyse geeigneten Puffer handeln.
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Gemäß einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird das mit extrahiertem Paraffin vermengte Öl mit einer wässrigen Lösung, insbesondere mit einem Lysepuffer nach einer erfolgten Lyse von Zellen der Gewebeprobe, in einem Phasenseparationskanal der mikrofluidischen Vorrichtung befördert. Dabei wird zumindest ein Teil des Öls durch einen hydrophoben Filter, insbesondere einen hydrophoben Membranfilter, von der wässrigen Lösung in einem von dem Filter begrenzten Abschnitt des Phasenseparationskanals abgeschnitten. Somit wird vorteilhafterweise das zwei-Phasen-Gemisch durch den Filter in eine unpolare Phase, enthaltend das Öl, und eine polare Phase, enthaltend die wässrigen Bestandteile der wässrigen Lösung, aufgeteilt. Die beiden Phasen können dann vorteilhafterweise separat weiter prozessiert werden.
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Vorzugsweise wird der Gewebeprobe nach der Extraktion des Paraffins eine wässrige Reagenz für eine Anreicherung der DNA aus der Gewebeprobe in der wässrigen Reagenz zugegeben. So kann vorteilhafterweise insbesondere nach Durchführung der Lyse die DNA von der Gewebeprobe auf einfache Art und Weise für eine weitere Analyse der DNA getrennt werden.
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In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die Gewebeprobe für eine Entfernung einer Formalinfixierung auf eine zweite Temperatur gebracht, wobei die zweite Temperatur vorzugsweise zwischen 60 und 110 Grad Celsius, bevorzugt zwischen 70 und 90 Grad Celsius liegt. Dies hat den Vorteil, dass eine Fixierung von Formalin des Gewebes durch die Erhitzung einfach und wirkungsvoll rückgängig gemacht werden kann.
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Die Erfindung betrifft auch eine mikrofluidische Vorrichtung zur Probenaufbereitung von Paraffin-eingebettetem Gewebe. Die mikrofluidische Vorrichtung umfasst eine erste Kammer zur Aufnahme einer Paraffin-eigebetteten Gewebeprobe und eine Heizeinrichtung. Die erste Kammer ist mit einem Reservoir für Öl fluidisch verbunden und vorzugsweise mit Öl gefüllt, insbesondere mit Mineralöl. Die Heizeinrichtung ist eingerichtet, Öl aus dem Reservoir für eine Extrahierung von Paraffin aus einer in der ersten Kammer aufgenommene Probe durch eine Kontaktierung des Öls mit der Gewebeprobe auf eine erste Temperatur zu bringen. Die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung ermöglicht es vorteilhafterweise, durch das Vorsehen eines Reservoirs für Öl sowie einer Heizeinrichtung, Paraffin aus dem Paraffin-eingebetteten Gewebe zu extrahieren. Durch die Verwendung von Öl statt dem üblicherweise verwendeten Xylol kann das Öl auf einfache Weise langzeitstabil in der mikrofluidischen Vorrichtung vorgelagert werden und die Vorrichtung nach einem Gebrauch ohne besondere Nachbereitung entsorgt werden.
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In einer vorteilhaften Weiterbildung der mikrofluidischen Vorrichtung ist ein Ausgang der ersten Kammer über einen schleifenförmigen Kanal mit einem Eingang in die erste Kammer verbunden. Dies ermöglicht eine wiederholte Beförderung des Öls für der Extrahierung des Paraffins durch die erste Kammer.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist die erste Kammer mit einem Phasenseparationskanal fluidisch verbunden, wobei der Phasenseparationskanal einen durch einen hydrophoben Filter, insbesondere einen hydrophoben Membranfilter, begrenzten Abschnitt aufweist. Dadurch wird vorteilhafterweise bei einem Durchleiten einer wässrigen Lösung, welche mit aus der Gewebeprobe extrahiertem Paraffin vermengtes Öl umfasst, durch den Phasenseparationskanal zumindest ein Teil des Öls durch den hydrophoben Filter von der wässrigen Lösung in den Abschnitt abgeschieden.
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Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der mikrofluidischen Vorrichtung ist die Heizeinrichtung ferner eingerichtet. Die Gewebeprobe für eine Entfernung einer Formalinfixierung auf eine zweite Temperatur zu bringen, wobei eine zweite Temperatur vorzugsweise zwischen 50 und 110 Grad Celsius, bevorzugt zwischen 70 und 90 Grad Celsius, liegt.
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Die Erfindung betrifft ferner ein Computerprogramm, das eingerichtet ist, alle Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens durchzuführen, sowie ein maschinenlesbares Speichermedium mit einem darauf gespeicherten erfindungsgemäßen Computerprogramm.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.
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Es zeigen:
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1 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels der Erfindung und
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2 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Ausführungsformen der Erfindung
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1 zeigt eine schematische Darstellung eines Teils einer mikrofluidischen Vorrichtung 100, welche eine erste Kammer 110 zur Aufnahme einer Gewebeprobe 1, beispielsweise über eine Öffnung 115 der ersten Kammer 110, umfasst. Die erste Kammer 110 ist mit einem Reservoir 120 für Öl fluidisch verbunden, wobei die fluidische Verbindung 160 durch ein erstes Ventil 116 an einer Eingangsöffnung 111 zur ersten Kammer 110 sowie durch ein zweites Ventil 117 nahe des Reservoirs 120 unterbrochen werden kann. Bei dem Öl kann es sich um ein Mineralöl handeln, welches in dem Reservoir 120 in einer Menge von 50 bis 2000 Mikroliter, bevorzugt 200 bis 800 Mikroliter, vorgelagert ist. Die mikrofluidische Vorrichtung 100 umfasst ferner eine Heizeinrichtung 130, welche eingerichtet ist, Öl aus dem Reservoir 120 auf eine erste Temperatur zu bringen und vorzugsweise dort zu halten. Dafür kann die Heizeinrichtung 130 mit dem Reservoir 120 oder der ersten Kammer 110 thermisch verbunden sein. Das Öl aus dem Reservoir 120 kann über die fluidische Verbindung 160 in die erste Kammer 110 geleitet werden, wobei das Öl bereits vor einem Einleiten in die erste Kammer 110 durch die Heizeinrichtung 130 auf die erste Temperatur gebracht werden kann oder erst nach dem Einleiten in die erste Kammer 110 auf die erste Temperatur gebracht wird. Zum Unterstützen des Einleiten des Öls aus dem Reservoir 120 in die erste Kammer 110 umfasst die mikrofluidische Vorrichtung vorzugsweise eine Pumpe 165, welche vorzugsweise in der fluidischen Verbindung 160 zwischen der ersten Kammer 110 und dem Reservoir 120 angeordnet ist.
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Die mikrofluidische Vorrichtung 110 umfasst in diesem Ausführungsbeispiel einen schleifenförmigen Kanal 140, so dass ein Ausgang 112 der ersten Kammer 110 über den schleifenförmigen Kanal 140 mit dem Eingang 111 in die erste Kammer 110 verbunden ist. Dies ermöglicht eine wiederholte Beförderung des Öls durch die erste Kammer 110, vorzugsweise unterstützt durch die Pumpe 160. Um den schleifenförmigen Kanal 140 fluidisch abzukoppeln, umfasst der schleifenförmige Kanal 140 an einem Eingang in den Kanal 140 und an einem Ausgang aus dem Kanal 140 ein drittes Ventil 118 beziehungsweise ein viertes Ventil 119.
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Der Ausgang 112 der ersten Kammer 110 ist mit einem Phasenseparationskanal 150 über ein fünftes Ventil 151 fluidisch verbunden. Der Phasenseparationskanal 150 weist einen hydrophoben Filter 155 auf, welche einen Abschnitt 156 in dem Phasenseparationskanal 150 begrenzt. Bei dem hydrophoben Filter 155 kann es sich um eine fluorinierten Filter, beispielsweise um einen fluorinierten Membranfilter handeln, der Polytetrafluorethylen umfasst, und beispielsweise Poren mit einer Größe zwischen 5 Nanometer und 500 Mikrometer, bevorzugt zwischen 0,1 und 10 Mikrometer aufweist. Aufgrund der hydrophoben Eigenschaften des Filters 155 wird ein unpolarer Bestandteil in einer wässrigen Lösung, beispielsweise Öl in Wasser, bei einem Durchleiten der wässrigen Lösung durch den Phasenseparationskanal von polaren Bestandteilen der Lösung in den Abschnitt 156 abgetrennt, so dass eine Trennung einer polaren von einer unpolaren Phase erfolgt. Die unpolare Phase kann über einen ersten Ausgang 152 des Abschnitts 156 und die polare Phase über einen zweiten Ausgang 153 des Phasenseparationskanals 150 weitergeleitet werden.
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2 zeigt ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Probenaufbereitung von Paraffin-eingebettetem Gewebe mit einer mikrofluidischen Vorrichtung, beispielsweise mit einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 aus 1.
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In einem ersten Schritt 501 wird eine Paraffin-eingebettete Gewebeprobe 1 in eine erste Kammer 110 der mikrofluidischen Vorrichtung 100 aufgenommen. In einem zweiten Schritt 502 wird Öl aus dem Reservoir 120 in die erste Kammer 110 mit Unterstützung durch die Pumpe 160 eingeleitet. In einem dritten 503 wird zumindest ein Teil des Paraffins aus der Paraffin-eingebetteten Gewebeprobe 1 durch Kontaktierung der Gewebeprobe 1 mit dem Öl extrahiert, wobei das Öl durch die Heizeinrichtung 130 auf eine erste Temperatur gebracht wurde, beispielsweise auf eine Temperatur zwischen 70 und 90 Grad Celsius. Um die Effektivität der Extrahierung des Paraffins zu erhöhen wird das Öl über den schleifenförmigen Kanal 140 der mikrofluidischen Vorrichtung 100 mehrfach durch die erste Kammer 110 gepumpt. Aufgrund der ersten Temperatur des Öls schmilzt das Paraffin und verbindet sich mit dem Öl. Wenn das Paraffin-eingebettete Gewebe zusätzlich eine Formalinfixierung aufweist, so kann in einem vierten Schritt 504 die Formalinfixierung durch eine Erhitzung der Gewebeprobe 1 auf eine Temperatur zwischen 70 und 95 Grad Celsius für 5 bis 60 Minuten inaktiviert werden.
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In einem fünften Schritt 505 des Ausführungsbeispiels erfolgt eine Lyse von Zellen der aufgenommenen Gewebeprobe 1. Die Lyse kann entweder über eine chemische Lyse, eine thermische Lyse oder eine Ultraschall-Lyse erfolgen. Im Falle einer chemischen, einer enzymatischen Lyse oder einer thermischen Lyse wird ein Lysepuffer in die erste Kammer 110 zugegeben. Dies kann entweder ebenfalls über die Öffnung 115 in die erste Kammer 110 erfolgen oder, wie in 1 dargestellt, über einen Zuführkanal 170, welcher mit der ersten Kammer fluidisch über ein verschließbares sechstes Ventil 171 mit der ersten Kammer verbunden werden kann, erfolgen. Im Falle einer Ultraschall-Lyse wird in die erste Kammer 110 Ultraschallenergie eingekoppelt.
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Nach erfolgter Lyse wird in einem sechsten Schritt 506 der Lysepuffer, welcher sowohl das mit Paraffin vermengte Öl als auch gelöste DNA aus dem Gewebe enthält, über den Ausgang 112 der ersten Kammer 110 zum Phasenseparationskanal 150 weiterbefördert, wo aufgrund des hydrophoben Filters 155 des Phasenseparationskanals 150 eine Trennung des unpolaren Öls gemeinsam mit dem Paraffin von den polaren Bestandteilen des Puffers, insbesondere der DNA, getrennt wird. Das mit dem Paraffin getrennte Öl kann über den ersten Ausgang 152 des Phasenseparationskanals entsorgt werden während die polaren Bestandteile, insbesondere die DNA, über den zweiten Ausgang 153 des Phasenseparationskanals für eine weitere Analyse aus dem Phasenseparationskanal 150 befördert werden können. Der sechste Schritt kann dabei durch aus dem Stand der Technik bekannte DNA-Extraktionsverfahren ergänzt werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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