CN1046530A - 奥塔诺新(oxetanocins)磷酸酯，该酯的生产方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由通式(I)代表的有抗病毒活性的奥塔诺新磷酸酯及其药用盐，其中R₁代表磷酸酯基，X代表H，OH或-CH₂OH，B代表嘌呤碱基。

Description

本发明涉及具有抗病毒活性，通式（Ⅰ）代表的奥塔诺新（Oxetanocin）的磷酸酯及其药用盐。

其中R¹代表磷酸酯基，X代表氢，羟基，羟甲基，B代表嘌呤碱基。

奥塔诺新本身刊载于抗菌素杂志39卷11期1623-25页（1986），EP-A-O        182        321等，（Journal        Antibiotics        Vol.39（11），1623-25（1986））。

在抗菌素杂志，40卷第12期，1788-90页（1987），EP-A-O        291        917和EP-A-O        334        250叙述了其衍生物。

上述的期刊和专利也公布了这些化合物所显示的抗病毒活性。

然而，现时对病毒性疾病的药物治疗是不满意的。因此就希望发展新的抗病毒药物。

因此，本发明的目的是提供用作新抗病毒剂的奥塔诺新的磷酸酯。

本发明的奥塔诺新磷酸酯显示抗病毒的作用，其中包括抑制RNA病毒的逆转录酶（RTase）的活性（例如简称为HIV的人免疫缺损病毒），抗RNA病毒的活性，例如抗HIV活性或抗非甲非乙型肝炎病毒的活性，抗DNA病毒的活性，例如，抗乙型肝炎病毒的活性，抗巨细胞病毒的活性，抗单纯疱疹Ⅰ或Ⅱ型病毒，抗水痘-带状疱疹病毒的活性等等，并且可以预料，该类化合物可用作治疗HIV的药物或用作抗乙型肝炎病毒的药物，抗巨细胞病毒剂，抗水痘-带状奥塔诺新病毒剂等等。

本发明者经各种研究结果发现由通式（Ⅰ）（其中R¹代表磷酸

酯基，B代嘌呤碱基，X代表H，OH或-CH₂OH）代表的奥塔诺新磷酸酯显示抑制HIV逆转录酶的活性，抗HIV活性，抑制DNA病毒的DNA聚合酶的活性和抗DNA病毒的活性。因此，完成了本发明。

本发明的磷酸酯基如下所示：

嘌呤碱基为下式表示，嘌呤骨架9-位连于氧杂环丁烷的嘌呤衍生物残基：

                                                                                                                                                                （嘌呤母核）

嘌呤碱基的例子包括腺嘌呤基，鸟嘌呤基，次黄嘌呤基，2-氨基腺嘌呤基等等。

通式（Ⅰ）中具体化合物的例子列于表1。

表1和式子简略式的含义如下：

A：腺嘌呤基

G：鸟嘌呤基

H：次黄嘌呤基

D：2-氨基腺嘌呤基

表1

表1（续）

本发明通式（Ⅰ）的化合物可如下法得到。

通式（Ⅰa）（其中X代表H，OH或-CH₂OH，B代表嘌

呤碱基）代表的奥塔诺新单磷酸酯可由下面的反应得到：即通式（Ⅱ）[其中X′代表H，OH，-O-P₃或-CH₂-O-P₃，其中P₃是一个保护基，B代表嘌呤碱基]代表的奥塔诺新与磷氧

卤化物如三氯氧磷，在下面通式（其中Ra，Rb和Rc每一个单独代表氢或低烷基）代表的磷酸低烷酯存在下反应，当X′是-OP₃

或-CH₂-OP₃时，保护基从被保护着的化合物上消去。

反应一般在大约-20℃-50℃的温度进行，最好是-10℃至大约20℃，用磷酸低烷酯作溶剂，当然反应也可以在对反应呈惰性的有机溶剂中进行。

除去保护基P₃可以用常规的方法实现。如一般用催化还原除掉的P₃保护基，这样，保护基是由贵金属催化还原除掉。催化还原所使用的催化剂为铂，钯，钯炭等。催化还原一般最好在溶剂中进行。极性溶剂如水，低烷醇，低烷酮，低脂肪酸等均可使用。

反应可在大约0℃至溶剂沸点（如大约为150℃）的温度下进行。

作为可以由催化还原除掉的保护基可用苄基（可为未取代的或以低烷基，低烷氧基，卤素等取代）。

另外，保护基P₃可以是低烷羰基，低烷硅烷基等。在这些保护基的情况下，保护基可以用常规的方法如水解等除掉。

其次，有关奥塔诺新三磷酸酯化合物叙述如下。

由通式（Ⅰb）（其中X和B与上述意义相同）代表的奥塔诺新

三磷酸酯的有关化合物可以由通式（Ⅰa）代表的奥塔诺新单磷酸酯与碳酰二咪唑和焦磷酸三烷铵盐在三烷胺存在下反应得到。

反应一般在如低烷醇，低烷酮，环酮，低脂肪酸等极性溶剂中进行。

可以在大约0℃至溶剂沸点（如大约150℃）的温度下进行反应。

1摩尔的通式（Ⅰa）所代表的化合物，使用大约1-10摩尔的三低烷（C₁-C₅）胺和大约2-10摩尔碳酰二咪唑，如二环己烷碳酰二亚胺。

所要化合物可用常规的层析等方法分离。

本发明中低烷基，低醇基等的烷基，一般有1-5个碳原子。烷基的例子包括甲基，乙基，丙基，丁基，戊基等。烷基也可是支链。

本发明的化合物与碱类形成盐。作为形成盐的碱为氢氧化碱等。为形成盐，一般用常规的方法在溶剂中使碱与通式（Ⅰ）的化合物反应。

其次，B是腺嘌呤基（A）的通式（Ⅰ）的典型化合物的生产方法简述如下，其中也包括通式（Ⅱ）的化合物的生产方法。下式中A-P₂代表一个基团：

其中P₂代表保护基。

上述每一步骤解释如下：

第一步：N-（6）-保护的奥塔诺新①的Z′-CH₂OH中的OH用某些保护基选择性地加以保护。

作为化合物②和③的保护基（式中P₁或P₂）为可以被任意取代（取代基如卤原子，低烷氧基苯甲酰基等）的甲酰基或低烷羰基;酰基如乙酰基，氯乙酰基，三氯乙酰基，甲氧乙酰基，三甲基乙酰基，苯氧乙酰基，三苯甲氧乙酰基，苯甲酰基等;任意选择取代的低烷基，包括未取代的低烷基如叔-丁基等，和取代的低烷基如未取代的三苯甲基和取代的三苯甲基，如低烷氧三苯甲基，例如单甲氧三苯甲基，二甲氧三苯甲基，三甲氧三苯甲基等。此外，还有甲硅烷基型保护基，即有各种取代的甲硅烷基，如三甲硅烷基，叔-丁基二甲基硅烷基，叔-丁基二苯基硅烷基等等。

上述保护基可按迄今已知的方法引入。最好是所选择的保护基在后一步能有效的除去。化合物②和化合物③可用柱层析彼此分离开。

第二步：这一步是保护3′-CH₂OH的羟基。P₁是酰基或硅烷基时，优先选用苄基，烯丙基等作为保护基，这些基团可用还原等法除掉。

第三步：这一步是消除保护基P₁和P₂。P₁是各种取代的硅烷基时，可用氟化n-四丁基铵在四氢呋喃中消除之。P₂是酰基时，可用甲醇钠或氨水等消除之。

第四步：这一步是磷酸化。用于磷酸化所使用的磷酸，可用三氯氧磷。磷酸化作用一般在磷酸三低烷酯存在下进行。

第五步：这一步是去掉Z′-CH₂OH中羟基的保护基。P保护基是苄基时经还原除去之，一般用钯炭等催化还原。通过这一步，可得到化合物No.1（单磷酸酯）。

第六步：这一步是焦磷酸化。在三丁胺存在下，与碳酰二咪唑反应，然后与三烷铵焦磷酸盐如三丁铵焦磷酸盐等反应可得三磷酸酯。

本发明的化合物所具有的生物活性阐明如下。

本发明的化合物显示优良的抗病毒活性，可用作抗病毒药物。

本发明的化合物对下面的病毒可指望有效：

DNA病毒：痘病毒，疱疹病毒，腺病毒，乳头状瘤多瘤空泡形病毒，肝DNA病毒，细小病毒，

RNA病毒：

棒状病毒，firoviras（硬壁病毒），副粘液病毒，正粘液病毒（流感病毒），沙粒病毒，逆病毒（retroviras），冠状病毒，本扬病毒，囊膜病毒，黄热病病毒，萼状病毒，微小RNA病毒，呼吸道肠道病毒。

通式（Ⅰ）的化合物可用作治疗各种病毒性疾病，例如疱疹，乙型肝炎，由巨细胞病毒，水痘带状疱疹病毒，艾兹病毒（AIDS）等引起的感染性疾病的药物。

通式（Ⅰ）的化合物（其中B是腺嘌呤基或次黄嘌呤基），对RNA病毒如HIV等或DNA病毒如巨细胞病毒，水痘-带状疱疹病毒等的抑制作用特别好。

进一步讲，通式（Ⅰ）的化合物（其中B是腺嘌呤基或2-氨基腺嘌呤基）在抑制DNA病毒如肝炎乙型病毒，巨细胞病毒等生长方面是特别好的。

由通式（Ⅰa）（其中X是H，OH或-CH₂OH，B是一个

嘌呤碱基）代表的奥塔诺新的单磷酸酯（即在通式（Ⅰ）中的化合物，R₁是单磷酸酯，通过将有效剂量的化合物（Ⅰa）给病毒感染的温血动物（包括人）可抑制病毒的生长。

本发明的试验实例和实例将说明于下。

试验实例1

HIV的逆转录酶（RTare）活性的测定

1.标准酶

用HIV持续感染的MOLT-4/HTLV-ⅢB细胞用（Triton        X-100）等破坏以制备粗酶（RTase）。

应用聚（dT）和寡（dA）为模板引物，使用以下的反应溶液。

2.反应溶液组成

5mg/ml牛血清蛋白白        2.5μl

1M三羟甲基氨基甲        2.0

烷盐酸盐缓冲液（pH7.8）

100mM        二硫苏糖醇        2.0

1M        KCl        2.25

10mM        聚（dT）        1.0

150μM        dATP        4.5

5单位/ml        寡（dA）        4.0

1.25mM MnCl₂2.5

1mCi/ml³H-dATP 2.25

逆转录酶        10.0

蒸馏水        27.0

总计        60.0

3.反应条件

37℃，1小时

在上述条件下的反应液中，酸不溶部分中的³H-AMP的摄取，是用液体闪烁计数器测定的。

本发明化合物抑制逆转录酶的活性列于表2。

表2该化合物对HIV逆转录酶的抑制作用

No.2化合物（μM）        逆转录酶抑制（%）

417        98.8

125        93.0

42.7        69.4

12.5        33.9

4.17        1.0

0        0

实例1（No.1和2化合物的合成）

化合物②和③的合成：

往123mg N（6）-苯甲酰-9-（2-脱氧-2-羟甲基-β-D-赤奥塔诺新基）腺嘌呤（化合物①）（P₂＝COC₆H₅）在1ml无水二甲基甲酰胺中的溶液中加入70mg咪唑和60mg氯化物叔-丁基二甲基硅烷在2ml无水二甲基甲酰胺中的溶液。混合物在室温搅拌2小时。减压蒸掉溶剂，剩余物中加入20ml水。混合物用氯仿提取。用饱和氯化钠水溶液洗涤氯仿溶液后，提取液经无水硫酸钠干燥。滤掉硫酸钠，减压蒸除溶剂得浅黄色糖浆状物。糖浆状物经20g硅胶柱层析，用氯仿-甲醇（20∶1）洗脱。收集Rf值大约为0.46（硅胶板，展开剂为氯仿-甲醇（10∶1））的部分。减压除去溶剂得到49.6mg（30.6%）的化合物②（P₂＝-COC₆H₅，

）。进而收集Rf值大约为0.60的部分，减压蒸除溶剂得25.3mg（16.0%）的化合物③（P₂＝-COC₆H₅，

）。

化合物②：

MS m/z：470（M+H）⁺;NMR（400MHz，CDCl₃，

TMS）ppm：9.23（1H，s，NH，8.78（1H，s，8-

H），8.68（1H，s，2-H），8.03（2H，d，

J＝7.5Hz，Ph），8.50-8.63（3H，m，Ph），6.60

（1H，d，J＝5.6Hz，1′-H），4.73（1H，m，3′-H），3.93-

4.70（3H，m，OH，

），

3.81（1H，dd，J＝11.7Hz，2.8Hz，

3.58-3.72（2H，m，2′-H，

），0.92

（9H，s， ），0.10（3H，s， ），0.12

（3H，s，

）

化合物③：

MS m/z：470（M+H）⁺;NMR（400HHz，CDCl₃，

TMS）ppm：9.34（1H，s，NH），8.79（1H，s，8-H），8.34（1H，s，2-H），8.35（2H，d，J＝7.5Hz，Ph），7.48-7.63，（3H，m，Ph），6.50（1H，d，J＝5.7Hz，1′-H），5.50（1H，broad s，-OH），4.04（2H，m，3′-CH₂OH），3.67-3.87（3H，m，2′-H，2′-CH₂OH），0.91（9H，s，

），0.10（6H，s， ）

化合物④的合成：

在冰冷却及氮气流下，将25mg氢化钠悬浮于3ml无水四氢呋喃中，然后将100mg化合物②在3ml无水四氢呋喃中的溶液加到上述悬浮液中。搅拌30分钟后，将26μl的溴苄加到混合物中随后在室温搅拌2小时。往反应液中加3ml饱和氯化铵水溶液。室温搅拌20分钟后，减压蒸除溶剂。往残余物中加5ml水，混合物用10ml氯仿提取3次。提取液用饱和氯仿钠水溶液洗涤，有机相用无水硫酸干燥。滤去硫酸钠，减压蒸除溶剂得糖浆状物。用硅胶柱层析分离糖浆状物（20ml，氯仿-甲醇50∶1））得96.4mg（产率85.6%）化合物④（P₂＝-COC₆H₅，

P₃＝-CH₂-C₆H₅）。

化合物④：

NMR（60MHz，CDCl₃，TMS）ppm：9.29（1H，brs，NH），8.73（1H，s，8-H），8.62（1H，s，2-H），7.70-8.10（2H，m），7.17-7.60（8H，m），6.60（1H，d，J＝6.2Hz，1′-H），4.40-4.87（3H，m），3.50-4.10（5H，m），1.98（9H，s），1.20（6H，s）

化合物⑤的合成：

往96.4mg化合物④在2ml四氢呋喃中的溶液中加入0.3ml 1.05M的氟化四丁基铵在四氢呋喃中的溶液。混合物在室温搅拌1小时。减压蒸除反应液中的溶剂得残留物。残留物中加入1.5ml甲醇和1.5ml浓氨水。生成的混合物在60℃搅拌2小时。反应液减压浓缩至干。将残留物溶于3ml甲醇，并加入800mg硅胶。减压蒸除溶剂。残留物被分层装入用氯仿-甲醇（20∶1）平衡的硅胶柱内，用氯仿-甲醇（20∶1，10∶1）洗脱得43mg（产率，72.6%）的化合物⑤（P₃＝-CH₂-C₆H₅）。

化合物⑤：

NMR（60MHz，CD₃OD，TMS）ppm：8.65（1H，s，8-H），8.23（1H，s，2-H），7.32（5H，s，φ-CH₂-O-），6.33（1H，d，6.0Hz，1′-H），4.60（2H，s，φ-CH₂-），3.66-4.18（5H，m）

化合物⑥的合成：

在-20℃冷却及氮气流下，将0.3ml三氯氧磷加到322mg化合物⑤在6ml磷酸三乙酯的悬浮液中。混合物在0℃搅拌18小时。然后往其中加10ml饱和碳酸氢钠水溶液，用10ml氯仿提取3次。把100ml水加到水相后，混合物通过用60ml的DEAE-交联葡聚糖胶A-25填装的柱（碳酸盐型），随后用200ml水冲洗。水相用300ml 0.1M三乙胺-碳酸盐缓冲液（pH7.48）和500ml 0.3M三乙胺-碳酸盐缓冲液（pH7.38）洗脱。通过硅胶薄层层析[丁醇∶乙酸∶水（12∶3∶5）]收集Rf值大约为0.37的馏分，得粗化合物⑥（P₃＝-CH₂-C₆H₅）。

化合物⑥：

NMR（60MHz，CD₃OD）：8.66（1H，s，8-H），8.20（1H，s，2-H），7.30（5H，s，Ph），6.60（1H，d，J＝6.2Hz，1′-H），4.60（2H，s），4.10-4.34（2H，m），3.66-4.03（3H，m）

化合物No.1的合成：

在20ml乙醇，7ml水和3ml醋酸的混合物中溶解416mg化合物⑥粗品，把40mg 10%的钯-炭加到该溶液中。加热至回流，催化还原反应进行3小时。过滤除掉反应液中的催化剂。滤液减压浓缩得无色残留物。残留物溶于50%甲醇水溶液中，采用用同样溶剂平衡的交联葡萄糖凝胶LH-20 1400ml），通过柱层析分离。通过硅胶薄层层析（丁醇-醋酸-水（12∶3∶5））收集Rf值大约为0.13的馏分，减压除去溶剂。残留物溶于5ml水，用0.1N盐酸将pH调至1.8。pH调解后的溶液通过MCl GEL CHP 20 P（120ml）的柱子。用水洗涤后，溶液用80%甲醇水溶液洗脱。减压蒸除溶剂得138mg化合物No.1为无色粉末。

化合物No.1：

FD-MS（m/z）：332（M+H）⁺;NMR（200MHz，D₂O）ppm：8.73（1H，s，8-H），8.12（1H，s，2-H），6.45（1H，d，J＝5.7Hz，1′-H），4.84（1H，m），4.09（2H，m），3.74-3.93（3H，m）

化合物No.2的合成：

往111mg化合物No.1在3.5ml无水二甲基甲酰胺的溶液中加入160ml的三丁胺和271.6mg碳酰二咪唑。室温搅拌5小时后，将107μl甲醇加到混合物中，随后搅拌30分钟。将603mg焦磷酸三丁铵在8ml二甲基甲酰胺的溶液加到上述混合物中，随后室温搅拌18小时。过滤形成的沉淀，用二甲基甲酰胺洗涤。合并滤液和洗涤液。往其中加入等体积的甲醇后，混合物减压浓缩至干。残留物溶于水，溶液通过用50ml        DEAE-交联葡聚糖凝胶填充的柱（碳酸盐型）。每次用370ml线性梯度（0.05-04M）的三乙胺-碳酸盐缓冲液（pH7.5）洗脱，用0.4M同样的缓冲液进行洗脱。收集洗脱产物的主要馏分并减压浓缩至干。加甲醇至浓缩物中共沸蒸馏至有效脱盐。残留物溶于10ml水，在冰冷却下用0.1N盐酸调pH至2.0，然后用1N氢氧化钠调至7.0。pH调节后的溶液通过用6ml活性炭粉填充的柱。用2%氯化钠水溶液洗涤后，再用水洗涤，溶液用乙醇-1.5%氨水（1∶1）洗脱。收集Rf值大约为0.02馏分，减压浓缩至干得70mg化合物No.2的钠盐。

化合物No.2

FAB-MS（m/z）：492（M+H）⁺，514（M+Na）⁺，536（M+2Na-H）⁺，558（M+3Na-2H）⁺;

NMR（200MHz，D₂O）ppm：8.78（1H，s，8-H），8.08（1H，s，2-H），6.44（1H，d，J＝5.5Hz，1′-H），4.83（1H，m），4.25（2H，m），3.80-4.00（3H，m）

（1）化合物2′和3′的合成：

在氮气流下，将86.7μl三乙胺和139.3mg的4，4′-二甲氧基三苯甲基氯加到50mg化合物        1′[奥塔诺新-G（OXT-G）]在1.6ml无水二甲基甲酰胺的溶液中。混合物室温避光搅拌24小时。减压蒸除溶剂，所得糖浆状物经硅胶柱层析（20ml，氯仿-甲醇＝50∶1）分离。通过硅胶薄层层析[展开剂∶氯仿-甲醇（10∶1）]收集Rf值大约为0.51的馏分。减压蒸去溶剂得27.1mg（16.6%）的化合物3′，为无色粉末。进一步收集Rf值大约为0.64的馏分，减压蒸掉溶剂得42.0mg（25.8%）化合物2′。

化合物2′：

MS（FAB）873（M+H）⁺

NMR（CDCl₃，ppm）：7.65（s，1H），7.5-6.6（m，27H），5.32（d，1H），4.60（m，1H），3.70-3.62（4s，12H），3.4-3.2（m，4H），3.01（m，1H）

化合物3′：

MS（FAB）873（M+H）⁺

NMR（CD₃OD，ppm）：8.21（s，1H），7.4-6.6（m，26H），5.49（d，1H），4.29（m，1H），3.76（2s，6H），3.60（2s，6H），3.7-3.0（m，5H）

（2）化合物4′的合成：

化合物2′（1.73g），催化量的N，N-二甲氨基吡啶，331μl三乙胺和196μl醋酐加到30ml无水乙腈中，混合物在室温搅拌40分钟。反应完成后，蒸掉溶剂，加50ml水。混合物用50ml氯仿提取2次。蒸掉氯仿后，所得糖浆状物经柱层析（300ml，氯仿-甲醇＝40∶1）分离纯制得1.51g化合物4′。

TLC（硅胶）：Rf＝0.55（氯仿-甲醇＝10∶1）

NMR（CDCl₃，ppm）：7.67（s，1H），7.5-6.6（m，27H），5.83（d，1H），4.53（m，1H），3.92（m，2H），3.77-3.70（4s，12H），3.35（m，2H），3.23（m，1H），2.06（s，3H）

（3）化合物5′的合成：

在50ml        80%醋酸水溶液中溶解1.51g化合物4′，该溶液在室温搅拌5小时。反应完成后，反应液浓缩至干。残留物用甲醇结晶得0.5g化合物5′。

TLC（硅胶）：Rf＝0.38（正-丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶2）

MS（FAB）：310（M+H）⁺

NMR（DMSO-d₆，ppm）：8.25（s，1H），6.55（bs，1H），6.15（d，1H），5.28（m，1H），4.48（m，1H），4.30（m，2H），3.9-3.1（m，3H），2.03（s，3H）

（4）化合物6′的合成：

在-20℃冷却及氮气氛下，76.8μl的三氯氧磷加到55mg化合物5′在1.53ml磷酸三乙酯的悬浮液中。混合物在0℃搅拌过夜。加5ml饱和碳酸氢钠水溶液后，反应液用5ml氯仿提取2次。加150ml水到水层，混合物通过用50mlDEAE-交联葡聚糖凝胶A-25（碳酸盐型）填充的柱，用50ml水洗，然后用170ml        0.1M三乙胺-碳酸盐缓冲液（pH7.48）洗脱，再用170ml        0.4M三乙胺-碳酸盐缓冲液（pH7.38）洗脱。洗脱的主要产物馏分减压浓缩至干得71.5mg化合物6′。

TLC（硅胶）：Rf＝0.16（2-丙醇∶浓氨∶水＝7∶1∶2）

MS（FAB）：390（M+H）⁺，412（M+Na）⁺

NMR（D₂O，ppm）：8.29（s，1H），6.30（d，1H），4.82（m，1H），4.34（m，2H），4.09（m，2H），3.94（m，1H），2.04（s，3H）

（5）化合物No.5的合成：

71mg化合物6′粗品溶于5ml水后，将4.67ml 0.1N氢氧化钠加到该溶液中。混合物室温搅拌53小时。反应完成后，用0.1N盐酸将反应混合物的pH调至1.5。往其中再加水50ml，使pH调节后的溶液通过用MCI GEL CHP 20 P（80ml）填充的柱。用水洗脱主要产物，减压浓缩至干得44.3mg化合物No.5。

TLC（硅胶）：Rf＝0.13（2-丙醇∶浓氨水∶水＝7∶1∶2）

MS（FAB）：348（M+H）⁺

NMR（D₂O，ppm）：8.89（s，1H），6.41（d，1H），4.84（m，1H），4.10（m，2H），3.87（m，2H），3.70（m，1H）

（6）化合物No.3的合成：

将50mg化合物No.5，1.4ml叔-丁醇和48.9μl        4-吗啉溶于1.4ml水中以后，将118.4mg二环己基碳酰二亚胺在2ml叔-丁醇中的溶液，经30分钟滴加到上述溶液中。反应完成后，蒸掉叔-丁醇，加5ml乙醚提取。水相减压浓缩至干，将186.6mg焦磷酸三丁基铵在3ml二甲基亚砜中的溶液加到残留物中。混合物在37℃搅拌2天。反应完成后，加200ml水，所得混合物通过用10ml活性炭粉填充的柱。用2%氯化钠水溶液洗后再用水洗，用70%甲醇水溶液洗脱。洗脱液减压蒸干后，残留物溶于200ml水并通过用50ml        DEAE-交联葡聚糖凝胶A-25（碳酸盐型）填充的柱。每次用500ml线性梯度（0.1M-0.4M）的三乙胺-碳酸盐缓冲液（pH7.3）洗脱，再用0.4M三乙胺-碳酸盐缓冲液（含0.5M钠盐）洗脱。洗脱的主要产物馏分用1N盐酸调节pH至2.2，然后用1N氢氧化钠调pH到7.0。pH调节后的溶液通过用3ml活性炭填充的柱。该溶液用2%氯化钠水溶液和用水洗后，用70%甲醇水溶液-1.5%氨水洗脱。洗脱液减压浓缩至干得17mg化合物No.3，为钠盐。

MS（FD）：508（M+H）⁺，576（M+3Na）⁺

³¹P-NMR（D₂O，ppm）：-3.28（d，1P），-7.49（d，1P），-18.50（t，1P）

¹H-NMR（D₂O，ppm）：8.33（s，1H），6.29（d，1H），4.82（m，1H），4.27（m，2H），3.87（m，3H）

实例3（化合物No.6的合成）

在-20℃冷却及氮气流下，15.1μl的三氯氧磷加到7.7mg化合物1″在300μl磷酸三乙酯的悬浮液中。混合物在0℃搅拌过夜。用3ml饱和碳酸氢钠水溶液中和后，反应液用5ml氯仿提取二次。水相加入60ml水后混合物通过用12ml        DEAE-交联葡聚糖凝胶（碳酸盐型）填充的柱，随后用水洗，水相用75ml        0.1M三乙胺-碳酸盐缓冲液（pH7.0）洗脱，再用75ml0.4M三乙胺-碳酸盐缓冲液（pH7.3）洗脱。收集洗脱的主要产物部分用1N盐酸调pH至2.0，然后用1N氢氧化钠调pH至7.0。pH调节后的溶液通过用2ml活性碳填装的柱。所得溶液用2%氯化钠水溶液洗，然后用水洗后，用80%甲醇水溶液洗脱。洗脱液浓缩至干得3.0mg化合物No.6的钠盐。

UVmax（nm）        257（0.01N        HCl）

MS（FAB） 302（M+H）⁺，324（M+Na）⁺

NMR（D₂O，ppm）8.92（s，1H），8.18（s，1H），6.67（t，1H），5.02（m，1H）3.94（m，2H），3.4-3.1（m，2H）

在本发明的化合物用作抗病毒剂时，这些化合物可单独给药或与赋形剂或载体混合给药，剂型可为注射剂，口服剂，栓剂等等。药用赋形剂和载体的选择，其种类和组成是由给药途径和给药方法决定的。作为所使用的液体载体，可用如水，醇或动植物油，如豆油，花生油，麻油，矿物油等或合成油类。作为所使用的固体载体，例如糖，如麦芽糖，蔗糖等;氨基酸;纤维素衍生物如羟丙基纤维素，等等;有机酸盐如硬脂酸镁等。关于注射剂，一般选择使用生理盐水，各种缓冲液，糖溶液，如葡萄糖，肌醇，甘露糖醇等的溶液;二元醇如乙二醇，聚乙二醇等。此外，本发明的化合物也可与赋形剂一起冷冻干燥，这些赋形剂有糖类如肌醇，甘露糖醇，葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，蔗糖等，氨基酸如苯丙氨酸等，用药时将冷冻干燥制剂溶于适当的注射用溶剂，例如注射用水，生理盐水，葡萄糖溶液，电解质溶液，静脉内给药的液体如氨基酸等，所制得的溶液可以给药。

在制剂中所含本发明化合物的药量可随剂型的不同而改变，但一般在0.1-100重量%的范围，最好是1-90重量%。例如，注射剂含本发明的化合物一般在0.1-5%重量就足够了。口服用药，本发明的化合物可与前述固体载体或液体载体一起以片剂，胶囊，粉剂，粒剂，液体，干糖浆等形式使用。对于胶囊，片剂，粒剂和粉剂，本发明化合物的含量一般大约为3-100%（重量），最好是5-90%（重量），差额为载体。

使用的剂量决定于病人的年龄，体重或身体状况，治疗目的等，但治疗剂量对非肠道给药一般在1-300mg/kg/天的范围，口服用药范围为5-500mg/kg/天。

本发明的化合物的特征是毒性低，其中任何一个化合物甚至连续给药以后，蓄积性毒性也是很小的。即使本发明的化合物一次剂量给800mg/kg，也未表现出任何毒性的征兆。

下面，列举制剂的实例。

制剂实例1（冷冻干燥注射剂）

将纯水加到重量（以下相同，除非另有说明）为30份的化合物No.1使总重为200份。化合物溶解以后，溶液灭菌并经GS型微孔过滤器过滤。在10ml瓶内装2g滤液，冷冻干燥得含30mg化合物No.1的冷冻干燥注射剂。

制剂实例2（粒剂）

将50份化合物No.5，600份乳糖，330份结晶纤维素和20份羟丙基纤维素充分揉和，混合物用辊型压紧机（辊压榨机）压辗。研磨成粉后，过筛，制成颗粒剂在10目至60目之间。

制剂实例3（片剂）

应用V-形捏和机将30份化合物No.5，120份结晶乳糖，147份结晶纤维素和3份硬脂酸镁捏合后压片，每片重300mg。

下面，本发明的化合物抗-巨细胞病毒的活性和抗HIV的活性以及对乙型肝炎病毒DNA聚合酶的抑制作用参照如下叙述的特定实例来描述。

实验实例2

用以下的方法测定抗巨细胞病毒的活性。含有单层人胎儿纤维细胞的3.5mmφ中培养皿用100PFU（空斑形成单位）的巨细胞病毒（AO169株）感染。吸附1小时后，将含不同浓度的本发明的化合物的介质（0.5%的琼脂糖，2%的胎牛血清）迭加在上面，在37℃的5%（v/v）二氧化碳温箱内培养10天后，测定形成的空斑，结果列于表3，用50%抑制值（ED₅₀）来表示。

表3

化合物号 抗巨细胞病毒活性ED₅₀（μg/ml）

1        1.85

5        0.4

试验实例3

抗-HIV（人免疫缺损病毒）的活性：

将MT-4细胞（大约10，000细胞/ml）加到24池的盘中，然后加100μl含预先测定量的含本发明的化合物No.1的溶液。在37℃5%（v/v）二氧化碳恒温箱培养5小时后，加HIV10³-10⁴个感染单位，然后培养4天。将部分培养液涂在载玻片上，用丙酮固定，用间接荧光抗体法观察病毒抗原的发展。

应用艾滋（AIDS）病人血清作为荧光抗体法的原发抗体，用FITC-标记的人Ig        G为第二抗体。

表4

本发明化合物No.1和No.6的抗人免疫缺损病毒的活性

化合物号 抑制病毒抗原发展的活性ED₅₀（μg/ml）

1        0.1

6        0.007

试验实例4

化合物No.3（OXT-G三磷酸酯）对HBV-内在DNA聚合酶的抑制活性。

测定方法：

1.HBV核心颗粒的部分纯化

将HB611细胞用缓冲液匀浆化以进行下面的提取。离心（14000rpm，0℃，30分钟）的上清液用含缓冲液的30%蔗糖封盖提取，离心（35000rpm，4℃，18小时）得粗核颗粒沉淀。把粗核颗粒悬浮于缓冲液中浸取，用氯化铯密度梯度离心法纯制，得部分纯化的密度为1.30-1.35g/ml的病毒核颗粒。

提取用的缓冲液：

含（0.1%Triton        X-100/0.1%        2-巯基乙醇/1mM        PMSF）：10mM

Tris-盐酸盐（pH7.4），1mM        EDTA，10mM氯化钠

2.测定HBV-内聚合酶的活性

部分纯化的核颗粒加到下面说明的反应液中。在各种浓度的化合物No.3存在下在37℃培养2小时后，往其中加dCTP，最终浓度1mM，再在37℃培养1小时，往其中加蛋白酶K，SDS，EDTA和tRNA最终浓度分别为0.5mg/ml，1%，10mM和200μl，随后在45℃培养2小时。以后，用苯酚-氯仿浸取，乙醇沉淀，再在1.5%琼脂上电泳束纯化HBV-DNA。用自动射线照相测定HBV-DNA摄取的放射性。用光密度计扫描放射自显影图计算化合物No.3对HBV-DNA聚合酶的抑制活性。

反应溶液：含50mM        Tris-盐酸盐（pH7.4），30mM氯化镁，0.2%        2-巯基乙醇，0.5%（Triton        X-100）和370KBq        α-32        P-dCTP和dATP，dGTP和dTTP各200μM。

3.结果

表5

化合物No.3（μM）        抑制率（%）

0        0.0

100        50.7

200        88.8

400        96.8

由此上的结果清楚的看到，本发明的化合物呈现优良的抗病毒活性。特别是化合物No.1和No.6有良好的抗-HIV活性，化合物No.5显示抗DNA病毒的优良活性，如巨细胞病毒，乙型肝炎病毒，疱疹病毒等。

本发明的化合物的三磷酸酯显示对病毒生长有抑制作用。例如化合物No.2对HIV的逆转录酶的抑制作用，化合物No.3对前面说的DNA病毒的DNA聚合酶有抑制作用。

Claims (15)

1、通式Ⅰ代表的奥塔诺新的磷酸酯及其药用盐。

其中R₁代表磷酸酯基，X代表H，OH或-CH₂OH，B代表嘌呤碱基。

2、权利要求奥塔诺新1的磷酸酯或其盐，其中通式（Ⅰ）中的R₁是：

3、权利要求1的奥塔诺新磷酸酯或其盐，其中通式（Ⅰ）中的B是腺嘌呤基或鸟嘌呤基。

4、权利要求1的磷酸酯或其盐，其中X是氢或 。

5、由下式表示的奥塔诺新A和2′-脱羟甲基奥塔诺新A的磷酸酯及其药用盐

其中X代表H或-CH₂OH。

6、由下式表示的OXT-G的磷酸酯

7、包括由通式（Ⅰ）代表的奥塔诺新磷酸酯及其药用盐作为有效成分的抗病毒组合物：

其中R₁代表磷酸酯基，X代表H或-CH₂OH，B代表嘌呤碱基。

8、以权利要求1的磷酸酯为有效成分的抗病毒组合物，其中通式（Ⅰ）中R₁是：

X是H或-CH₂OH，B是腺嘌呤基或鸟嘌呤基。

9、一种抑制病毒生长的方法，其特征是把有效剂量的通式（Ⅰa）代表的奥塔诺新磷酸酯或其药用盐给药于病毒感染的温血动物，

其中X代表H或-CH₂OH，B代表嘌呤碱基。

10、根据权利要求9的方法，其中通式（Ⅰa）的B是腺嘌呤基。

11、根据权利要求9的方法，其中所说的病毒是HIV（人免疫缺损病毒），非甲非乙型肝炎病毒，Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒。

12、根据权利要求9的方法，其中通式（Ⅰa）的B是鸟嘌呤，病毒是DNA病毒。

13、根据权利要求12的方法，其中所说的DNA病毒是Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，乙型肝炎病毒或水痘-带状疱疹病毒。

14、制备由通式（Ⅰa）（其中X代表H，OH，或-CH₂OH，

B代表嘌呤碱基）代表的奥塔诺新单磷酸酯的方法，其特征是将通式（Ⅱ）

[其中X′代表H，-OP₃或CH₂OP₃（其中P₃是羟基的保护基并具有有上述同样定义]代表的奥塔诺新与三氯氧磷反应，该反应在下式代表的低烷磷酸酯存在下进行，然后把被保护的化合物消去保护基，

其中Ra，Rb和Rc每一个单独代表H或低烷基，X为-O-P₃或-CH₂O-P₃。

15、制备由通式（Ⅰb）（其中X代表H，OH或-CH₂OH，

B代表一个嘌呤碱基）代表的奥塔诺新三磷酸酯的方法，其特征是由通式（Ⅰa）代表的奥塔诺新单磷酸酯与碳酰二咪唑和焦磷酸三烷基铵在三烷基胺存在下进行反应，

其中X和B与上述意义相同。