CN104651406A - 一种基因沉默试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因沉默试剂盒及基于该试剂盒的通过沉默基因EGR-1而抑制细胞增殖的方法。所述试剂盒包含由片状MnO2纳米载体、10-23DNAzyme和光敏剂Chlorine6(Ce6)组成的Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系。本发明首次利用细胞内谷胱甘肽激活的Mn2+辅助10-23DNAzyme进行有效的基因沉默，克服了10-23DNAzyme在细胞内缺乏辅助离子的困难。细胞内同时激活的荧光信号和核磁信号可监控该体系进入细胞的效率，并且相互验证。且该方法操作简单，对DNAzyme用于基因治疗领域具有较大的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基因沉默试剂盒及方法。
背景技术
脱氧核酶(DNAzyme)是利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。1982年发现具有生物催化活性、能特异性地自我剪切的RNA分子-Ribozyme后，完全打破了酶的化学本质是蛋白质的传统观点,同时也给mRNA水平反义基因干预治疗带来了新的活力,开创了从反mRNA策略出发进行基因治疗的新思路。DNAzyme和一般的生物酶一样，都包含有结合部位和催化部位。DNAzyme具有(1)RNA切割作用；(2)DNA切割作用；(3)金属螯合作用；(4)过氧化物酶活性；(5)DNA激酶活性(6)DNA连接酶活性等多种催化功能，而且还对靶RNA能产生序列特异性切割效应,从mRNA水平对基因灭活,从而调控蛋白的表达,因此成为了对抗RNA病毒感染、肿瘤等疾病的新型工具。DNAzyme具有很多优点:(1)作为DNA分子相较于Ribozyme更稳定，不易被破坏；(2)分子量相对较小，易于人工合成和修饰，而且成本较低；(3)其与底物配对的精确度高，除了催化部位，其他碱基序列可根据底物碱基序列进行改变，在RNA切割效率方面高于Ribozyme(Stephen W.Santoro,Gerald F.Joyce.A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme[J].Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,1997,94(9):4262-4266.)；(4)DNAzyme具有与一般药物相似的动力学特点，对靶RNA水平的抑制程度及抑制时间容易控制。对于脱氧核酶的研究有望成为基因功能研究、核酸突变分析、治疗肿瘤、对抗病毒及肿瘤等疾病的新型基因治疗药物的新型核酸工具酶。
10-23DNAzyme是Santoro等从1014个随机序列中通过体外PCR筛选法得到的第10轮循环的第23个克隆，因此而得名。该酶活性中心由15个脱氧核糖核苷酸序列组成，为“10-23基序(motif)”—5’-GGCTAGCTACAACGA-3’(Wu,Y,Yu,L,McMahon,R etal.Inhibition of bcr-abl oncogene expression by novel deoxyribozymes(DNAzymes).[J].Humangene therapy,1999,10(17):2847-2857.)，而且第八个碱基可以为T、C或A，当为T时活性最高，而其他序列高度保守。活性中心两端为底物结合区，其长度一般为7～9nt，与靶RNA通过Watson-Crick碱基配对进行特异性结合(Santoro SW；Joyce GF.Mechanism and utility ofan RNA-cleaving DNA enzyme[J].Biochemistry,1998,37:13330-13342)。
在众多影响DNAzyme是因素中，二价金属阳离子对于DNAzyme的影响较大，因为二价金属阳离子在DNAzyme的反应形成过渡态的过程中，能起到稳定作用，有助于其折叠成活性结构。而根据研究表明，其影响能力大小为：Mn2+(EPPS)>Pb2+、Mg2+、Ca2+>Cd2+(Tris)>Sr2+、Ba2+>>Zn2+、Co2+(Flynn-Charlebois A,Wang Y,Prior T K,et al.Deoxyribozymes with 2'-5'RNA ligase activity[J].Journal of the American Chemical Society,2003,125(9):2444-2454.)。
但是DNAzyme作为基因沉默的工具用于治疗的报道却很少，主要原因是在细胞内二价金属离子的含量比较低，即使是含量相对较高的Mg2+也远不能满足10-23DNAzyme催化切割RNA的要求。
纳米基因载体简称纳米载体，是以纳米颗粒为载体，将目的基因包含于颗粒内部或吸附在颗粒表面，由于纳米颗粒的小尺寸效应、比表面效应、界面效应等性质，能将目的基因转移到靶细胞内部，释放目的基因，从而达到基因治疗的最终目的(Suzuki R,Yamada Y,Harashima H.Development of small,homogeneous pDNA paRT-icles condensedwith mono-cationic detergents and encapsulated in a multifunctional envelope-type nanodevice[J].Biological&pharmaceutical bulletin,2008,31(6):1237-1243.)。纳米颗粒形成后，通过三种途径进入细胞内：胞饮作用、吞噬作用或内吞作用。
片状纳米载体MnO2是具有2D结构的纳米材料，具有对光的捕获和对电子的传导能力(基于荧光共振能量转移和光诱导电子转移的机理)，成为极具前景的生化传感的纳米平台(Liu Y,Dong X,Chen P.Biological and chemical sensors based on graphene materials[J].Chemical Society Reviews,2012,41(6):2283-2307.)。而且相对于其他的2D纳米片状结构由于它更易合成和廉价因此引起了很多研究者的兴趣。
发明内容
本发明针对10-23DNAzyme在用于基因沉默时缺乏辅助因子这一技术问题提供一种基因沉默试剂盒，及基于该试剂盒进行有效基因沉默的方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述基因沉默试剂盒中包含由片状MnO2纳米载体、10-23DNAzyme和光敏剂Ce6组成的Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系；所述片状MnO2纳米载体厚度为1—2nm，直径为50—500nm，带负电且表现为弱核磁信号；所述10-23DNAzyme末端被氨基修饰后与光敏剂Ce6共价交联成Ce6-DNAzyme，10-23DNAzyme是一段具有催化功能的单链DNA片段，序列为CCG CGG CCA GGC TAG CTA CAA CGA CCT GGA CGA(SEQ ID NO.1)，具有高效的催化活性和结构识别能力，可以与基因EGR-1杂交结合，并在辅助离子Mg2+或Mn2+的辅助下定点切割其RNA，且Ce6具有荧光性质；所述试剂盒中还包括由片状MnO2纳米载体和对照DNA(control DNA)通过物理吸附方式连接成的对照DNA-MnO2纳米体系(controlDNA-MnO2纳米体系)，对照DNA链(control DNA)，序列为CCG CGG CCA GGC TAC CTACAA CGA CCT GGA CGA(SEQ ID NO.2)，相对于DNAzyme在催化区域有一个碱基突变，其可以与基因EGR-1杂交结合，但不能辅助离子Mg2+或Mn2+的辅助下定点切割其RNA。所述MnO2纳米载体通过物理吸附的方式与Ce6-DNAzyme或者对照DNA连接形成纳米体系。
上述试剂盒的制备方法包括如下步骤；
(1)将光敏剂Ce6活化，并与末端氨基修饰的DNAzyme共价交联成Ce6-DNAzyme；
(2)在HEPES缓冲液中将MnO2纳米载体与Ce6-DNAzyme吸附，形成Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系。所述HEPES缓冲液包括以下成分：20mM HEPES，150mMNaCl，2mM MgCl2，pH为7.2。
本发明还提供了一种通过沉默基因EGR-1而抑制细胞增殖的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将本发明所述基因沉默试剂盒中的Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系与MCF-7乳腺癌细胞孵育，使Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系通过内吞作用进入MCF-7乳腺癌细胞；
(2)通过荧光信号和核磁信号考察Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系进入MCF-7乳腺癌细胞的效率；
(3)通过RT-PCR，蛋白印迹和免疫荧光方法利用荧光信号和核磁信号在基因水平和蛋白水平记录基因沉默效果，并以control DNA-MnO2纳米体系作对比；通过检测MCF-7乳腺癌细胞相对数量的方法在细胞水平检测基因沉默的效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
见图1，本发明利用MnO2作为纳米载体，通过细胞内吞作用增强了DNAzyme进入细胞的效率，且进入细胞后，MnO2可以被细胞内的谷胱甘肽还原，完全释放DNAzyme，MnO2被还原后产生的Mn2+既可以用来核磁成像，又可以作为DNAzyme的辅助因子辅助其有效的进行基因沉默。
总之，本发明首次利用细胞内谷胱甘肽激活的Mn2+辅助10-23DNAzyme进行有效的基因沉默，克服了10-23DNAzyme在细胞内缺乏辅助离子的困难。细胞内同时激活的荧光信号和核磁信号可监控该体系进入细胞的效率，并且相互验证。且该方法操作简单，对DNAzyme用于基因治疗领域具有较大的意义。
附图说明
图1Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系基因沉默示意图；
图2片状MnO2纳米载体的特性分析。(a)片状MnO2纳米载体的紫外吸收光谱；(b)MnO2的透射电镜图；(c)MnO2的原子力显微镜图；
图3共聚焦成像检测Ce6-DNAzyme与Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系进入细胞的效率；
图4(a)核磁成像，MCF-7细胞与不同浓度的DNAzyme-MnO2纳米体系孵育后，对细胞进行核磁成像；(b)ICP-OES,MCF-7细胞与不同浓度的DNAzyme-MnO2纳米体系孵育后，细胞内Mn2+的浓度；
图5(a)RT-PCR检测基因沉默后EGR-1基因的表达量；(b)Western blot检测基因沉默后EGR-1蛋白的表达效果；(c)免疫荧光方法检测基因沉默后EGR-1蛋白的表达效果；
图6(a)通过检测细胞数量检测不同浓度DNAzyme的基因沉默效果；(b)软琼脂实验，EGR-1沉默后细胞增殖数量考察；(b)软琼脂实验，EGR-1沉默后细胞增殖体积考察。
具体实施方式
实施例1 片状MnO2纳米载体的合成
MnO2的合成参考了相关文献(Deng,R.；Xie,X.；Vendrell,M.；Chang,Y.-T.；Liu,X.,Intracellular glutathione detection using MnO2-nanosheet-modified upconversionnanopaRT-icles.Journal of the American Chemical Society 2011,133(50),20168-20171.)，首先准备10mL 0.3M MnCl2·4H2O溶液以及20mL 0.6M TMA·OH和3wt％H2O2混合液。快速将两种溶液混合，混合液立即变成暗黑色。将混合液在室温下剧烈搅拌，过夜。得的沉淀用水和甲醇洗涤，在2000r/min的转速下离心20min，在60℃真空干燥。然后将获得的MnO2分散在20mL水溶液中，超声，然后离心将未剥离下的MnO2去除。片状MnO2纳米载体特性分析见图2。
实施例2 Ce6-DNAzyme的合成
二氢卟吩e6共轭脱氧核酸的合成由两部分组成：DNAzyme在DNA合成仪上的合成和DNA合成后与Ce6的反应。下面是具体反应步骤：在ABI3400DNA合成仪上合成DNA。在合成后，将DNA干燥后，进行脱三苯甲基处理：先溶解，然后放在200μL 80％的乙酸中20min，离心弃去上清液。在CPG上的DNA用DPBS清洗3次，最后溶解在250μL的0.1M的pH为7.5的NaHCO3溶液中。
每个Ce6分子上都连有3个羧基，这可以与合成DNA上的氨基缀合。10μM Ce6与等量的DCC和NHS混合，然后溶解在DMF中搅拌进行活化反应。然后将DNA和活化后的Ce6混合并剧烈摇晃过夜使其偶联。将与Ce6共轭并连有CPG的DNA用乙醇和水洗涤数次，在65℃水浴中用AMA(氢氧化铵，甲胺50:50)去保护将CPG裂解。将被切割的DNA产物混合0.3M NaCl和乙醇转移到15mL离心管中，将样品放进-20℃冰箱内沉淀。去除上清液后，将沉淀产物溶解在三乙胺醋酸盐(TEA格伦研究公司)中，进行HPLC的C18柱纯化。将收集到的产物用真空干燥仪进行干燥，并通过紫外吸收仪测量其在260nm处的吸收峰，将Ce6-DNAzyme的化合物溶解于灭菌水中放置在-20℃进行保存。
实施例3 Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系的组装
将Ce6-DNAzyme与所制备的MnO2在HEPES缓冲液(20mM,pH为7.2，包含150mMNaCl和2mM MgCl2)内将其混匀，然后放置10min左右，即自组装为所要的样品。
实施例4 Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系进入细胞的效率
a)荧光检测 提前将MCF-7细胞培接种在光学培养皿中，每个皿中接种30万个细胞，孵育24h，然后吸去原有的培养基，加入样品(Ce6-DNAzyme和Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系)。在含有5％FBS的培养基中孵育4h后，将样品吸走，并用D-PBS清洗3次，用荧光共聚焦成像仪检测其荧光信号。结果见图3。
b)核磁检测 提前将MCF-7细胞培接种在10cm皿中，待细胞数量占皿底的80％时，吸去原有的培养基，加入Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系，在含有5％FBS的培养基中孵育4h后，将样品吸走，并用D-PBS清洗3次，将细胞用EDTA消化下来，分散在200μL的离心管中，用核磁成像仪检测核磁信号。结果见图4。
实施例5 Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系基因沉默
a)基因水平和蛋白水平 提前将MCF-7细胞培养在6孔板中，每个孔加30万个细胞，孵育24h，吸去原有的培养基，在细胞内加入样品Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系和control DNA-MnO2纳米体系，孵育4小时后，将样品吸走，加入新鲜培养基，孵育48小时，之后细胞分别用于RT-PCR和Western blot以及免疫荧光。结果见图5。
b)细胞水平提前将MCF-7细胞培养在96孔板中，每个孔加4千个细胞，孵育24h，吸去原有的培养基，在细胞内加入样品，孵育4小时后，将样品吸走，加入新鲜培养基，孵育48小时，检测细胞相对数量。结果见图6。
本发明所用的DNA序列：
a)DNAzyme:CCG CGG CCA GGC TAG CTA CAA CGA CCT GGA CGA(SEQ IDNO.1)；
b)control DNA:CCG CGG CCA GGC TAC CTA CAA CGA CCT GGA CGA(SEQ IDNO.2)。
Claims (5)
1.一种基因沉默试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含由片状MnO2纳米载体、10-23DNAzyme和光敏剂Ce6组成的Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系；所述片状MnO2纳米载体厚度为1—2nm，直径为50—500nm，带负电且表现为弱核磁信号；所述10-23DNAzyme末端被氨基修饰后与光敏剂Ce6共价交联成Ce6-DNAzyme；所述MnO2纳米载体通过物理吸附的方式与Ce6-DNAzyme连接成Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括由片状MnO2纳米载体和对照DNA通过物理吸附方式连接成的对照DNA-MnO2纳米体系。
3.如权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤；
(1)将光敏剂Ce6活化，并与末端氨基修饰的DNAzyme共价交联成Ce6-DNAzyme；
(2)在HEPES缓冲液中将MnO2纳米载体与Ce6-DNAzyme吸附，形成Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述HEPES缓冲液包括以下成分：20mM HEPES，150mM NaCl，2mM MgCl2，pH为7.2。
5.一种通过沉默基因EGR-1而抑制细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将权利要求1或2所述试剂盒中的Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系与MCF-7乳腺癌细胞孵育，使Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系通过内吞作用进入MCF-7乳腺癌细胞；
(2)通过荧光信号和核磁信号考察Ce6-DNAzyme-MnO2纳米体系进入MCF-7乳腺癌细胞的效率；
(3)通过RT-PCR，蛋白印迹和免疫荧光方法在基因水平和蛋白水平记录基因沉默效果；通过检测MCF-7乳腺癌细胞相对数量的方法在细胞水平检测基因沉默的效果。
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