CN104651368B - 一种核酸适配体bc15的核心序列及其类似物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核酸适配体BC15的核心序列，BC15的核心序列为BC15‑31和BC15‑27，其核苷酸序列分别为SEQ No.1和SEQ No.2。本发明中核酸适配体BC15的核心序列BC15‑31的类似物，即在BC15‑31序列5’端的3位、15位、22位、24位、26位、28位或30位，其中一位或者多位上掺入异核苷化合物以代替天然核苷化合物在相应位置进行偶联。本发明适配体BC15的核心序列BC15‑31和BC15‑27及其BC15‑31的类似物能够识别肝癌组织切片，与靶蛋白有更强的亲和能力，以及对肿瘤细胞生长增殖的抑制能力，使得本发明在肿瘤的诊断和治疗领域具有广泛的应用价值和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸适配体BC15的核心序列及其类似物和应用，具体涉及一种特异性识别肿瘤组织切片的核酸适配体BC15核心序列及其类似物，属于生物医药领域。
背景技术
目前，肿瘤已经成为威胁人类健康的头号疾病，肿瘤的诊断和治疗一直是人们致力于研究的方向。由于在临床应用上，肿瘤标志物普遍特异性差，绝大多数不仅存在于恶性肿瘤中，也存在于良性肿瘤、胚胎组织、甚至正常组织中，因此获得高度特异性的肿瘤生物标志物则是研究的重点和难点之一。
SELEX筛选技术的出现为肿瘤标志物的寻找带来新的思路。通过体外SELEX筛选而得到的单链寡核苷酸片段能形成灵活多变的空间三维结构，理论上可以同各种靶分子结合。与蛋白质类抗体相比，核酸适配体具有更多的优势，如不受免疫条件限制、无免疫原性、识别能力精确、分子小易渗透、可体外人工合成修饰、变性与复性可逆、有利于长期保存和室温运输等，为其在肿瘤疾病的诊断和治疗领域发展提供了良好的基础。
适配体BC15是一条通过临床肿瘤组织切片采用SELEX技术筛选得到的DNA寡核苷酸。经鉴定，BC15能识别多种癌症组织切片，包括乳腺癌、肝癌、肺癌等等，而与癌旁组织无结合。实验证明BC15识别的靶蛋白是hnRNP A1，对于hnRNP A1，目前已有报道证实可在多种肿瘤组织，如肝癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤中高表达，有望成为新的肿瘤标志物。而且hnRNP A1通过参与RNA转录前和转录后水平的调节，促进端粒延长、抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡增殖，是潜在的抗癌作用靶点。因此BC15在临床肿瘤的诊断和治疗方面上具有广阔的应用前景，适用于临床肿瘤的辅助诊断和筛查。但由于天然寡核酸的缺陷性，目前利用SELEX技术筛选到的核酸适配体，无论是用于临床诊断还是疾病治疗，要对它们进行改造才能应用。通常改造的第一步多是尽量减少有效碱基数量，在尽可能保留其生物功能的同时缩短配基长度。这样既可以降低合成寡核苷酸配基的成本，同时也提高合成的质量，更重要的是利于化学修饰。由文献调研的结果发现：BC15的靶标蛋白hnRNP A1能够与具有G4结构的端粒DNA结合。而从随机文库中筛选出来的长度为74nt的BC15配基的中间有一段富含G的序列，推测此段为BC15识别靶蛋白的关键位点。
由于体内代谢和性质多变不可控，体内半衰期短，易渗漏，核酶降解等问题使得天然的核酸适配体在临床应用中受到很大的局限。因此，本发明在确定BC15核心序列的基础上，采用异核苷作为化学修饰策略，通过被修饰部位局部构象的改变，来改变核酸适配体与靶标的空间位置，提高其亲和能力，进而提高生物活性。这样进行结构优化后的核酸适配体作为分子探针能够直接应用于临床肿瘤检测和治疗，具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明的目是一种核酸适配体BC15的核心序列及其类似物和应用，具体涉及一种特异性识别肿瘤组织切片的核酸适配体BC15核心序列及其类似物。
通过对BC15进行一系列不同长度截短序列和碱基相似的端粒序列的考察和比较，确定BC15-31和BC15-27序列是BC15的核心序列，BC15-31和BC15-27序列的核苷酸序列分别为SEQ No.1和SEQ No.2。
本发明利用异核苷对BC15的核心序列BC15-31进行化学修饰，在BC15-31序列5’端的3位、15位、22位、24位、26位、28位或30位，其中一位或者多位上掺入化学式I或化学式Ⅱ所示的异核苷化合物以代替天然核苷化合物在相应位置进行偶联。
相比于天然核苷化合物，碱基由糖环的1’-位移至糖环的2’-位，化学式I所示的异核苷为L-构型的异核苷，化学式Ⅱ所示的异核苷为D-构型的异核苷。
利用异核苷对BC15的核心序列BC15-31化学修饰的结构：
BC15-31-3L：在BC15-31在BC15-31序列5’端的3位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷；
BC15-31-3D：在BC15-31在BC15-31序列5’端1的3位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷；
BC15-31-15L：在BC15-31序列5’端的15位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷；
BC15-31-15D：在BC15-31序列5’端的15位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷；
BC15-31-22L：在BC15-31序列5’端的22位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷；
BC15-31-22D：在BC15-31序列5’端的22位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷；
BC15-31-24L：在BC15-31序列5’端的24位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷；
BC15-31-24D：在BC15-31序列5’端的24位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷；
BC15-31-26L：在BC15-31序列5’端的26位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷；
BC15-31-26D：在BC15-31序列5’端的26位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷；
BC15-31-28L：在BC15-31序列5’端的28位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷；
BC15-31-28D：在BC15-31序列5’端的28位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷；
BC15-31-30L：在BC15-31序列5’端的30位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷；
BC15-31-30D：在BC15-31序列5’端的30位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷。
研究证明，本发明可应用于制备肿瘤组织的诊断或治疗药物中。
本发明的优点在于：
1、本发明提供的异核苷修饰的适配体，具有理化性质稳定、合成效率高等特点，并且具有比天然核酸适配体更好的生物活性；
2、通过全面考察D-/L-型异核苷在不同位点掺入适配体中，改善适配体的血清稳定性及其与靶标蛋白的亲和能力，为适配体作为临床诊断试剂的应用提供一种有用的化学修饰策略；
3、本发明提供的适配体BC15的核心序列BC15-31和BC15-27及其BC15-31的类似物能够识别肝癌组织切片，与靶蛋白有更强的亲和能力，以及对肿瘤细胞生长增殖的抑制能力，使得本发明在肿瘤的诊断和治疗领域具有广泛的应用价值和市场前景。
附图说明
图1为BC15的核心序列BC15-31、BC15-27特异性识别肝癌组织切片结果图；
图2为BC15的核心序列BC15-31、BC15-27对肿瘤细胞增殖活性影响的结果图；
图3为BC15的核心序列BC15-31、BC15-27的CD光谱结果和Tm值测定结果图；
图4为异核苷修饰的BC15的核心序列BC15-31血清稳定性结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1异核苷掺入的BC15-31固相合成
DNA的合成采用Appllied Biosystems model394DNA固相合成仪。
正常的脱氧核苷亚磷酰化单体(dT,dGAc,dABz,dCAc)从上海吉玛制药技术有限公司购买；CPG(CPG-dG)，CAP-A和CAP-B，氧化I2液，Cl3CCOOH从北京奥科生物科技公司购买；0.25M的5-乙巯基1H-四氮唑溶液从上海智研科技有限公司（上海）购买。
按照文献(HW Yu,LR Zhang,JC Zhuo,LT Ma,LH Zhang,Bioorg.Med.Chem.,1996,40,609-614)的方法，将化学式I所示的异胸苷化合物分别制备成化学式Ⅲ所示的异胸苷亚磷酰胺单体。即：将单体化合物I真空干燥，加3.5倍当量的四氮唑，真空干燥过夜，加入5ml无水吡啶，冰浴条件下，加入3.5当量的的亚磷试剂，反应完成后蒸干溶剂，于无水无氧条件下采用硅胶柱分离，最终得到白色固体Ⅲ。
合成规模：～1.0μmol
核苷亚磷酰化单体溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成0.12M溶液；
1H-四氮唑溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成0.5M1H-四氮唑溶液；
异核苷亚磷酰化单体溶液的配制：氩气保护下取0.231mmol的{5S-[3-O-(4,4’-二甲氧基三苯基甲基)-甲基]-4R-O-[(2-氰乙基-N,N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(胸腺嘧啶基-1-yl)}-四氢呋喃（化学式Ⅲ所示的异胸苷化合物），加入2.5ml的无水乙腈，配成0.092M溶液；氩气保护下取0.244mmol的{5R-[3-O-(4,4’-二甲氧基三苯基甲基)-甲基]-4S-O-[(2-氰乙基-N,N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3R-(胸腺嘧啶基-1-yl)}-四氢呋喃（化学式IV所示的异胸苷化合物），加入2.5ml的无水乙腈，配成0.098M溶液；
采用固相合成的方法合成了BC15-31的未修饰的序列及异胸苷掺入的BC15-31序列；BC15的核心序列BC15-31的序列为SEQ No.1。
在BC15-31序列5’端的3位、15位、22位、24位、26位、28位或30位，其中一位或者多位上掺入化学式I或化学式Ⅱ所示的异胸苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联。
以上所述3位是指BC15-31正链序列中5’端开始第三个核苷酸，即“T”。其余位置以此类推。
合成步骤：每次称量约33mg CPG-dC装入合成柱中，按照ABi394核酸合成仪的标准步骤，每次合成共84步。正常核苷单体偶联3次，每次180秒，异胸苷单体偶联3次，每次300秒，共计偶联时间15分钟。
DNA的切割、脱保护：合成结束后，取下CPG，加入浓氨水/甲胺水溶液，恒温60℃，摇床振荡反应60分钟，将寡核苷酸从CPG上切割下来并脱除部分保护基，离心干燥。然后加入适量纯净水溶解，于1万4千转/分钟的离心机上离心10分钟，将上清取出，离心干燥，将产物放置-80℃下保存。
DNA的分离纯化：混合物以纯水溶解，HPLC(Sephedax G-25，50%乙腈的水溶液)脱盐，离心干燥。而后HPLC方式纯化，采用如下条件：Dionex-DNA Pac-PA200阴离子交换柱梯度洗脱，0-40min，10%-30%A液(B液：0.02M tris-HClO4缓冲液，pH为8.0，含有10%（指体积分数）MeCN；A液：0.4M NaClO4in B液)，流速1.2ml/min。冷冻干燥所得产物，DEPC水复溶，HPLC(Sephedax G-25)脱盐，冷冻干燥，得到目标单链DNA，-80℃保存。
实施例2BC15及BC15-31、BC15-27片段与肝癌组织切片的结合能力
合成序列BC15及BC15-31、BC15-27，且在5’端标记FAM，由上海生工公司合成
1组织切片的处理
石蜡组织切片进行筛选及结合鉴定之前先进行常规脱腊。肝癌组织（肝癌组织来源于福州军区总医院）切片置于二甲苯中浸泡20min；更换二甲苯后再浸泡20min；依次在无水乙醇、体积分数为95%乙醇、体积分数为90%乙醇、体积分数为80%乙醇、体积分数为70%乙醇中各浸泡5min；入蒸馏水2次，每次2min；用0.01M磷酸盐缓冲液洗两次，各5min。
抗原微波热修复：将切片放入盛有0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液的容器中，微波炉加热，使容器内液体温度保持在92℃～95℃并持续约20min，取出容器，冷却至室温。
2核酸适配体（Aptamer）与肝组织切片结合实验
（1）经抗原修复后的石蜡组织切片用浓度为0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次3min；
（2）PBS-0.3%Tween20室温透化15min；
（3）用体积约为100μl PBS-1%BSA-0.1μg/μl ytRNA-1μg/μl鲑鱼精DNA缓冲液，在室温下封闭15min；
（4）将约100pmol FAM标记的Aptamer，孵育体积约为50μl～100μl，湿盒中37℃避光孵育1h～2h；
（5）弃液体，滴加0.25%伊文氏蓝溶液室温染色10min；
（6）浓度为0.01M磷酸盐缓冲液洗涤4次，每次5min；
（7）擦干组织周边水渍，用抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察。
3实验结果
试验结果如图1所示，BC15-31和BC15-27与BC15一样，能够特异的结合靶组织切片即肝癌石蜡组织切片中具有明显异形核变化的癌细胞，染色部位主要在胞核，而与正常肝组织切片上无结合或仅有微弱的结合。而其他无关序列如AC不能结合癌组织切片，另外，不同长度的内源性端粒序列TRn也不能与组织切片结合。
实施例3SPR测定BC15及其核心序列BC15-31、BC15-27与靶蛋白结合力
1SA芯片制备
将CM5芯片插入BIAcore SPR分析仪并放置于微射流卡盘上，以10mM PBS为流动工作液，控制温度为25℃，流速为5μl/min使基线稳定。将活化剂以5μl/min的流速流过芯片表面,使表面的羧基活化。将链霉素固定在芯片表面，以盐酸乙醇胺封闭未反应的活化羧基。至此，SA芯片改造完成。
2固定hnRNP A1蛋白
以通道1为空白对照通道,将生物素标记的序列BC15、BC15-31、BC15-27、NC、TR2和TR4，通过生物素-链霉素结合作用固定在其余几个通道，平衡2-4h，其中，BC15的核苷酸序列为SEQ No.3，NC的核苷酸序列为SEQ No.4，TR2的核苷酸序列为SEQ No.5，TR4的核苷酸序列为SEQ No.6。
3Aptamer与hnRNP A1的相互作用
各个适配体分别以5-1000nM浓度的hnRNP A1蛋白持续流过芯片3min，解离时间为5min。每个样品检测完后，以3M氯化钠溶液作为再生溶液，依次检测。
4数据处理
所有实验数据采用BIAcore3000的Bia evaluation分析软件进行处理分析。
5实验结果
实验显示，BC15-31和BC15-27与hnRNP A1蛋白的亲和力强于BC15的亲和力，见表1：
表1序列BC15、BC15-31、BC15-27与靶蛋白hnRNP A1蛋白结合能力
实施例4BC15核心序列基本性质研究
1Tm值测定
用10mM PBS溶解核酸适配体样品，所有样品在95℃变性5min后，缓慢降至室温，待测。采用紫外分光光度计测定样品的紫外吸收，波长范围为200-400nm，吸收波长为295nm，升温（25℃至90℃，升温速度为0.5℃/min），记录紫外吸收随温度变化曲线，采用一阶微分法计算Tm值，BC15-31和BC15-27的Tm值分别为34.8和33.2。
2CD光谱分析
用10mM PBS溶解测试样品，所有样品在95℃变性5min后，缓慢降至室温，待测。CD扫描范围从200-400nm，温度恒定为25℃，扫描间隔0.2nm，扫描速度100nm/min，每个样品重复3次扫描，采用仪器自带软件进行平滑处理，实验结构如图3所示。
实施例5肿瘤细胞增殖抑制
以HepG2和A549（HepG2和A549来源于北京协和细胞资源中心）2种肿瘤细胞为例来确证BC15全长及其核心序列BC15-31、BC15-27抑制肿瘤细胞增殖的活性。同时考察靶标蛋白作为潜在肿瘤标志物的可靠性。将肿瘤细胞体外培养消化后，按每孔2000-4000的细胞密度铺于96孔板中，培养24小时后给药，在培养期间（96小时），检测不同时间的细胞毒性。采用MTS方法进行检测，检测波长为490nm，参比波长为650nm。结果如图2所示，BC15及其核心序列BC15-31、BC15-27对肿瘤细胞的活力有一定的抑制作用。其中，BC15及其核心序列BC15-31、BC15-27对A549的抑制活性更为明显(p<0.05)，对HepG2有一定的抑制效果。
实施例6血清稳定性考察
分别考察不同Aptamer在体积浓度为10%的FBS血清中的稳定性。取异核苷修饰的BC15的核心序列BC15-31，6400ng左右加入到80μl胎牛血清中，在37℃下进行孵育，于不同时间点取出10μl样品，再经过95℃水浴加热10分钟，在冰上骤冷后，用20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，核酸染料进行染色15min，最后用化学发光凝胶成像系统对电泳结果进行成像分析，异核苷修饰的BC15的核心序列BC15-31血清稳定性结果图如图4所示。
实施例7SPR测定单位点异核苷修饰的序列BC15-31的类似物与靶蛋白hnRNP A1的结合能力
测试序列分别为BC15-31、BC15-31-3L（在BC15-31序列5’端的3位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷）、BC15-31-3D（在BC15-31序列5’端的3位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷）、BC15-31-15L（在BC15-31序列5’端的15位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷）、BC15-31-15D（在BC15-31序列5’端的15位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷）、BC15-31-22L（在BC15-31序列5’端的22位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷）、BC15-31-22D（在BC15-31序列5’端的22位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷）、BC15-31-24L（在BC15-31序列5’端的24位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷）、BC15-31-24D（在BC15-31序列5’端的24位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷）、BC15-31-26L（在BC15-31序列5’端的26位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷）、BC15-31-26D（在BC15-31序列5’端的26位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷）、BC15-31-28L（在BC15-31序列5’端的28位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷）、BC15-31-28D（在BC15-31序列5’端的28位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷）、BC15-31-30L（在BC15-31序列5’端的30位上掺入化学式Ⅰ所示的异胸苷）、BC15-31-30D（在BC15-31序列5’端的30位上掺入化学式Ⅱ所示的异胸苷）。
1将hnRNPA1蛋白固定在CM5芯片。
将hnRNPA1蛋白分别用pH为6.8的醋酸钠溶液配成一系列浓度的溶液。具体操作如下：PBS缓冲液为流动工作液。将活化剂EDC和NHS混合液活化芯片表面的羧基。用pH7.4的磷酸盐缓冲液溶解蛋白配制不同浓度的蛋白溶液，注入芯片表面,找到该蛋白偶连到芯片表面最合适的浓度（蛋白溶液的最佳浓度为1uM）。之后用封闭剂封闭未反应的活化羧基，平衡。以通道1为空白对照通道，通道2作为实验组进行下一步研究。
2BC15-31及其异核苷类似物与hnRNPA1的相互作用。
选择用pH7.4的磷酸盐缓冲液配成的浓度梯度为50nM-10uM的核酸溶液，以30μL/min的流速流过芯片表面，实时记录其与hnRNP A1的结合情况。反应结束后，用浓度为5-50nM的NaOH作为再生液，根据传感图的RU值变化,评价其洗脱效果,从中选择合适的再生溶液,用于芯片的重复使用。
3进行动力学实验，将测得的数据用Scatchard曲线计算BC15-31及其异核苷类似物与hnRNPA1相互作用的平衡解离常数(Kd)值。实验结果见表2：
表2BC15-31及其单位点异核苷类似物与靶蛋白hnRNP A1蛋白的结合能力
Claims (4)
1.一种核酸适配体BC15的核心序列，其特征在于，BC15的核心序列为BC15-31和BC15-27，其核苷酸序列分别为SEQ No.1和SEQ No.2。
2.一种核酸适配体BC15的核心序列BC15-31的类似物，其特征在于，在BC15-31序列5’端的3位、15位、22位、24位、26位、28位或30位，其中一位或者多位上掺入化学式I或化学式Ⅱ所示的异核苷化合物以代替天然核苷化合物在相应位置进行偶联，所述的BC15-31的核苷酸序列为SEQ No.1；
。
3.权利要求1所述的核酸适配体BC15的核心序列在制备诊断或治疗肿瘤药物中的应用。
4.权利要求2所述的核酸适配体BC15的核心序列BC15-31的类似物在制备诊断或治疗肿瘤药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |